專利名稱：與大白菜橙色葉球基因Br-or連鎖的SSR及InDel分子標記引物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蔬菜育種及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及與大白菜橙色葉球基因Br-OT連鎖的SSR及InDel分子標記引物的開發(fā)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，是起源于我國的主要蔬菜作物之一，與人們的日常生活密切相關(guān)，近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對大白菜品質(zhì)的要求日益高漲。因此，大白菜品質(zhì)育種受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者，育種家的重視。申請人:從1993年開始進行橙色大白菜育種，其配置的大白菜一代雜種“金冠I號”和“金冠2號”橙色大白菜，于2004通過陜西省審定，受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，同時也獲得了大白菜生產(chǎn)者和消費者的青睞。但是，橙色大白菜的顏色直到其結(jié)球末期才能表現(xiàn)出，而且得采用田間逐個剖球觀察，操作起來費時費力，極大的延緩了育種進程。因此為了加快橙色大白菜的育種速度，利用現(xiàn)代的分子生物技術(shù)，進行分子標記輔助育種十分必要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，多種基于DNA多態(tài)性的分子技術(shù)應(yīng)運而生，并廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究的各個領(lǐng)域。簡單序列重復(fù)(simplesequence repeats, SSR),又稱為微衛(wèi)星DNA (microsatellite，DNA)，是一類由1_6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成的DNA序列如(CA) n，(ATG) n，(TAGG) η等重復(fù)，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，由于重復(fù)次數(shù)的不同和重復(fù)程度的不完全造成了每個位點的多態(tài)性，包括SSR標記和EST-SSR標記兩種類型。其中，SSR標記具有共顯性、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、易于檢測等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標記輔助育種等研究領(lǐng)域(Tautz and Schlotterer 1994 ；Powell et al.，1996)。

插入/缺失多態(tài)性(Insertion/Deletion, InDel)標記是由于同一位點處的DNA序列在不同個體間發(fā)生了核苷酸片段的插入/缺失，根據(jù)目標位點兩側(cè)的序列設(shè)計特異引物進行PCR擴增，擴增片段的長度多態(tài)性即是InDel標記。InDel標記是根據(jù)同源序列之間的插入缺失差異來開發(fā)的，這對于基因組序列未知的作物而言開發(fā)具有一定的難度。InDel標記為一共顯性標記，具有較好的穩(wěn)定性及多態(tài)性豐富等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于品種的多態(tài)性分析(Katherine et al., 2008)、基因的精細定位及圖位克隆(Pan et al.,2008)等。因此，基于以上SSR及InDel標記的優(yōu)點，申請人利用大白菜的測序結(jié)果，開發(fā)并成功篩選出與大白菜橙色葉球基因Br-or緊密連鎖的分子標記，并構(gòu)建了 Br-or基因的分子遺傳圖譜，為克隆該基因及利用該分子標記進行橙色大白菜分子輔助育種，加快育種進程奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種與大白菜橙色葉球基因Br-or緊密連鎖的SSR及InDel分子標記引物，應(yīng)用該SSR及InDel分子標記引物，在苗期即可鑒定區(qū)分橙色葉球和白色葉球大白菜，從而淘汰非目標植株，大大提高選擇的效率。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案:與大白菜橙色葉球基因Br-or緊密連鎖的SSR及InDel分子標記引物，其特征在于，包括以下15個Br-SSR引物對和3個Br-1nDel引物對中的至少一對，即可將橙色與白色大白菜區(qū)分開；同時使用這多個標記能提高選擇的準確性。其中:引物對Br-1nDel (1)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F) :5 ; - TGAAATGACCCGTCTGTTGA — 3 ;下游引物(R):5 ; — TTGTCTTGCGAAGAGGATGT — 3 ;引物對Br-1nDel (2)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - TCAGATGAAGAGCGTAGGAG — 3 ;下游引物(R):5 ; — AAAAGAGGGAGACAAGATGC — 3 ;引物對Br-1nDel (3)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - TTCTTCTTCCTCACGCACTC — 3 ;下游引物(R):5 ; — GCTCGCCTTCTAAACTGAAT — 3 ;引物對Br-SSR (I)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - CCATCAACAAACTCAACCCTG — 3 ;下游引物(R):5 ; — CTCTGTTCATAAATACGCCTC — 3 ;引物對Br-SSR (2)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - GGTCCGCACAACATATCCTT — 3 ;下游引物(R):5 ' — TTGTAGCGGTGTCTAAGCAG — 3 ;引物對Br-SSR (3)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - ACGCTCACCGTGCTTCCTTG — 3 ;下游引物(R):5 ; — TTCACTTTGCCTTTGTTTCT — 3 ;其中所述引物對Br-SSR4的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - CCACTCCCTGTATTCCTTATC — 3 ;下游引物(R):5 ' — ATCACGTCTACTGGTGCTATG — 3 ;引物對Br-SSR (5)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - GTTTGGTCTGTTTCGGCACT — 3 ;下游引物(R):5 ' — GCCAAAACAAATCTGCTTGA — 3 ;所述引物對Br-SSR (6)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; -GTGGGATTTCTGGAGCTTTCA-3 ;下游引物(R):5 ' — AATCTAAACCTGGACCGCAAC — 3 ;引物對Br-SSR (7)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - AAGACACCGTGAGTATCTTCT — 3 ;下游引物(R):5 ; — TTTCGTCTATTCTTGCTGGAT — 3 ;引物對Br-SSR (8)的脫氧核糖核苷酸引物序列為:上游引物(F):5 ; - TGTGAATGTGCGAATTTTGA — 3 ;下游引物(R):
權(quán)利要求
