一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應用。糖胺聚糖裂解酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；糖胺聚糖裂解酶的編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；本發(fā)明制備的糖胺聚糖裂解酶對透明質(zhì)酸的比活為110,000U/mg、對硫酸軟骨素的比活為45,000U/mg；酶活力是已知商品化糖胺聚糖裂解酶（如，CSaseABC、CSaseAC?I和II等）的幾十到數(shù)百倍，可應用于醫(yī)藥及化妝品等領域，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應用，屬于基因工程【技術(shù)領域】。【背景技術(shù)】
[0002]糖胺聚糖(Proteoglycans, GAG)又稱為粘多糖，是重復二糖單位組成的直鏈多糖。主要包括透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid, HA),肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/HeparanSulfate, Hep/HS),硫酸軟骨素 / 硫酸皮膚素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate,CS/DS),硫酸角質(zhì)素(Keratan Sulfate, KS)。除硫酸角質(zhì)素的二糖單位是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺組成以外，其它糖胺聚糖的二糖單位均是由己糖醛酸(D-葡萄糖醛酸/L-艾杜糖醛酸)與己糖胺(N-乙酰氨葡萄糖胺/N-乙酰半乳糖胺)組成。其中透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)相對簡單，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成的二糖單位經(jīng)β -1, 4-糖苷鍵連接而成。其它糖胺聚糖則由于各種修飾酶的作用使糖鏈變得異常復雜，主要表現(xiàn)在糖鏈中不同部位羥基(-0Η)和氨基(-ΝΗ2)的硫酸化，D-葡萄糖醛酸在C5-差向異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)長-艾杜糖醛酸，己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖糖鏈結(jié)構(gòu)的這種高度復雜性不是隨機發(fā)生的，而是具有高度的時空特異性，是各種糖鏈合成相關酶在不同細胞組織和器官的不同發(fā)育階段表達調(diào)控水平所致，不同的結(jié)構(gòu)使其具有不同的功能，結(jié)構(gòu)的復雜性賦予其功能的多樣性。
[0003]糖胺聚糖廣泛存在于動物細胞細胞表面和細胞基質(zhì)中，通過與各種蛋白的特異相互作用參與了細胞的增值和分化、細胞間的識別、細胞轉(zhuǎn)移、組織形態(tài)發(fā)生、癌變等各種生理和病理過程(Knudson and Knudsonl993, Perrimon and Bernfield2000, Karbownik andNowak2013)糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物學功能使其成為重要的生物活性分子，在醫(yī)藥及功能食品中得到廣泛應用，如肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸(Noble2002，Jiang, Lianget al.2007)等。但由于糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的不均一'丨生，特別是硫酸化糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的高度復雜性，使不同來源和不同批次的同一種糖胺聚糖在活性上存在很大差異(Sugahara, Mikamiet al.2003) 0近年來的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通過多糖鏈中具有特殊結(jié)構(gòu)的功能區(qū)與特定蛋白的特異相互作用來實現(xiàn)的，同一多糖鏈中存在不同結(jié)構(gòu)的功能區(qū)，與不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能，因此可以通過選擇性部分降解糖胺聚糖多糖鏈，制備結(jié)構(gòu)均一或相對均一的特定功能區(qū)寡糖用于醫(yī)藥及功能食品，該類產(chǎn)品不但結(jié)構(gòu)和活性確定，而且還由于分子量小利于吸收而大大提高了利用率。
