本發明涉及一種金線蓮莖腐病菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于金線蓮莖腐病菌高靈敏度快速分子檢測，克服了傳統的培養鑒定方法繁雜且準確性低的缺點，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域。

背景技術：

金線蓮又稱金線蘭，蘭科開唇蘭等，屬多年生草本植物，珍稀民間中草藥，素有“藥王”“金草”“神藥”等美稱，具有清熱退火、滋養強壯、潤肺保肝及消腫解毒等功效，已廣泛應用于高血壓、糖尿病、腎病、腫瘤等的治療和保健等方面。野生金線蓮對生長環境要求苛刻，繁殖率低，生長緩慢，且由于其獨有的營養價值和藥用價值，致使人工過度采挖，已面臨滅絕的境地。目前金線蓮主要通過人工栽培，但在栽培過程中病害問題也日漸突顯。

最近，在福建省多個金線蓮種植地出現了莖腐病病樣，該病對金線蓮不同生長期皆可造成危害，發病時植株莖基部先出現黃褐色水漬狀病斑，病斑擴大至繞莖周，病部組織腐爛干枯縊縮呈線狀。該病蔓延迅速，病情越來越嚴重，幼苗迅速倒伏死亡，出現大面積猝倒，嚴重威脅金線蓮的健康生產。通過對病樣采集、病菌分離鑒定，柯赫氏法則驗證，最終確定金線蓮莖腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

目前對金線蓮莖腐病的鑒定大多仍沿用傳統培養方法。傳統的病原菌鑒定技術是在分離培養獲得相應病原物的基礎上，通過形態學觀察和柯赫氏法則來判斷病原物的種類。整個過程常常需要耗費大量的勞動力和時間，一般需要幾天才能完成，而且要求操作者具備專業的病原菌分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗，因此以病原菌形態學特征為判斷基礎的傳統病原菌診斷方法，因其耗時長，效率低，難以滿足對金線蓮莖腐病診斷的實際需要，因其很容易錯過病害防治的最佳時期。

近年來隨著分子生物學技術的發展，以PCR技術為代表的分子檢測方法得到了迅速的發展和應用，尤其是聚合酶鏈式反應(PCR)技術的應用在很大程度上彌補了傳統方法的不足。這類方法普遍具有快速、準確、靈敏且不需要進行病原菌分離培養的特點，在控制植物病害的傳播、成災中已經開始發揮重要作用。因此，建立一套快速、靈敏、準確的金線蓮莖腐病菌檢測診斷技術不僅非常必要，而且十分迫切。

核糖體轉錄間隔區ITS序列是由交替的保守區和可變區組成，在微生物基因組中以多拷貝出現，具有種的特異性，因此該序列成為在種的水平鑒定病原菌極好的目標。為此，我們利用真菌通用引物ITS1/ITS4擴增金線蓮莖腐病菌的轉錄間隔區并進行克隆測序，通過序列比對，設計出一對金線蓮莖腐病菌特異性引物，建立金線蓮莖腐病菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監測技術體系。此技術可應用于金線蓮莖腐病菌引起病害顯癥之前的早期監測，對于確定病害防治最佳時期具有重要的作用，為防治策略的制定提供科學依據。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術中金線蓮莖腐病菌傳統檢測方法對操作者的實驗技能和實際經驗有很高的要求，且十分耗時，無法達到快速檢驗的問題，提供金線蓮莖腐病菌的特異分子檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的金線蓮莖腐病菌的快速分子檢測體系和程序。該方法可用于金線蓮莖腐病菌引起病害顯癥之前的早期監測，對確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

1．根據金線蓮莖腐病菌核糖體轉錄間隔區ITS序列由交替的保守區和可變區組成的特點，設計了對金線蓮莖腐病菌具有特異擴增作用的一對PCR引物，序列如下：

ITS403f：5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’；

ITS403r：5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’。

2． 金線蓮莖腐病菌快速檢測體系的建立

（1）金線蓮莖腐病菌特異PCR快速檢測體系的建立

所述PCR反應體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補足。PCR反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個循環；72 ℃延伸10 min。

（2）金線蓮莖腐病菌巢式PCR快速檢測體系的建立

以真菌通用引物（ITS1/ ITS4）進行第一輪PCR擴增，反應體系25.0 μL，包括2×TaqPCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L的引物（（ITS1/ ITS4）各0.2 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補足。PCR反應條件為: 94℃預變性3min，94℃變性1min，55℃退火30 sec ，72℃延伸1min，共30個循環，72 ℃延伸10 min。

分別取1 μL第一輪PCR產物做為DNA模板，用引物(ITS403f / ITS403r)進行第二輪PCR擴增。反應體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL，25ng DNA模板1 μL，不足部分由dd H₂O補足。PCR反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個循環；72 ℃延伸10 min。

本發明的關鍵性技術是金線蓮莖腐病菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了檢測金線蓮莖腐病菌特異引物準確性，本發明以我國福建、浙江、江西、臺灣等省的18株金線蓮莖腐病菌和其它25種真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下：