1.與大白菜橙色葉球基因Br-OT緊密連鎖的SSR及InDel分子標記引物，其特征在于，包括以下15個Br-SSR引物對和3個Br-1nDel引物對中的至少一對，即可將橙色葉球與白色葉球大白菜區(qū)分開；其中: 引物對Br-1nDel (I )，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - TGAAATGACCCGTCTGTTGA - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — TTGTCTTGCGAAGAGGATGT - 3 ;； 引物對Br-1nDel (2)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - TCAGATGAAGAGCGTAGGAG - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — AAAAGAGGGAGACAAGATGC - 3 ;； 引物對Br-1nDel (3)的脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - TTCTTCTTCCTCACGCACTC - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — GCTCGCCTTCTAAACTGAAT - 3 ;； 引物對Br-SSR (I )，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - CCATCAACAAACTCAACCCTG — 3 ; 下游引物(R):5 ' — CTCTGTTCATAAATACGCCTC - 3 ;； 引物對Br-SSR (2)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為:` 上游引物(F):5 ; - GGTCCGCACAACATATCCTT — 3 ; 下游引物(R):5 ' — TTGTAGCGGTGTCTAAGCAG - 3 ;； 引物對Br-SSR (3)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 , — ACGCTCACCGTGCTTCCTTG - 3 ;； 下游引物(R):5 ' -TTCACTTTGCCTTTGTTTCT-3 ;； 引物對Br-SSR (4)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - CCACTCCCTGTATTCCTTATC - 3 ;； 下游引物(R):5 ' -ATCACGTCTACTGGTGCTATG-3 ;； 引物對Br-SSR (5)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - GTTTGGTCTGTTTCGGCACT - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — GCCAAAACAAATCTGCTTGA - 3 ;； 引物對Br-SSR (6)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - GTGGGATTTCTGGAGCTTTCA - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — AATCTAAACCTGGACCGCAAC - 3 ;； 引物對Br-SSR (7)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - AAGACACCGTGAGTATCTTCT - 3 ;； 下游引物(R):5 ' - TTTCGTCTATTCTTGCTGGAT - 3 ;； 引物對Br-SSR (8)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - TGTGAATGTGCGAATTTTGA - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — TCCTCCTACGCTCTTCATCT - 3 ;； 引物對Br-SSR (9)，其脫氧核糖核苷酸引物序列為: 上游引物(F):5 ; - TTACGCTCAAGTTCCTGAAT - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — GCGATGTACGCTAACGAGAT - 3 ;；
2.權(quán)利要求1所述的與大白菜橙色葉球基因Br-or緊密連鎖的SSR及InDel分子標記引物用于大白菜橙色球葉基因克隆及大白菜橙色葉球性狀輔助育種中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的大白菜橙色球葉基因克隆的方法是: PCR擴增大白菜基因組DNA的多態(tài)性片段大小為150bp、208bp、182bp、122bp、189bp、203bp、193bp、114bp、26 Ibp、168bp、123bp、200bp、175bp、234bp、212bp，分別為與大白菜橙色葉球基因Br-or連鎖的分子標記引物Br-SSR (1- 15)的PCR擴增產(chǎn)物；擴增大白菜基因組DNA的多態(tài)性片段大小為280bp、152bp、120bp，即為與大白菜橙色葉球基因Br_or連鎖的分子標記fc-1nDel (I — 3)的PCR擴增產(chǎn)物；其中，fc-SSR (8 一 15)及fc-1nDel(1- 3)11個標記位于fc-or的一側(cè)，與fc-or的遺傳距離分別為0.38cM、0.38cM、0.44cM、0.43cM、l.43cM、l.98cM、2.33cM、2.96cM、0.llcM、0.38cM、l.05cM ；而 Br-SSR (I — 7)7 個標記位于fc-or的另一側(cè)，與fc-or的遺傳距離分別為5.01cM、3.llcM、2.57cM、l.17cM、1.17cM、0.79cM、0.79cM，離 fc-or 最近的兩側(cè)標記分別為 fc-1nDel (I)和 Br-SSR (6)。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR擴增包括: 20 μ I PCR反應(yīng)體系為:模板DNA50ng，Taq酶1U，10 μ mol的上、下游引物各0.8 μ 1，·0.32 μ 1flOmM dNTPs，2.0 μ 1f 10 XPCR buffer, 1.2 μ lof25mM MgCl2，用無菌蒸餾水補充反應(yīng)體系至20 μ I ; PCR反應(yīng)程序為:先940C，變性5min ;然后94°C，變性30s, 56°C，復(fù)性Imin, 72°C，延伸lmin，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法是，將PCR擴增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后銀染顯色。
全文摘要
本發(fā)明公開了與大白菜橙色葉球基因Br-or緊密連鎖的SSR及InDel分子標記引物及應(yīng)用。該標記引物的獲得是以橙色大白菜和普通白色大白菜及其F2S4分離群體的基因組DNA為模板，通過480對SSR及InDel引物對F2S4中橙色葉球和白色葉球單株DNA混合池進行多態(tài)性引物篩選，然后通過對F2S4群體的單株進行分析，篩選與大白菜橙色葉球基因Br-or連鎖的分子標記，成功獲得了與Br-or基因連鎖的15個Br-SSR及3個Br-InDel標記引物，在第9連鎖群上(A09)構(gòu)建了大白菜橙色葉球基因Br-or的分子遺傳圖譜。連鎖分析發(fā)現(xiàn)Br-or基因兩側(cè)連鎖最緊密兩標記的遺傳距離分別為0.11cM和0.79cM，具有檢測方便，擴增穩(wěn)定，重復(fù)性和準確率高等優(yōu)點。為大白菜橙色葉球性狀的分子輔助選擇育種提供依據(jù)，加快育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK103103184SQ20131003187
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者張魯剛, 張俊祥, 馬曉彤, 李會霞, 張明科, 惠麥俠 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)