[0004]糖胺聚糖降解酶是研究糖胺聚糖構(gòu)效關系的重要工具酶，主要包括微生物來源的裂解酶系和動物來源的水解酶系。根據(jù)底物的不同可分為透明質(zhì)酸酶、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素降解酶、肝素/硫酸乙酰肝素降解酶、硫酸角質(zhì)素降解酶四大類，其中大部分透明質(zhì)酸酶可以同時降解非硫酸化及N-乙酰半乳糖胺4位(CS-A)或6 (CS-C)位羥基硫酸化的低硫酸化度硫酸軟骨素區(qū)段，但降解速度遠低于降解透明質(zhì)酸。如來自綿羊和牛睪丸的透明質(zhì)酸水解酶(Zaneveld, Polakoski et al.1973),可以在酸性PH下將透明質(zhì)酸完全降解為四糖和六糖。而來自鏈霉菌的透明質(zhì)酸裂解酶則只能降解透明質(zhì)酸，終產(chǎn)物是非還原端帶不飽和雙鍵的四糖和六糖(Ohya and Kanekol970)。在動物體內(nèi)一直未發(fā)現(xiàn)專一的硫酸軟骨素/硫酸皮膚素降解酶家族，越來越多的研究顯示哺乳動物體內(nèi)硫酸軟骨素/硫酸皮素的降解主要是由透明質(zhì)酸酶家族的一些酶來完成的，最近透明質(zhì)酸酶家族成員HYAL4被鑒定為一個硫酸軟骨素水解酶(Yamada, Sugahara et al.2011)。微生物來源的硫酸軟骨素裂解酶(CSase),如CSase ABC和CSaseAC都表現(xiàn)出一定的透明質(zhì)酸降解活性,但CSaseB是高度專一性硫酸皮膚素降解酶，對硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸均無降解活性。利用各種糖胺聚糖降解酶所具有的不同底物選擇性和產(chǎn)物多樣性，可以對結(jié)構(gòu)復雜的糖胺聚糖進行組成結(jié)構(gòu)和功能研究，結(jié)合各種分離分析手段對多糖鏈中與靶蛋白結(jié)合的特定功能區(qū)進行鑒定，并最終用于高活性藥用及功能寡糖的酶法制備。
[0005]糖胺聚糖作為胞外基質(zhì)的主要組成成分構(gòu)成了細胞與外界的一道防護屏障，保護機體細胞免受損傷，但是在疾病治療中，致密的胞外基質(zhì)抑制了藥物在組織中的通透性和有效擴散，降低了藥物的起效時間和療效，尤其是對一些大分子藥物，如胰島素和抗體等蛋白類藥物。多年來，透明質(zhì)酸酶被廣泛應用于臨床，目前有三種美國食品與藥品管理局(FDA)批準的商品化透明質(zhì)酸酶可以利用，分別是牛睪丸來源的Amphadase,綿羊睪丸來源的Vitrase,和近來剛上市的人重組透明質(zhì)酸酶Hylenex。臨床上透明質(zhì)酸酶的主要用途包括:作為助劑促進其它藥物的吸收和擴散(Schuller, Castonguay et al.1991)；用于液體皮下灌注；用于透明質(zhì)酸填充整形手術(shù)意外中透明質(zhì)酸的降解消除；用于治療與糖胺聚糖代謝紊亂蓄積相關的頑固性皮膚病，如糖尿病性硬腫癥、硬皮病、瘢痕疙瘩等(PCT publications W000/38732 ；W001/45743;and German Patent N0.19963538)(Lee, Grummer et al.2010)。此外,大量報道證明,硫酸軟骨素酶CSase ABC可以通過降解硫酸軟骨素促進神經(jīng)損傷中神經(jīng)元軸突再生(Moon, Asher et al.2001, Bradbury, Moon etal.2002, Kwok, Afshari et al.2008, Bradbury and Carter2011)? [0006]綜上所述，糖胺聚糖降解酶不僅是糖胺聚糖結(jié)構(gòu)功能研究必不可少的工具，而且在糖胺聚糖活性寡糖制備和疾病治療中有著重要的應用價值。但目前具有應用價值的高活力糖胺聚糖降解酶很少，因此尋找和鑒定新型高效穩(wěn)定的糖胺聚糖降解酶具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應用。
[0008]一種糖胺聚糖裂解酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示:
[0009]Ca)氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；
[0010](b )在(a )中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有糖胺聚糖裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0011]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示。
[0012]一種糖胺聚糖裂解酶的編碼基因，核苷酸序列如(i )或(i i )所示:
[0013](i)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0014](ii )在嚴格條件下與(i )限定的DNA序列雜交且編碼具有糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0015]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述核苷酸序列(ii)中所述嚴格條件下，是指:
[0016]在含0.5%SDS的6 X SSC緩沖液中，在65 °C下雜交，然后用含0.1%SDS的2 X SSC緩沖液和含0.1%SDS的IXSSC緩沖液各洗膜一次。
[0017]根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的，所述核苷酸序列(ii^BSEQ ID N0.5或SEQ ID N0.6。
[0018]一種重組表達載體，在表達載體中插入了上述糖胺聚糖裂解酶的編碼基因。
[0019]上述表達載體選自大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體。
[0020]一種重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，在宿主細胞或細胞系中插入了上述糖胺聚糖裂解酶的編碼基因。
