一種基于ssr與毛細管電泳技術鑒定甘蔗種質資源的方法
【專利摘要】本發明公開一種甘蔗種質資源鑒定的方法，該方法應用SSR分子標記與毛細管電泳技術相結合，使用12對引物建立出52個甘蔗品種的指紋圖譜，將其用于甘蔗種質的鑒定、品種鑒別與保護。具體方法包括提取不同甘蔗品種的基因組DNA，經PCR擴增后，用毛細管電泳檢測擴增結果，根據DNA條帶大小的不同建立不同甘蔗種質的指紋圖譜，并用于種質資源的鑒定。本發明的優點在于與常規的種質資源鑒定和生化檢驗相比，不受作物生長環境和季節的影響，分辨率高、結果準確可靠、操作簡單并且快速直接，特別適用于大批量、多批次的實驗數據整合。
【專利說明】一種基于SSR與毛細管電泳技術鑒定甘蔗種質資源的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種利用SSR和毛細管電泳技術鑒定甘蔗種質資源的高通量檢測方法。
【背景技術】
[0002]我國是世界上古老的甘蔗種植國家之一，歷代甘蔗栽培品種類型很多。近年來，中國又引進、選育了適應于各種生態類型蔗區推廣的甘蔗品種120多個。但當前甘蔗栽培品種遺傳基礎狹窄，品種的形態、農藝性狀等生物學特性差異不大，如何鑒定甘蔗栽培品種及其雜交后代已成為當今甘鹿科研工作的重難點之一。
[0003]在DNA分子技術方法廣泛應用之前，人們主要是借助形態和農藝性狀、細胞核型分析、同工酶標記、染色體分析技術等實驗方法，對甘蔗栽培品種進行鑒定，但這些方法受環境、有限的標記數量等因素制約，不能得到廣泛推廣。DNA分子標記技術是DNA水平上遺傳多樣性的直接反映，具有數量多、穩定好、無表型效應，不受環境影響等優點。
[0004]DNA指紋技術是指能夠反映生物個體或種群間基因組中DNA位點差異的一種分子生物學技術。目前DNA分子標記已廣泛應用于甘蔗栽培品種指紋圖譜構建、遺傳分析、基因定位和分子標記輔助選擇等方面。與其它分子標記相比，SSR分子標記技術具有多態性豐富、共顯性遺傳方式、分析方法簡單、重復性好等優點。目前，對SSR標記技術的PCR產物檢測方法主要有熒光標記引物測序法、同位素標記引物的聚丙烯酰胺電泳法，以及銀染聚丙烯酰胺PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)方法。PAGE是目前最常用的檢測方法，但其因需要銀染，使得檢測過程變得復雜，且不能準確讀出片段大小，只能粗略的估計。
[0005]毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)也叫高效毛細管電泳(HPCE)。是20世紀80年代后期在全球范圍內迅速崛起的一種分離分析技術。毛細管凝膠電泳和普通電泳相比，具有高靈敏度、高分辨率、高速度、樣品少等優點；因此，CE被逐步應用于檢測分子標記技術的PCR擴增產物。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是解決甘蔗種質資源鑒定難的問題，提供一種高通量、操作簡單、結果準確可靠的甘蔗種子資源的鑒定方法。而將毛細管電泳技術與SSR分子標記技術結合，能夠為甘蔗親屬關系的鑒定、品種鑒定、種子真實性鑒定以及種子純度鑒定提供有力的支持。
[0007]本發明提供的甘蔗種質資源鑒定方法，其步驟為:提取甘蔗新鮮嫩葉DNA，利用12對SSR熒光引物與毛細管電泳技術相結合構建52個在中國廣泛種植的甘蔗品種DNA指紋數據庫，將待測品種或品系DNA指紋數據與已構建的甘蔗DNA指紋數據庫中的數據進行對比分析，判斷待測品種或品系的種類名稱。
[0008]作為本發明的進一步限定，所述12對SSR熒光引物為篩選得到的核心引物，其引物信息如下表:
【權利要求】
1.一種高通量SSR甘蔗種質資源鑒定方法，其特征在于提取甘蔗新鮮嫩葉DNA后利用12對SSR熒光引物進行PCR擴增，然后將PCR產物經過毛細管電泳分析，構建出52個在中國廣泛種植的甘蔗品種DNA指紋數據庫，將待測品種或品系DNA指紋數據與已構建的甘蔗DNA指紋數據庫中的數據進行對比分析，判斷待測品種或品系的種類名稱。
2.根據權利要求1所述的高通量SSR甘蔗種質資源鑒定方法方法，其特征在于，所述12對SSR熒光引物為篩選得到的核心引物，其中正向引物5’端以CY5磷熒光染料標記，合成熒光引物，并避光保存；引物信息如下: 引物名稱:SMC7CUQ，條帶大小:158-171Bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:
正向:5’ -GCCAAAGCAAGGGTCACT AGA-3，
反向:5’ -AGCTCTATCAGTTGAAACCGA-3’ ； 引物名稱:SMC18SA，條帶大小:130-165Bp，引物退火溫度:62°C，引物序列: 正向:5’ -ATTCGGCTCGAC CTCGGGAT-3’
反向:5’ -AGTCGAAAGGTAGCGTGGTGTTAC-3’ ； 引物名稱:SMC22DUQ，條帶大小:140-163Bp，引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5’ -CCA TTC GAC GAA AGC GTC CT-3’
