水稻Os05g26890.1蛋白、編碼該蛋白的基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種水稻Os05g26890.1蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發明還提供一種新的可用于控制作物籽粒大小和矮桿的水稻小粒矮稈基因Os05g26890.1及其應用。所述水稻小粒矮稈基因Os05g26890.1的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發明首次克隆了控制水稻小粒矮稈性狀的Os05g26890.1基因，為闡明粒型遺傳的復雜分子機制提供了新思路，為水稻育種提供了可利用的新基因資源。
【專利說明】水稻0s05g26890.1蛋白、編碼該蛋白的基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及一種水稻0s05g26890.1蛋白、編碼該蛋白的水稻小粒矮桿基因及其應用。
【背景技術】
[0002]水稻是世界上重要的糧食作物之一，其籽粒形狀和大小直接影響著水稻的產量，也直接影響水稻品質，因而對水稻籽粒形狀的遺傳研究是水稻遺傳育種工作的重中之重。決定籽粒形狀的因素主要有谷粒長、寬、厚以及長寬比，其中谷粒長影響籽粒形狀最大(Tkada, 1991)，粒長主要表現為數量性狀，大量的研究結果表明，粒長QTL遍布水稻各號染色體上。
[0003]在籽粒性狀基因控制研究上，多數研究認為粒長、粒寬、長寬比是一個復雜、由多基因控制的數量性狀。因此,分析其QTL (Quantitative Trait Loci)位點及效應是研究籽粒性狀的一個重要方法和途徑。但正是由于粒型遺傳的復雜機制，目前僅有少數的與粒型相關的基因被分離和克隆。為此，突變體材料的構建和應用應運而生。水稻突變體為水稻育種提供了具有重要意義的材料。到目前為止，利用突變體材料已在水稻第3號染色體上定位了 I個不完全顯性小粒基因(Mi)和2個隱性矮桿小粒基因(dwf33和dwf37)，在第4號染色體上定位了 1個隱性圓小粒基因(rkl)，在第I號染色體上定位了 I個隱性矮桿小粒基因(dwf35)、l個隱性矮桿圓小粒基因(dwf2)和I個隱性矮桿圓大粒基因(dwf36);在第11號染色體上定位了 1個隱性小粒基因；在第5、6和10號染色體上分別定位了 I個隱性矮桿小粒基因(dwfl)、l個隱性矮桿小粒基因(dwf39)和I個隱性圓小粒基因(rk2)。由此可見，控制水稻小粒基因的機制復雜，小粒基因并沒有因為定位和克隆了諸多基因而被完全解析，尚需要發掘新的與小粒基因相關的突變體，研究小粒基因的遺傳機制和機理。
[0004]株高是評價水稻株型的重要農藝性狀之一，適度矮化有利于水稻品種的耐肥、抗倒、高產。20世紀50年代至60年代，隨著“矮腳南特”、“矮仔占”、“IR8”等一批攜帶半矮桿基因“sdlO”的釉型矮桿品種的育成與推廣，水稻產量較原推廣品種提高了 20%-30%，引發了水稻育種的一場綠色革命(朱立宏等，1980;熊振民等，1988;林世成等，1991;ChangTT等，1985)。對現有矮桿水稻品種系譜分析的結果表明，這些材料及其衍生品種的矮生性主要由同一位點半矮桿主基因sdi控制，同一矮桿基因的廣泛利用潛伏著由遺傳單一帶來的風險。因此，加強水稻新矮源的挖掘、篩選和利用研究不僅有利于擴大水稻品種的遺傳多樣性，還有利于為水稻育種提供新材料新方法，保障水稻生產可持續發展。
[0005]矮桿是由水稻突變而獲得，1922年印度學者Parnell等報道了 I個由隱性單基因控制的自然矮桿突變系，這是有關水稻矮生性遺傳的最早報道(Parnell FR等，1922)。明峰正夫對水稻赤毛品種矮桿突變體進行遺傳分析，提出高桿對矮桿為顯性(明鋒正夫，1925)。Ichijima首先報道了用X射線誘導粳稻品種產生矮桿突變(Ichijima K.,1932)。自20世紀60年代以來，伴隨著水稻矮化育種的發展，新發現的水稻矮桿基因不斷增加。迄今為止，已在水稻遺傳協會登記，影響株高的基因有158個，其中矮桿基因已經達到74個。
[0006]稻種資源是水稻育種工作的生命線，優良種質的發現、創造和利用是水稻育種工作能夠不斷發展的前提條件。水稻雜交制種中，把小粒矮桿基因轉入到不育系中，因其為隱性遺傳,小粒性狀及矮生性不會在雜交稻組合中表現出來，同時小粒矮桿材料往往穗粒數較多，而該性狀屬于顯性或偏顯性遺傳。選育小粒型不育系，培育雜交稻可以獲得大穗的優良性狀。由于小粒矮桿材料的穎花數量多，667m2可達到4500萬朵以上穎花，為提高雜交稻制種種子數量提供了新的途徑。此外，小粒矮桿不育系籽粒千粒重僅為普通品種的1/2到1/3，這種形態的差異易于鑒別種子的真偽及純度，為機械化制種提供了可能。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種水稻0s05g26890.1蛋白。