[0021]上述宿主細胞或細胞系選自大腸桿菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、枯草桿菌宿主細胞、乳酸菌宿主細胞、放線菌宿主細胞、絲狀真菌宿主細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
[0022]用于重組表達糖胺聚糖裂解酶HCDase的重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，可以是大腸桿菌宿主細胞(如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichiacoli DH5 α 等)、酵母菌宿主細胞(如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces Iactis 等)、枯草桿菌宿主細胞(如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等)、乳酸菌宿主細胞(如 Lactic acid bacteria C0CC101等)、放線菌宿主細胞(如Streptomyces spp.等)、絲狀真菌宿主細胞(如Trichodermaviride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等)、昆蟲細胞(如Bombyxmori, Antharaea eucalypti等)或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CHO,幼小倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等)。
[0023]上述糖胺聚糖裂解酶做為增強藥物的吸收或遞送成分在制備藥物中的應用。
[0024]有益效果
[0025]本發(fā)明制備的糖胺聚糖裂解酶對透明質(zhì)酸的比活為110，000U/mg、對硫酸軟骨素的比活為45，000U/mg ;酶活力是已知商品化糖胺聚糖裂解酶(如，CSaseABC, CSaseAC I和II等)的幾十到數(shù)百倍，可應用于醫(yī)藥及化妝品等領域，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1、糖胺聚糖裂解酶HCDase的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型；
[0027]圖2、重組糖胺聚糖裂解酶HCDase表達及純化情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)；
[0028]其中:M、蛋白質(zhì)分子量標準，條帶自上至下大小為116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD ;泳道1、對照菌株破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道2、重組菌破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道3、重組菌破壁后上清，上樣量10 μ L，泳道4、經(jīng)鎳柱純化的HCDase，上樣量10 μ Lo
[0029]圖3、P H值對糖胺聚糖裂解酶HCDase的活性影響曲線；
[0030]圖4、溫度對糖胺聚糖裂解酶HCDase的活性影響曲線；
[0031]圖5、溫度對糖胺聚糖裂解酶HCDase的穩(wěn)定性影響曲線；
[0032]圖6、pH值對糖胺聚糖裂解酶HCDase的穩(wěn)定性影響曲線；
[0033]圖7、金屬離子對糖胺聚糖裂解酶HCDase活性的影響柱形圖；
[0034]圖8、糖胺聚糖裂解酶HCDase降解透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素所得產(chǎn)物的HPLC分析圖；
[0035]圖9、糖胺聚糖裂解酶HCDase不同時間降解透明質(zhì)酸所得產(chǎn)物的HPLC分析圖。【具體實施方式】
[0036]以下實施例的闡述，是為了全面公開本發(fā)明如何實施的一些常用技術(shù)，而不是為了限制本發(fā)明的應用范圍。發(fā)明人已經(jīng)盡最大努力確保實施例中個參數(shù)的準確性(例如量，溫度，等等)，但是一些實驗誤差和偏差也應該予以考慮。除非另有說明，本發(fā)明中分子量是指重均分子量，溫度是攝氏度。
[0037]實施例1、糖胺聚糖裂解酶的獲得
[0038]挑取弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株接種到IOOmL液體培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、轉(zhuǎn)數(shù)為200rpm的條件下，搖床培養(yǎng)12小時，加入硫酸軟骨素使質(zhì)量濃度達到0.01%，繼續(xù)培養(yǎng)48h ;將培養(yǎng)液離心收集上清培養(yǎng)基，上清用終濃度為80%的硫酸銨沉淀，收集沉淀，沉淀用PBS緩沖液進行透析去除硫酸銨，制得糖胺聚糖裂解酶。
[0039]上述弧菌(Vibrio sp.)FC509，2014年03月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.8913，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。
[0040]上述液體培養(yǎng)基每升組分如下:
