用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，該試劑盒包括標(biāo)記物，該標(biāo)記物為在人醌式二氫蝶呤還原酶基因rs3733570SNP位點(diǎn)的基因型，該基因型的存在標(biāo)志患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，該試劑盒不但保證了一定的準(zhǔn)確性及靈敏度，同時(shí)具有檢測(cè)周期短，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一種糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝障礙的慢性綜合征，繼發(fā)于胰島素分泌不足，或靶組織產(chǎn)生抗胰島素性；有兩種主要型:胰島素依賴性糖尿病(I型)和非胰島素依賴性糖尿病(2型)。
[0003]2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)的發(fā)病受到環(huán)境和基因雙重因素的影響。遺傳因素能增加機(jī)體發(fā)生2型糖尿病的危險(xiǎn)性。目前T2DM的發(fā)病率在所有種族和年齡段均逐漸上升。雖然進(jìn)行了大量的基因組關(guān)聯(lián)分析，但是大部分T2DM相關(guān)基因仍然未知。
[0004]2型糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是T2DM的一個(gè)常見并發(fā)癥,其發(fā)展也受到環(huán)境和基因雙重因素的影響；DN能導(dǎo)致T2DM患者終末期腎病；是成人慢性腎功能衰竭病首要原因；也是糖尿病患者發(fā)病和致死的主要原因。所以當(dāng)務(wù)之急是研究DN的易感基因，以此來預(yù)測(cè)2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及開展針對(duì)此基因的藥物治療；目前一些基因組掃描(genome-wide scans，GWS)和相關(guān)性研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因與DN密切相關(guān)，但是DN發(fā)生的所有易感基因并未 完全明確。因此為了研究2型糖尿病腎病及其發(fā)病機(jī)制，預(yù)測(cè)2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，需要生物學(xué)家及醫(yī)學(xué)家更多的發(fā)現(xiàn)2型糖尿病腎病的相關(guān)基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，通過檢測(cè)rs3733570SNP( single nucleotide polymorphism)位點(diǎn)的基因型提供一種預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。
[0006]本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明提供一種用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，該試劑盒包括標(biāo)記物，該標(biāo)記物為在人醌式二氫蝶呤還原酶基因上存在的rs3733570SNP位點(diǎn)的基因型，該基因型可以用來預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]rs3733570 的相關(guān)信息可從 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=3733570中找到依據(jù)。
[0009]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述rs3733570的T等位基因的存在標(biāo)志著患有2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增聞。
[0010]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述rs3733570的T/T基因型的存在標(biāo)志著患有2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增聞。
[0011]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述rs3733570共顯性中C/T和T/T基因型的存在，或顯性中C/T和T/T基因型的存在，或隱性中T/T基因型的存在標(biāo)志著患有2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。[0012]進(jìn)一步的改進(jìn)，共顯性中T/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C基因型的7-8倍；C/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C基因型的3-4倍。
[0013]進(jìn)一步的改進(jìn)，顯性中C/T和T/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C基因型的4-5倍。
[0014]進(jìn)一步的改進(jìn)，隱性中T/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C和C/T基因型的3-4倍。
[0015]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增體系所用的正義引物，反義引物，PCR試劑和PCR反應(yīng)液；其中，正義引物為TTGCCAGTGTATAGGTAAGG,反義引物為ATTCATTCCAGTGTAGA，PCR試劑為 2 X ES Taq MasterMix ;PCR 反應(yīng)液為:抗凝全血 3%，0.5 μ M正義引物，0.5μΜ 反義引物，2XES Taq MasterMix50%。