[0008]本發明的另一目的是提供一種新的可用于控制作物籽粒大小和矮桿的水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1及其應用。
[0009]為了實現本發明目的，本發明的一種水稻0s05g26890.1蛋白，來源于水稻(Oryzasativa L.)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010]本發明還提供編碼所述水稻0s05g26890.1蛋白的基因，即水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1，其核苷酸序列為:1)如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；2)在嚴格條件下與I)所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，所述嚴格條件是指在0.1XSSPE或
0.1 X SSC, 0.1%SDS的溶液中，65°C下進行雜交，并用該溶液洗膜。
[0011]本發明還提供含有水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1的載體。
[0012]本發明還提供含有水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1的轉基因細胞系。
[0013]本發明還提供含有水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1的工程菌。
[0014]本發明還提供含有水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1的轉化植物細胞。
[0015]本發明還提供所述水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1在控制作物籽粒大小和矮桿性狀中的應用。優選所述作物為水稻。
[0016]本發明進一步提供一種與水稻小粒矮桿性狀相關的分子標記，其位于編碼水稻0s05g26890.1蛋白的基因序列第880_882bp處，此處堿基為AAG的水稻正常(SEQ IDN0.7);此處3個堿基AAG缺失的水稻呈小粒矮桿性狀；所述編碼水稻0s05g26890.1蛋白的基因序列如SEQ ID N0.2所不。
[0017]本發明還提供上述與水稻小粒矮桿性狀相關的分子標記在水稻分子標記輔助育種中的應用。
[0018]本發明首次克隆了控制水稻小粒矮桿性狀的0s05g26890.1基因，為闡明粒型遺傳的復雜分子機制提供了新思路，為水稻育種提供了可利用的新基因資源。
[0019] 本發明還開發了與水稻小粒矮桿性狀相關的分子標記。可以準確、快捷地用于遺傳分析或基因診斷及后期分子輔助育種工作中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發明實施例1中突變體‘2338 (小)’株高、谷粒、穗大小(左側)與‘9311’的谷粒、穗大小(右側)比較；其中，a為株高比較，b為穗大小比較，c為谷粒比較。
[0021]圖2為本發明實施例1中突變體‘2338 (小)’(左側)與‘9311’(右側)的株高比較。
[0022]圖3為標記RM18451在F2部分小粒植株中的分離情況；其中，Pl: ‘9311’，P2:‘2338 (小)’，1-21號為F2部分小粒植株的編號。
[0023]圖4為0s05g26890.1基因在突變體與‘9311’中的序列比較，突變體‘2338 (小)’與‘9311’的DNA序列比較，有3個堿基缺失。
[0024]圖5為為本發明實施例1中功能互補實驗結果；a圖為互補載體構建示意圖；b圖為水稻‘9311’的0s05g26890基因轉化‘2338 (小)，的TO代陽性轉基因植株(右)與‘9311’(左)在抽穗時期的表型比較，轉基因植株恢復到了 ‘9311’的表型。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0026]實施例1水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1的基因定位