[0041]硫酸軟骨素5g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC130g、KH2P043g、K2HP047g、(NH4) 2S042g、MgSO4.7H205mg、FeSO4.7H202mg, pH 值為 7.2。
[0042]酶活力單位定義:每分鐘催化糖胺聚糖產(chǎn)生I μ moL不飽和雙鍵所需要的酶量。根據(jù)紫外法測糖胺聚糖裂酶酶活的方法(Yamagata, Saito et al.1968),測得Vibriosp.FC509菌株的液體培養(yǎng)基中酶活為3，000U/mL。
[0043]實施例2、弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株基因組DNA的提取
[0044]將弧菌(Vibrio sp.)FC509菌株接種至液體培養(yǎng)基(同實施例1)中，在30°C、200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl=0.8 ;取培養(yǎng)菌液40mL,在12，OOOrmp條件下離心25min,收集菌體沉淀，用20mL的溶菌酶緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0)洗滌，在12，OOOrmp條件下離心25min，收集菌體沉淀；
[0045]上述菌體沉淀中，每管加入溶菌酶緩沖液12.0mL,得到約14.0mL的菌液，分別加入濃度為20mg/mL的溶菌酶各560 μ L，其終濃度約800 μ g/mL ;冰浴1.0h后，37°C溫浴2h，至溶液粘稠；加入10wt%SDS0.82mL, 100mg/mL的蛋白酶K溶液60 μ L，52°C水浴l.0h ;加入Tris-平衡過的酚/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1) 15mL,輕輕顛倒混勻，至充分乳化；10，000g、4°C條件下離心10min，轉(zhuǎn)移上清，加入2.0mL的NaAc-HAc (pH5.2,3.0Μ)緩沖液，以及17.0mL的無水乙醇，混勻；用1.0mL的槍頭挑出絲狀DNA，轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP離心管中，以70%乙醇(貯于-20V),洗潘2次，微離心后棄上清；10，000g、4°C條件下離心3min，徹底棄掉上清；樣品于無菌工作臺中，酒精燈下風吹干燥；用無菌去離子水重懸溶解DNA樣品，4°C過夜，得到大分子量基因組DNA。
[0046]實施例3、弧菌(Vibrio sp.) FC509菌株基因組掃描及其序列分析。
[0047] 將實施例2制得的大分子量基因組DNA進行測序(美吉生物公司)。用NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbl.nlm.nih.gov/)上的軟件對測序結(jié)果進行分析。所用到的NCBI分析軟件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder, http://www.ncbl.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local AlignmentSearch Tool (BLAST, http://blast.ncbl.nlm.nih.gov/Blast.cgi)0
[0048]NCBI分析結(jié)果顯示Vibrio sp.FC509菌株基因組上攜帶一個糖胺聚糖裂解酶基因hcdase, hcdase基因編碼區(qū)長2436bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。與Vibriofischeri ES114 的全基因組序列(NCBI 注冊號:ΥΡ_206952.I)中 hyaluronate Iyase 基因的384個氨基酸有49%的同源性。
[0049]hcdase基因編碼的糖胺聚糖裂解酶HCDase由778個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所不，蛋白質(zhì)的理論分子量約為89kD。用Simple Modular ArchitectureResearch TooKSMART, http://smart.embl_heidelberg.de/)分析糖胺聚糖裂解酶 HCDase的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果顯示N端第I至第22個氨基酸是信號肽序列，第23-778位氨基酸序列屬于糖胺聚糖裂解酶超家族。用SWISS-MODEL同源建模服務器(http://swissmodel.expasy.0rg)對糖胺聚糖裂解酶HCDase的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行同源建模,最終得到的HCDase蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型如圖1所示。
[0050]在嚴格條件下與SEQ ID N0.1所示序列雜交且編碼具有糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分子，如核苷酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6所示的DNA分子。
[0051]將核苷酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6所示的DNA分子在含0.5%SDS的6 X SSC緩沖液(購自康為世紀公司)中，在65°C下雜交，然后用含0.1%SDS的2 X SSC緩沖液和含0.1%SDS的IXSSC緩沖液各洗膜一次。