[0016]本發(fā)明另一方面還提供用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的使用方法，該使用方法包括如下步驟:
[0017]a.收取EDTA-K2抗凝靜脈全血；
[0018]b.通過全血PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增rs3733570所在外顯子片段；
[0019]c.將b步驟獲得的PCR產(chǎn)物純化；
[0020]d.將步驟c得到的純化產(chǎn)物,經(jīng)測(cè)序儀(3730x1，ABI)測(cè)序；
[0021]e.分析結(jié)果。
[0022]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述擴(kuò)增步驟為:所述擴(kuò)增步驟為:94°C 3分鐘，55°C 3分鐘循環(huán)4次，94°C變性5分鐘后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸90秒，40個(gè)周期后，72 °C延伸5分鐘，4°C保持。
[0023]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所提供的試劑盒用于檢測(cè)醌式二氫蝶呤還原酶基因rs3733570SNP位點(diǎn)的基因型，該可以用來預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；其可通過特異性引物擴(kuò)增目的區(qū)域，分析鑒定該SNP的基因型；該試劑盒不但保證了一定的準(zhǔn)確性及靈敏度，同時(shí)具有檢測(cè)周期短，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1
[0025]用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包括標(biāo)記物，PCR擴(kuò)增體系所用的正義引物，反義引物，PCR試劑和PCR反應(yīng)液；其中，GAI標(biāo)記物為在人醌式二氫蝶呤還原酶rs3733570SNP位點(diǎn)的基因型；正義引物為TTGCCAGTGTATAGGTAAGG，反義引物為ATTCATTCCAGTGTAGA，PCR試劑為 2 X ES Taq MasterMix ;PCR反應(yīng)液為:抗凝全血 3%，0.5 μ M正義引物，0.5μΜ 反義引物，2XES Taq MasterMix50%。
[0026]所述試劑盒的使用方法包括如下步驟:
[0027]a.收取EDTA-K2抗凝靜脈全血；
[0028]b.通過全血PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增:在940C 3分鐘，55°C 3分鐘循環(huán)4次，94°C變性5分鐘后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸90秒，40個(gè)周期后，72 °C延伸5分鐘，4 °C保持；
[0029]c.將b步驟獲得的PCR產(chǎn)物純化；
[0030]d.將步驟c得到的純化產(chǎn)物,經(jīng)測(cè)序儀(3730x1，ABI)測(cè)序；[0031]e.分析結(jié)果。
[0032]試驗(yàn)例I
[0033]利用實(shí)施例1的試劑盒，按照實(shí)施例1公開的方法檢測(cè)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)rs3733570的基因型在2型糖尿病腎病的患者與正常患者對(duì)照分布不同。
[0034]1.研究對(duì)象
[0035]所選取的研究對(duì)象為河北省唐山市開灤醫(yī)院入院病人；研究對(duì)象分為高齡未患糖尿病對(duì)照組(NC)，2型糖尿病組(T2DM)，2型糖尿病腎病組(DN)三組，NC入組標(biāo)準(zhǔn)為:年齡> 60歲，血糖水平正常(空腹血糖< 6.lmmol/L而且餐后2小時(shí)血糖< 7.8mmol/L),無既往糖尿病史；T2DM標(biāo)準(zhǔn)為符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)并排除具有TlDM及年輕的成人起病糖尿病(MODY)等特殊類型糖尿病；另外需無糖尿病腎病的病史，尿常規(guī)蛋白陰性，血肌酐水平正常；DN入組標(biāo)準(zhǔn)為除前述糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)外應(yīng)同時(shí)具備，眼科診斷的糖尿病性視網(wǎng)膜病變，尿蛋白陽(yáng)性(至少2次尿常規(guī)蛋白陽(yáng)性(+~3+)或24小時(shí)尿蛋白定量^ 0.5g);無血尿:尿常規(guī)紅細(xì)胞< 3個(gè)/高倍視野；各組入組患者必須同時(shí)排除:①臨床診斷的除糖尿病性腎病以往的其他原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病血液系統(tǒng)疾病惡性腫瘤；本研究的注冊(cè)號(hào)=ChiCTR-TNRC-11001489 ;倫理委員會(huì)批件文號(hào)為2006醫(yī)倫字5號(hào)。
[0036]2.檢測(cè)方法:
[0037]rs3733570位點(diǎn)所在DNA的擴(kuò)增
[0038]所用試劑2XES Taq MasterMix (康為世紀(jì)，CW0690)
[0039]所用引物
[0040]senseTTGCCAGTGTATAGGTAAGG
[0041]antisense ATTCATTCCAGTGTAGA