[0027]將水稻小粒矮桿突變體‘2338 (小)’與正常秈稻品種‘9311’進行雜交，所有Fl植株種子大小正常。調查F2分尚群體植株的種子大小,發現種子正常植株與小粒種子植株的分離比符合3:1，說明該性狀由一對隱性基因控制。
[0028]利用‘2338 (小)’與‘9311’之間表現出多態性的分子標記分析正常DNA池和突變體DNA池，發現位于第5號染色體的RM18451與目標性狀連鎖，進一步利用這個標記對‘2338 (小)’ / ‘9311’ F2群體中的100個隱性單株進行連鎖分析，發現其與突變表型緊密連鎖，因此目標基因初步定位在水稻第5號染色體上。
[0029]圖1為突變體‘2338 (小)’谷粒、穗大小與‘9311’的谷粒、穗大小比較。
[0030]圖2為突變體‘2338 (小)，與‘9311’的株高比較。
[0031]圖3為標記RM18451在F2部分小粒植株中的分離情況(Pl: ‘9311’，P2: ‘2338(小)’，1-21號為F2部分小粒植株的編號)。
[0032]圖4為0s05g26890.1基因在突變體與‘9311’中的序列比較，突變體‘2338 (小)’與‘9311’的DNA序列比較，有3個堿基缺失。
[0033]功能互補實驗:利用野生型‘9311’的0s05g26890基因構建互補載體并轉化‘2338(小)’，TO代轉基因植株在株高和籽粒大小上均恢復了正常。結果如圖5所示，a圖為互補載體構建示意圖，b圖為水稻‘9311’的0s05g26890基因轉化‘2338 (小)’的TO代陽性轉基因植株(右)與水稻‘9311’(左)在抽穗時期的表型比較，轉基因植株恢復到了‘9311’的表型。 [0034]實施例2導致‘2338 (小)’突變表型的候選基因的鑒定
[0035]利用http://rice.plantbiology.msu.edu/index, shtml,對 RM18451 附近的區間進行基因預測，發現有個開放閱讀框0s05g26890.1編碼G蛋白的alpha亞基，文獻報道其突變后的表型與‘2338 (小)’相似，于是發明人共設計了 4條引物(表1)，從‘9311’和‘2338(小)’種中擴增出了 0s05g26890.1的基因全序列，經過測序發現:0s05g26890.1的基因序列在‘2338 (小)’中發生了突變，0s05g26890.1的基因序列的第11個外顯子上少了 3個核苷酸:AAG。因此，確定0s05g26890.1為導致‘2338 (小)’突變表型的候選基因，將其命名為水稻小粒矮桿基因0s05g26890.1，其核苷酸序列SEQ ID N0.2所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0036]表1引物序列
[0037]
【權利要求】
1.水稻0s05g26890.1蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列為: 1)如SEQID N0.2所示的核苷酸序列； 2)在嚴格條件下與I)所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴格條件是指在0.1 X SSPE或0.1XSSC,0.1%SDS的溶液中，65°C下進行雜交，并用該溶液洗膜。
3.含有權利要求2所述基因的載體。
4.含有權利要求2所述基因的工程菌。
5.權利要求2所述基因在控制作物籽粒大小和矮桿性狀中的應用。
6.權利要求2所述基因在控制水稻小粒矮桿性狀中的應用。
7.—種與水稻小粒矮桿性狀相關的分子標記，其特征在于，其位于編碼水稻0s05g26890.1蛋白的基因序列第880_882bp處，此處堿基為AAG的水稻正常；此處3個堿基AAG缺失的水稻呈小粒矮桿性狀；所述編碼水稻0s05g26890.1蛋白的基因序列如SEQ IDN0.2所示。
8.權利要求7所述與水稻小粒矮桿性狀相關的分子標記在水稻分子標記輔助育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/82GK103936843SQ201410071709
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2013年3月25日
【發明者】楊遠柱, 宋顯偉, 秦鵬, 周明, 符辰建 申請人:袁隆平農業高科技股份有限公司, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所, 湖南亞華種業科學研究院