[0052]上述SEQ ID N0. 5、SEQ ID N0.6所示的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)分子，氨基酸序列如SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示，其中SEQ ID N0.3的蛋白質(zhì)分子與SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)分子相比，具有2%的區(qū)別(氨基酸的替代)，SEQ ID N0.4的蛋白質(zhì)分子與SEQ IDN0.2所示的蛋白質(zhì)分子相比，具有3%區(qū)別(氨基酸的替代、缺失、插入)。
[0053]實施例4、HCDsae基因在大腸桿菌中的重組表達
[0054]以實施例2制得的大分子量基因組DNA為模板，進行PCR擴增。引物如下:
[0055]正向引物HCDase-F:GCCATGGATATGCAAGCGATGACCACCAGTTCACTG ；
[0056]反向引物HCDase-R:GCTCGAGTCGCACTGAAAATTGATAACTTTGTCC ；
[0057]正向引物下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶Nco I位點，反向引物下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶Xho I位點。Primerstar HS DNA聚合酶購自寶生物公司，PCR反應體系按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。
[0058]PCR 反應條件:94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，68°C 1.5min，35 個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
[0059]將PCR產(chǎn)物用Nco I和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的PCR產(chǎn)物。將購于美國Novagen公司的產(chǎn)物pET_22b載體用Nco I和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切載體大片段。Nco I和Xho I均購于寶生物公司，酶與底物反應的體系、溫度和時間均按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。
[0060]將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物與同樣經(jīng)過雙酶切pET_22b載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株后涂布于含有50 μ g/mL氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基固體平板上，37°C培養(yǎng)14h，挑取單克隆；將單克隆接入含有50 μ g/mL氨芐青霉素的液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒用正向引物HCDase-F和反向引物HCDase-R進行菌液PCR驗證，結(jié)果得到大小正確的擴增產(chǎn)物，初步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；接著將該重組質(zhì)粒送去生工生物公司測序，結(jié)果表明，在pET-22b的Nco I和Xho I酶切位點之間插入SEQ ID N0.1所示的hcdsae基因，且插入方向正確，所以進一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確，將該重組質(zhì)粒命名為pET22b-HCDase。
[0061]將pET22b_HCDase轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)(購自美國Novagen公司)，然后按照該公司提供的操作步驟進行重組糖胺聚糖裂解酶HCDase誘導表達。并用NiSepharose6Fast Flow (GE)凝膠對HCDase進行純化,純化條件按照GE公司的產(chǎn)品手冊操作。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測重組糖胺聚糖裂解酶HCDase的純化情況，結(jié)果如圖2所示，純化后的重組糖胺聚糖裂解酶HCDase在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預測的分子量相吻合。
[0062]實施例5、重組糖胺聚糖裂解酶HCDase的酶學性質(zhì)分析 [0063]pH和溫度對酶活性的影響
[0064]將質(zhì)量濃度為1%透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、HCDase酶液、不同pH值的150mMHAc-NaAc, NaH2PO4-Na2HPO4、Tris-HCl 緩沖液以及水(pH 范圍為 5.0 ~10.0)，按 2:1:3:4(體積比)的比例混合后，在30°C反應60min，按前述的紫外法測酶活力。結(jié)果顯示HCDsae在pH8.0時達到最大活力，表明HCDase的最適反應pH為8.0 (如圖3)。