反向:5’ -CAA GCG TTG TGC TGC CGA GT-3’ ； 引物名稱:SMC24DUQ，條帶大小:121-142Bp，引物退火溫度:64°C，引物序列:
正向:5’ -CGCAACGACATATACACTTCGG-3’
反向:5’ -CGACATCACGGAGCA ATC AGT-3’ ； 引物名稱:SMC31CUQ，條帶大小:138-185Bp，引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5’ -CATGCCAACTTCCAATACAGACT-3’
反向:5’ -AGTGCCAATCCA TCT CAG AGA-3’ ； 引物名稱:SMC36BUQ，條帶大小:104-254Bp，引物退火溫度:64°C，引物序列:
正向:5’ -GGGTTTCAT CTC TAG CCT ACC-3’
反向:5’ -TCAGTAGCAGAGTCAGACGCTT-3’ ； 引物名稱:SMC119CG，條帶大小:105-131Bp，引物退火溫度:58°C，引物序列:
正向:5’ -TTCATCTCT AGC CTA CCC CAA-3’
反向:5’ -AGC AGC CAT TTA CCC AGG A-3’ ； 引物名稱:SMC278CS，條帶大小:140-182Bp,引物退火溫度:64°C，引物序列:
正向:5’ -TTCTAGTGCCAATCCATCTCAGA-3’
反向:5’ -CATGCCAACTTCCAAACAGACT-3’ ； 引物名稱:SMC334BS，條帶大小:132-165Bp,引物退火溫度:60°C，引物序列: 正向:5’ -CAATTCTGACCG TGCAAAGAT-3’
反向:5’ -CGATGAGCTTGA TTG CGA ATG-3’ ； 引物名稱:SMC336BS，條帶大小:141-185Bp,引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5’ -ATTCTAGTGCCAATCCATCTC A-3’ 反向:5’ -CATGCCAACTTCCAAACAGAC-3’ ； 引物名稱:SMC486CG，條帶大小:224-245Bp，引物退火溫度:58°C，引物序列:
正向:5’ -GAA ATT GCC TCC CAG GAT TA-3’反向:5’ -CCAACTTGAGAATTGAGATTCG-3’ ； 引物名稱:SMC597CS，條帶大小:144-179Bp,引物退火溫度:64°C，引物序列:
正向:5’ -GCACACCACTCGAATAACGGAT-3’ 反向:5，-AGTATATCGTCCCTGGCATTCA-3，。
3.根據權利要求1所述的高通量SSR甘蔗種質資源鑒定方法方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步驟:將甘蔗嫩葉于液氮研磨成粉末狀，加入1.2 ml 65°C預熱的SDS提取液，搖勻，65°C水浴45 min ;加入200 μ I KAc，混勻后，冰浴15 min ；4°C, 10000 rpm離心15min,取I ml上清液,加入等體積氯仿混勻；4°C, 12000 rpm離心7 min,取上清液,加1/10體積的NaAc和2倍體積的預冷無水乙醇,冰浴20 min ；4°C, 10000 rpm離心10 min,棄上清,用70%酒精洗滌2次，晾干沉淀；加入200 μ I已滅菌的TE溶液，溶解沉淀，即得DNA溶液，置于-20°C保存備用。
4.根據權利要求1所述的高通量SSR甘蔗種質資源鑒定方法方法，其特征在于，所述的PCR擴增程序為:首先95°C預變性5 min ;隨后的30個循環為:94°C變性30 sec，退火30sec, 72°C延伸 30 sec ;最后 72°C下延伸 2 min。
5.根據權利要求1所述的高通量SSR甘蔗種質資源鑒定方法，其特征在于:所述的毛細管電泳分析方法為將所得到的PCR產物稀釋100倍后，在遺傳分析系統儀上利用毛細管電泳法檢測，每個 CE樣品中含有I μL PCR產物、0.2 μL Genescan-400分子量標準品和20μL SLS溶液；在毛細管凝膠電泳過程中，PCR產物與Genescan-400分子量標準品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。
6.根據權利要求1所述的高通量SSR甘蔗種質資源鑒定方法方法，其特征在于:所述指紋數據庫的構建為在所有引物的擴增產物中只統計多態性較高的SSR標記片段，參試材料中，若含有這這些特異SSR標記片段則記為“A”，若無擴展出記為“C”;對于某一甘蔗栽培品種，有無這些特異SSR標記的組合即為此甘蔗栽培品種的指紋，不同甘蔗種質資源的SSR標記片段構成了指紋圖譜數據庫。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017859SQ201410090829
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】梁俊, 劉守廷, 甘志勇, 莫璋紅, 宋雪萍, 甘國勇 申請人:南寧泰格瑞農業科技有限公司