取50mg 冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900μl 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液（2% CTAB；100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0；20mmol/L EDTA,pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90μl 10% SDS（十二烷基苯磺酸鈉）后振蕩混勻，于55～60℃水浴1.5 h，每10 min顛倒混勻一次,水浴1.5h后離心（12,000rpm）8min，取上清液加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（體積比25:24:1），顛倒使充分混勻，12,000rpm離心12 min，取上清液（水相），加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，顛倒使充分混勻，12,000rpm離心5min，吸上清，加0.1體積的3mol/L NaAC溶液和2倍體積的冰無水乙醇, 置-20℃冰箱中沉淀30 min以上，12,000rpm離心5 min，輕輕地倒去上清液，加入700μl冰70%乙醇進行洗滌（稍離心，傾掉上清），在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用1×TE（10mmol/LTris-HCL,0.1mmol/LEDTA,pH8.0）溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至25ng/μL待用。

經對供試25種真菌和18株金線蓮莖腐病菌的特異性進行PCR驗證。PCR反應體系25.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補足。PCR反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個循環；72 ℃延伸10 min。此特異引物在金線蓮莖腐病菌中特異性地擴增出403bp的產物。這說明該引物可被用于發病植株中金線蓮莖腐病菌快速可靠的檢測和鑒定。

本發明有益效果：本發明方法適用于植株中金線蓮莖腐病菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中金線蓮莖腐病菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果：

1、特異性強：本發明檢測方法是根據ITS序列由交替的保守區和可變區組成的特點，設計了一對金線蓮莖腐病菌特異引物進行檢測。已經對來自我國福建、浙江、江西、臺灣等省的金線蓮莖腐病菌和其它25種不同真菌進行驗證，結果具有很強的特異性。

2、靈敏度高：巢式PCR對金線蓮莖腐病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10fg/25 μL，具有很高的靈敏性。

3、實用性好：本發明所設計一對特異性引物，可用于金線蓮莖腐病菌的高靈敏度快速檢測，因此本方法的實用性強，可滿足金線蓮莖腐病菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要。

4、操作簡便快速：應用本發明方法，對帶金線蓮莖腐病菌的植株進行病菌DNA提取、PCR擴增和常規的瓊脂糖凝膠電泳后即可判定結果，無需對擴增產物進行限制性內切酶酶切，整個檢測過程可在數小時內完成。

附圖說明

圖1為本發明所要檢測的金線蓮莖腐病菌的特異PCR擴增圖

圖中：M為DL2000 DNA Marker；1為陰性對照；2-5為尖孢鐮刀菌；6：黃色鐮刀菌；7：燕麥鐮刀菌；8：雪腐鐮刀菌；9：禾谷鐮刀菌；10：炭疽病菌。

圖2為本發明金線蓮莖腐病菌的靈敏性檢測擴增結果圖

圖中：M為DL2000 DNA Marker ；1為陰性對照；2-9分別為1 ng/μL，

100pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL的不同濃度金線蓮莖腐病菌DNA。

具體實施方式

本發明的技術內容包括金線蓮莖腐病菌的特異檢測引物，所設計的引物及其序列為（ITS403f：5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’和ITS403r：5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’）。利用該引物可從金線蓮莖腐病菌中特異擴增出403bp的產物。

實施例1：引物對金線蓮莖腐病菌的特異性擴增

1．金線蓮莖腐病菌的特異檢測

PCR反應體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補足。PCR反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個循環；72 ℃延伸10 min。

2．檢測結果

檢測的特異性：除了來自我國福建、浙江、江西、臺灣等省等省的金線蓮莖腐病菌DNA可特異地擴增出403bp的產物外，檢測了25種其他真菌DNA均未能擴增出任何產物，具有很強的特異性。

實施例2：引物對金線蓮莖腐病菌的靈敏度檢測

1．DNA濃度稀釋：提取的金線蓮莖腐病菌基因組DNA，經分光光度計測定濃度后，采用系列濃度稀釋。

2．金線蓮莖腐病菌的靈敏度檢測

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的金線蓮莖腐病菌DNA依次稀釋成，1 ng/μL，100 pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL共8個不同濃度梯度，采用巢式PCR對引物的靈敏度進行測定。

分別取1μL不同濃度的金線蓮莖腐病菌基因組DNA為模板，以真菌通用引物（ITS1/ITS4）進行第一輪PCR擴增，反應體系25.0 μL，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物（（ITS1/ ITS4）各0.2 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補足。

PCR反應條件為: 94℃預變性3min，94℃變性1min，55℃退火30 sec ，72℃延伸1min，共30個循環，72 ℃延伸10 min。分別取1 μL第一輪PCR產物做為DNA模板，用引物(ITS403f / ITS403r)進行第二輪PCR擴增。反應體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補足。PCR反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個循環；72 ℃延伸10 min。

3．檢測結果：

在25.0μL反應體系中，金線蓮莖腐病菌基因組DNA可獲得明顯擴增條帶，檢測靈敏度可達10 fg/25μL。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農業科學院植物保護研究所

<120> 一種金線蓮莖腐病菌分子檢測引物及其檢測方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccaacccct gtgacatac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attaccagta acgagggtt 19