[0065]在最適pH下，將質(zhì)量濃度為1%透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、HCDase酶液以及150mM NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH8.0)按2:1:3:4 (體積比)的比例混合，分別在不同溫度(0°C~90°C)反應lOmin，按前述的紫外法測酶活力。結(jié)果顯示HCDase在30°C時達到最大活力，表明HCDase的最適反應溫度為30°C (如圖4)。
[0066]pH和溫度對酶穩(wěn)定性的影響
[0067]將在不同溫度((TC~70°C)下熱處理Ih后的HCDase酶液與質(zhì)量濃度為1%透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物溶液按2:3 (體積比)的比例混合，然后在最適溫度和最適pH下測定剩余酶活，以不經(jīng)過熱處理的酶液酶活定義為100%相對活力(relativie activity),結(jié)果表明HCDase在低于60°C的溫度下具有較好的熱穩(wěn)定性(如圖5)。
[0068]將在30°C，不同的pH (pH5~10)預孵育Ih后的HCDase酶液與質(zhì)量濃度為1%透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物溶液按2:3 (體積比)的比例混合，然后在最適溫度和最適pH下測定剩余酶活，以不經(jīng)過pH處理的酶液酶活定義為100%相對活力(relativie activity),結(jié)果顯示在PH5-9的范圍內(nèi)，HCDase酶活仍保持60%以上，表明HCDase對pH值耐受范圍較廣(如圖6)。
[0069]金屬離子對HCDsae活性的影響
[0070]將質(zhì)量濃度為1%透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、HCDase酶液、150mM Tris-HCl緩沖液以及水按2:1:3:4 (體積比)的比例混合后，接著向反應體系中添加不同的金屬離子，添加的離子終濃度為ImM或10mM，然后在30°C反應60min，按前述的紫外法測酶活力。對照組為不加任何金屬離子時HCDase的活性(設定為100%),結(jié)果圖7所示。實驗結(jié)果顯示，K+、Na+、Fe2+、Mn2+ 能增加 HCDase 活性，Li+、Mg2+、Co2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+ 對 HCDase 活性基本無影響，Ag+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Zn2+等其他離子對酶活呈現(xiàn)抑制作用(圖7)。
[0071]實施例6、HCDase的酶活測定[0072]將質(zhì)量濃度為1%透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、HCDase酶液、150mM Tris-HCl緩沖液以及水按2:1:3 -A (體積比)的比例混合后，在最適溫度和最適pH下反應2-10min,按前述的紫外法測酶活力(Yamagata, Saito et al.1968),同時用購于康為世紀公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒測定HCDase酶液的蛋白含量，結(jié)果表明重組HCDase對透明質(zhì)酸的比活為110，000U/mg、對硫酸軟骨素的比活為45，000U/mg。
[0073]SEQ ID N0.3所示的蛋白對透明質(zhì)酸的比活為100，000U/mg、對硫酸軟骨素的比活為 40，000U/mg ；
[0074]SEQ ID N0.4所示的蛋白對透明質(zhì)酸的比活為89，000U/mg、對硫酸軟骨素的比活為 37，000U/mg ；
[0075]實施例7、HCDase降解糖胺聚糖降解產(chǎn)物的高效液相(HPLC)分析
[0076]將質(zhì)量濃度為1%透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、HCDase酶液、150mM Tris-HCl緩沖液以及水按2:1:3:4 (體積比)的比例混合后，在pH8.0，30°C條件下反應，選取不同酶解時間(0、0.25、l、5、15、30、120min)的產(chǎn)物進行HPLC分析。HPLC分析條件為凝膠柱:superdexpeptidel0/300GL (GE);流動相:0.2M 碳酸氫銨；流速:0.4mL/min ;檢測條件:UV232nm。
[0077]結(jié)果如圖8和圖9所示，從圖9可以看出隨著降解時間的增加，產(chǎn)物聚合度隨降解時間的延長而快速降低，最終轉(zhuǎn)變成二糖。該結(jié)果表明HCDase屬于內(nèi)切糖胺聚糖裂解酶，可被用于糖胺聚糖寡糖的制備以及糖胺聚糖構(gòu)效關系研究。
[0078]實施例8、糖胺聚糖裂解酶HCDase在藥物中的應用
[0079]糖胺聚糖裂解酶HCDase可以用于增強藥物的吸收或/和遞送，包括但不限于經(jīng)過皮膚途徑輔助藥物滲透。示例性的藥物包括皮質(zhì)類固醇如氫化可的松、潑尼松龍、倍氯米松丙酸酯、氟米松、去炎松、氯倍他索丙酸酯等；鎮(zhèn)痛藥和/或抗炎劑如對乙酰氨基酚、甲滅酸、氟芬那酸、雙氯芬酸、雙氯芬酸鈉、阿氯芬酸、羥布宗、保泰松、布洛芬、氟比洛芬、水楊酸、薄荷醇、樟腦、萘普生等；抗高血壓藥如吲哚洛爾、茚諾洛爾、心痛定等；抗生素如青霉素、四環(huán)素、土霉素、新霉素、紅霉素、氯霉素等；麻醉劑如利多卡因、苯佐卡因等以及其他藥物。