[0042]所有入組病人留取2ml EDTA-K2抗凝靜脈全血分裝后保存于_80°C，在94°C 3分鐘，550C 3分鐘循環(huán)4次以破壞細(xì)胞膜及核膜釋放基因組DNA ;通過PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增按如下程序進(jìn)行:94°C變性5分鐘后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸90秒，40個(gè)周期后72°C延伸5分鐘，4°C保持；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后經(jīng)測(cè)序儀(3730x1, ABI)分析后獲得序列；獲得的序列觀察rs3733570為何種核苷酸；
[0043]3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
[0044]描述性統(tǒng)計(jì)資料年齡用方差分析，性別用卡方檢驗(yàn)；基因型分布溫-哈平衡(Hardy-ffeinberg equilibrium,HWE)用HW計(jì)算器；運(yùn)用非條件logistic回歸計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度(odds ratio, OR)和 95% 可信區(qū)間(95%confidence interval, 95%CI)，ρ〈0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0045]4.結(jié)果
[0046]研究對(duì)象的臨床特征見表1 ;
[0047]rs3733570在人群中的分布見表2 ；
`[0048]rs3733570與2型糖尿病腎病的相關(guān)性見表3 ；
[0049]表一研究對(duì)象的臨床特征
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括標(biāo)記物，所述標(biāo)記物為在人醌式二氫蝶呤還原酶基因上存在的rs3733570SNP位點(diǎn)的基因型，所述基因型可以用來預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，所述rs3733570的T等位基因的存在標(biāo)志著患有2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。
3.如權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，所述rs3733570的T/T基因型的存在標(biāo)志著患有2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。
4.如權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，所述rs3733570共顯性中C/T和T/T基因型的存在，或顯性中C/T和T/T基因型的存在，或隱性中T/T基因型的存在標(biāo)志著患有2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。
5.如權(quán)利要求4所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，共顯性中T/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C基因型的7-8倍；C/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C基因型的3-4倍。
6.如權(quán)利要求4所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，顯性中C/T和T/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C基因型的4-5倍。
7.如權(quán)利要求4所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，隱性中T/T基因型患2型糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C/C和C/T基因型的3-4倍。
8.如權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增體系所用的正義引物，反義引物，PCR試劑和PCR反應(yīng)液；所述正義引物為TTGCCAGT GTATAGGTAAGG，所述反義引物為ATTCATTCCAGTGTAGA，所述PCR試劑為2XES Taq MasterMix ;所述PCR反應(yīng)液為:抗凝全血3%，0.5 μ M正義引物，0.5 μ M反義引物，2X ES Taq MasterMix50%。
9.如權(quán)利要求8所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步驟: a.收取EDTA-K2抗凝靜脈全血； b.通過全血PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增rs3733570所在外顯子片段； c.將b步驟獲得的PCR產(chǎn)物純化； d.將步驟c得到的純化產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序儀(3730x1，ABI)測(cè)序； e.分析結(jié)果。
10.如權(quán)利要求9所述的用于預(yù)測(cè)患2型糖尿病腎病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述擴(kuò)增步驟為:94°C 3分鐘，550C 3分鐘循環(huán)4次，94°C變性5分鐘后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30秒，52 V退火30秒，72 V延伸90秒，40個(gè)周期后，72 V延伸5分鐘，4°C保持。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882127SQ201410091164
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】李志國(guó), 沈宏, 劉業(yè)強(qiáng), 馬麗梅, 蒲志杰, 楊向軍 申請(qǐng)人:河北聯(lián)合大學(xué)