橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因 Br-or 功能標記的篩選及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or功能標記的篩選及應用，得到的橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or與白菜一號染色體上編碼類胡蘿卜素異構酶（Br-crtiso）的基因等位。對該基因在橙色和白色大白菜中的序列進行比對，發現在橙色葉球大白菜該基因的啟動子區域存在86bp的缺失，故根據二者啟動子結構的差異設計了InDel標記Br-pro，該InDel標記與橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or及其等位基因共分離，而且是大白菜中首個與類胡蘿卜素積累相關的營養品質型功能標記。利用該功能標記可以快速準確的從大量大白菜種質資源中篩選鑒別帶有橙色基因Br-or的材料，同時可以有目標的將橙色基因轉到普通大白菜品種中去，極大的加速了優質橙色大白菜品種的培育。
【專利說明】橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or功能標記的篩選及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于蔬菜育種及分子遺傳學領域，具體涉及一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-OT功能標記的篩選及應用。 【背景技術】
[0002]橙色葉球大白菜由于其獨特的顏色、較高的營養價值及鮮美的口感而備受人們的歡迎，而且橙色葉球大白菜在市場上的價格也都遠遠高于普通的白色葉球大白菜，具有極大的市場潛力和經濟價值。因此橙色葉球大白菜育種已經成為現代大白菜育種的重要內容之一，但是橙色大白菜的葉球顏色直到其結球末期才能充分表現出，而且得采用田間逐個剖球觀察，操作起來費時費力，極大的延緩了育種進程。因此為了加快橙色大白菜的育種速度，利用現代的分子生物技術，進行分子標記輔助育種十分必要。
[0003]到目前為止，橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因研究取得了一些進展，一些研究者已經對橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因進行了遺傳分析及基因定位。Matsumoto etal.(1998)構建了大白菜DH群體并用RFLP分子標記將控制大白菜橘紅心和花色遺傳的隱性單基因定位于一號連鎖群上，并且找到了三個與橘紅心基因連鎖的RFLP標記，其中與橘紅色基因的遺傳距離最近的是HC173標記，距離12cM。但是近幾年的一些研究將橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因定位于大白菜九號連鎖群上(Zhang et al.2008 ；Feng etal.2012 ；Zhang et al.2013),這與Matsumoto 的實驗結果完全不同。Zhang et al.(2008))開發了兩個與橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因連鎖的SCAR標記(SC0R204and SC0R127),其遺傳距離分別為5.0cM和10.0cM。Feng et al.(2012)構建了橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的遺傳圖譜，其中一側最近的SSR標記其遺傳距離為1.3cM，另一側最近的標記其遺傳距離為3.3cM。但是以上研究者所開發的分子標記離橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因都比較遠，很難對橙色葉球性狀進行準確的早期選擇，且都沒有獲得橙色葉球候選基因。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于，提供一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or的功能標記，利用簡單的PCR技術即可有效地對橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or進行基因型選擇，可以在苗期即可區分橙色和白色葉球大白菜，從而淘汰非目標植株，大大提高了橙色大白菜品種的育種效率。
[0005]為了實現上述任務，本發明采用如下的技術解決方案:
[0006]一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or功能標記的篩選方法，其特征在于，包括下列步驟:
[0007](I)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的定位
[0008]以橙色葉球大白菜“01S1024”為母本，白菜葉球大白菜“92S24”為父本雜交產生的F1群體，然后通過雜合單株單粒傳方式獲得其F2S4群體，利用包含1724個單株的F2S4群體，構建Br-or的高密度遺傳圖譜，利用大白菜全基因組測序結果，對該基因進行定位；
[0009](2)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的克隆及序列分析
[0010]Br-or基因物理圖譜表明橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因與大白菜一號染色體上編碼類胡蘿卜素異構酶的Br-crtiso基因等位，進一步克隆了橙色大白菜和普通大白菜的Br-crtiso基因，序列比較分析發現橙色大白菜與普通的白色大白菜Br-crtiso相比在啟動子區域發生了 86bp的缺失,該缺失位于基因轉錄起始密碼子上游368bp和454bp之間；
[0011]橙色大白菜Br-crtiso啟動子區域基因序列如下:
【權利要求】
1.一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-OT的功能標記篩選方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的定位 以橙色葉球大白菜“01S1024”為母本，白菜葉球大白菜“92S24”為父本雜交產生的F1群體，然后通過雜合單株單粒傳方式獲得其F2S4群體，利用包含1724個單株的F2S4群體，構建Br-or的高密度遺傳圖譜，利用大白菜全基因組測序結果，對該基因進行定位； (2)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的克隆及序列分析 Br-or基因物理圖譜表明橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因與大白菜一號染色體上編碼類胡蘿卜素異構酶的Br-crtiso基因等位，進一步克隆了橙色大白菜和普通大白菜的Br-crtiso啟動子區域基因序列，比較分析發現橙色大白菜與普通白色大白菜Br-crtiso相比在啟動子區域發生了 86bp的缺失，該缺失位于基因轉錄起始密碼子上游368bp和454bp之間； 所述的橙色大白菜Br-crtiso啟動子區域基因序列如下:
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的InDel標記Br-pro的擴增體系是以橙色和白色大白菜品種DNA作模板，按照下述PCR擴增條件和反應程序進行: ①PCR擴增條件: 20 μ IPCR反應體系為:模板DNA50ng，Taq酶1U，10 μ mol的上、下游引物各0.8 μ 1，0.32 μ I oflOmM dNTPs,2.0μ I oflOXPCR buffer, 1.2μ I of25mM MgCl2，用無菌蒸餾水補充反應體系至20 μ I ； ②PCR 反應程序為:先 94°C，5min ;然后 94°C，30s，56°C，Imin，72 °C，Imin，共 30 個循環；最后72°C，10min，4°C保存；PCR反應在Bio-Rad S100096型PCR儀中進行。
3.權利要求1或2所述方法得到的InDel標記Br-ρ--在篩選橙色和白色球葉大白菜中輔助育種的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，以待檢測大白菜材料DNA為模板，應用功能標記Br-pro的特異引物，按照其擴增體系進行擴增，擴增產物在2.5%的瓊脂糖膠電泳分離，如果擴增產物大小為213bp，則表明待檢測材料為橙色葉球，如果擴增產物為299bp，或者213bp和299bp，則待檢.測材料為白色葉球。
【文檔編號】C12N15/10GK103468676SQ201310388853
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月30日 優先權日:2013年8月30日
【發明者】張魯剛, 張俊祥, 李會霞 申請人:西北農林科技大學