[0080]通過敷布，紗布，或其它皮膚涂抹途徑施用糖胺聚糖裂解酶。糖胺聚糖裂解酶溶液可以涂敷到合適的敷貼上(如5-6層紗布)。敷貼應覆蓋受損區(qū)域，且敷貼本身用蠟紙或繃帶固定。應用的制劑的量取決于損傷的面積，通常為5-lOOIU/cm2。敷貼應每天使用12-24小時，連續(xù)使用10-100天。
[0081]對于局部使用，溶液，懸浮液，凝膠劑，糊劑，軟膏，乳膏或糖胺聚糖裂解酶的其他配方(有或沒有另外的活性劑，都可以使用)。溶液等配方中包含制藥和化妝品領域用于局部使用可接受的稀釋劑，輔助劑和賦形劑的，這些其它配方主要包括緩沖劑如磷酸鹽，檸檬酸鹽，醋酸鹽和其它有機酸鹽、抗氧化劑如抗壞血酸、肽、蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，天然的或合成的油；氨基酸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，乳糖，甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA ;糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；無機鹽，如氯化鈉，和非離子表面活性劑如吐溫、聚乙二醇。
[0082]一種優(yōu)選的，糖胺聚糖裂解酶制劑是糖胺聚糖裂解酶HCDase的凍干粉末懸浮或溶解在含有0.1% -10%蔗糖、1% -20%甘油的溶劑中，溶液的pH保持在6.5-8.5范圍內(nèi)。[0083]糖胺聚糖裂解酶組合物可以通過口服給藥或腸胃外給藥，并且糖胺聚糖裂解酶組合物可以與合適的遞送載體結(jié)合后給藥。
[0084]可通過活性化合物與固體賦形劑的組合獲得用于口服使用的糖胺聚糖裂解酶藥物制劑。選擇上述的混合物加入合適的附助劑混合使用。如果需要的話，合適的賦形劑是碳水化合物或蛋白質(zhì)，例如糖、纖維素、牛血清白蛋白等。
[0085]糖胺聚糖裂解酶酶與藥物(如氫化可的松，抗生素，維生素)組合。以口服凝膠劑，膏劑，或懸浮液的形式通過靜脈內(nèi)，皮下或肌內(nèi)注射給藥；或以軟膏劑，乳膏劑，面罩局部給藥；以及用作化妝品輔助劑，用于增強皮膚的吸收。
[0086]說明書中涉及的參考文獻
[0087]1> Bradbury, E.J.and L.M.Carter (2011)."Manipulating the glialscar:Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury.^Brain ResearchBulletin84(4~5):306-316.[0088]2λ Bradbury, E.J., et al.(2002).^Chondroitinase ABC promotes functionalrecovery after spinal cord injury.〃Nature416(6881):636-640.[0089]3、Jiang，D.，et al.(2007).Hyal uronan in tissue injury and repair.AnnualReview of Cell and Developmental Biology.23:435-461.[0090]4、Karbownikj M.S.and J.Z.Nowak (2013)."Hyaluronan: Towards novelant1-cancer therapeutics."Pharmacological Reports65(5):1056-1074.[0091]5、KnudsonjC.B.and W.Knudson(1993)."Hyaluronan-binding proteinsin development,tissue homeostasis，and disease."FASEB journal: officialpublication of the Federation of American Societies for ExperimentalBiology7(13):1233-1241.[0092]6、Kwok，J.C.F.，et al.(2008)."Proteoglycans in the central nervoussystem:Plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinaseABC."Restorative Neurology and Neuroscience26(2-3):131-145.[0093]7、Lee, A.，et a 1.(2010).^Hyaluronidase." DermatologicSurgery36(7):1071-1077.[0094]8、Moon，L D.F.，et al.(2001)."Regeneration of CNS axons back to theirtarget following treatment of adult rat brain with chondroitinase ABC."NatureNeuroscience4(5):465-466.[0095]9λ Noble, P.W.(2002).^Hyaluronan and its catabolic products in tissueinjury and repair.^Matrix Biology21 (I):25-29.[0096]10、Ohya，T.and Y.Kaneko (1970)."Novel hy a I ur on i das e fromstreptomyces."Biochimica et biophysica acta!98 (3):607-609.[0097]I UPerrimonj N.and M.Bernfield (2000)."Specificities of heparan sulphateproteoglycans in developmental processes.〃Nature404(6779):725-728.[0098]12、Schuller，H.M.，et al.(1991)."Modulation of the uptake and metabolismof 4- (methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone by nicotine in hamsterlung."Cancer research51 (8):2009-2014.[0099]13λSugaharaj K., et al.(2003)."Recent advances in the structural biologyof chondroitin sulfate and dermatan sulfate.〃 Current Opinion in StructuralBiologyl3(5):612-620.[0100]14、Yamada，S.，et al.(2011)."Evolution of glycosaminoglycans: Comparativebiochemical study.^Communicative&Integrative Biology4 (2):150-158.[0101]15、Yamagata，T.，et al.(1968)."Purification and properties ofbacterial chondroitinases and chondrosulfatases."The Journal of biologicalchemistry243(7):1523-1535.[0102]16、Zaneveld，L J.，et al.(1973)."Properties of acrosomal hyaluronidasefrom bull spermatozoa.Evidence for its similarity to testicularhyaluronidase."The Journ al of biological chemistry248(2):564-570。
【權(quán)利要求】
1.一種糖胺聚糖裂解酶，其特征在于，氨基酸序列如(a)或(b)所示: Ca)氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示； (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有糖胺聚糖裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的糖胺聚糖裂解酶，其特征在于，所述氨基酸序列(b)如SEQIDN0.3 或 SEQ ID N0.4 所示。
3.一種糖胺聚糖裂解酶的編碼基因，其特征在于，核苷酸序列如(i )或(ii )所示: (i)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； (ii )在嚴格條件下與(i )限定的DNA序列雜交且編碼具有糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.如權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于，所述核苷酸序列(ii)中所述嚴格條件下，是指: 在含0.5%SDS的6 X SSC緩沖液中，在65°C下雜交，然后用含0.1%SDS的2 X SSC緩沖液和含0.1%SDS的I X SSC緩沖液各洗膜一次。
5.如權(quán)利要求4所述的編碼基因，其特征在于，所述核苷酸序列(ii)如SEQID N0.5或 SEQ ID N0.6。
6.一種重組表達載體，在表達載體中插入了權(quán)利要求3所述的糖胺聚糖裂解酶的編碼基因。
7.如權(quán)利要求6所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達載體選自大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體。
8.—種重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，在宿主細胞或細胞系中插入了權(quán)利要求3所述的糖胺聚糖裂解酶的編碼基因。
9.如權(quán)利要求8所述的重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于，所述宿主細胞或細胞系選自大腸桿菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、枯草桿菌宿主細胞、乳酸菌宿主細胞、放線菌宿主細胞、絲狀真菌宿主細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
10.權(quán)利要求1所述糖胺聚糖裂解酶在糖胺聚糖類寡糖制備及其自身作為增強藥物的吸收或遞送成分在制備藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK103923899SQ201410160095
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】李福川, 韓文君, 王文爽, 趙梅 申請人:山東大學