自絮凝酵母發酵木糖渣酶解液制備乙醇的方法
【專利摘要】自絮凝酵母發酵木糖渣酶解液制備乙醇的方法屬于生物化工【技術領域】，尤其涉及到一種新型的用于乙醇發酵的自絮凝酵母菌株以及利用該菌株發酵木糖渣酶解液生產乙醇的工藝路線。本發明以木糖生產過程中剩余的木糖渣作為纖維素原料，通過堿預處理酶解或直接酶解得到富含葡萄糖的酶解液，再利用從自然界中篩選得到的自絮凝酵母發酵酶解液制備乙醇。該酵母在發酵過程中可以自絮凝成毫米級顆粒，起到無載體固定化的效果，而且發酵后無需離心，通過自沉降即可分離菌體。與傳統的纖維素乙醇生產工藝相比，本工藝能夠有效簡化生產環節，減少生產成本，縮短生產周期，具有極高的應用價值和工業化潛質。
【專利說明】自絮凝酵母發酵木糖渣酶解液制備乙醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物化工【技術領域】，尤其涉及到一種新型的用于乙醇發酵的自絮凝酵母菌株以及利用該菌株發酵木糖渣酶解液生產乙醇的工藝路線。
【背景技術】
[0002]現代社會和工業發展對能源和資源的需求日益增加，開發可再生生物能源是維持社會可持續發展的必要條件。在新興能源領域，燃料乙醇作為唯一可大規模替代車用運輸燃料的生物能源，已成為世界各國競相開展研究的熱點。一代的燃料乙醇生產采用淀粉糖化發酵工藝。采用該工藝，每生產I噸淀粉，大約要消耗3噸谷物。中國是人口大國，以谷物作為原料進行乙醇生產勢必會造成糧食資源短缺問題。因此，采用富含纖維素的生物質資源作為原料生產二代燃料乙醇技術正在悄然興起。生物質資源除了纖維素外，還含有半纖維素和木質素等干擾纖維素水解的物質，需要將其去除才能被微生物利用。傳統的生物質到乙醇的生產包括預處理，纖維素分離，酶解糖化，生物發酵等步驟。這些復雜的過程增加了纖維素乙醇的生產成本，使二代燃料乙醇的生產仍停留在研發階段。
[0003]木糖渣是木糖生產過程中的副產物，而木糖通常是由生物質(玉米芯、甘蔗渣)中的半纖維素降解得到的。由于木糖生產中，90%以上半纖維素已經得到去除，因此木糖渣中的纖維素含量非常高(65%左右)，是理想的二代燃料乙醇的原料。目前，大規模應用于木糖生產的方法主要有酸水解法(ZL200480016169.0，ZL200710112975.3)和蒸汽爆破方法(ZL20131047000.3)。其中酸水解主要是用1.4-2.0 %的硫酸在0.11-0.15Mpa下水解90-150min ;蒸汽爆破則是先用0.1-0.2%的硫酸浸泡，再在0.4-1.8Mpa壓力下進行瞬時噴爆。上述兩種方法得到 的木糖渣在結構上有所差異，酸水解對于木質素和纖維素的交聯結構破壞程度較低，因此酸水解后的木糖渣較難直接被纖維素酶水解，通常需要堿液處理后才能糖化(ZL200910090186.3，ZL201210332435.7);而蒸汽爆破對于木質素的破壞程度較高，同時壓力差形成的剪切力能夠增加纖維素的比表面積和表面孔隙率，使蒸汽爆破后的木糖渣能夠直接被纖維素酶糖化。
[0004]目前用于燃料乙醇的發酵菌株集中在運動發酵單胞菌(ZL200880119451.X)以及釀酒酵母(201010111324.4)。然而上述菌株均為游離細胞，在連續發酵過程中易隨發酵液流出，從而降低了發酵罐中的細胞濃度，延長了平均發酵時間。采用吸附、包埋或交聯技術可以實現發酵菌株的固定化，從而解決游離細胞連續發酵的問題，但固定化材料的使用增加了乙醇發酵的成本，且操作復雜。自絮凝酵母是指在發酵過程中能夠自發形成毫米級松散顆粒的特殊菌株，利用自絮凝酵母可以實現燃料乙醇的無載體固定化發酵，從而有效提高乙醇生產效率，同時降低菌體分離成本。目前報道過的自絮凝酵母均是以具有自絮凝能力的粟酒裂殖酵母和乙醇發酵性能優良的釀酒酵母通過常規酵母細胞原生質體融合技術得到的融合株(ZL01138778.5)。本課題組經過長期的研究，從自然界中篩選到了一株天然的發酵生產乙醇的自絮凝酵母，經過ISSrDNA序列信息比對該酵母與Lachanceafermentati 具有 100 % 的同源性，故將其命名為 Lachancea fermentati Y309 (GenBankAccession N0.KJ451620)。該菌株目前已經保藏在國家知識產權局指定的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，登記號8844，保藏時間為2014年2月24日，保藏地址為中國科學研究院微生物研究所，北京市朝陽區北辰西路I號院3號。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于能夠提供一種具有自絮凝特征的乙醇發酵菌株，同時提供一種利用木糖渣酶解液發酵生產乙醇的方法。
[0006]一種發酵生產乙醇的自絮凝酵母,其拉丁文名為Lachancea fermentati Y309,保藏號為 CGMCC N0.8844。
[0007]一種利用木糖渣酶解液發酵生產乙醇的方法，包括以下步驟:
[0008](I)根據來源不同 本專利使用的木糖渣分為兩種，其中木糖渣A為玉米芯酸解殘渣，木糖渣B為玉米芯蒸汽爆破殘渣。對于木糖渣A，需要先將木糖渣在堿性溶液中進行預處理，然后再將預處理后的木糖渣A進行酶解糖化；對于木糖渣B，則直接將其進行酶解糖化。
[0009](2)步驟I中所述的堿性溶液為亞硫酸鈉和雙氧水的混合溶液，其中亞硫酸鈉的質量分數為1% _8%，雙氧水的質量分數為0.5% -2.5%。向IL堿性溶液中加入150-200g的木糖渣A。預處理溫度為80-150°C，預處理攪拌轉速為100-300rpm，預處理時間為l_3h。
[0010](3)步驟I中所述的預處理后的木糖渣A和木糖渣B的酶解糖化方法相同。使用PH4.8的醋酸或檸檬酸緩沖溶液作為酶解緩沖液，向IL緩沖液中加入100-150g木糖渣，再加入15-30FPU/g木糖渣用量的纖維素酶，酶解溫度為45-55 °C，酶解攪拌轉速為100-300rpm，酶解時間 66_72h。
[0011](4)酶解結束后，通過固液分離得到富含葡萄糖的木糖渣酶解液。利用高效液相色譜法測定酶解液中葡萄糖含量，計算葡萄糖收率。然后將木糖渣酶解液濃縮至葡萄糖濃度為 100-200g/L。
[0012](5)將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養基中，搖床溫度30_35°C，搖床轉速100-200rpm下培養18_24h。取上述種子液，按照5% -10% (v/v)的接種量接入到含有木糖渣酶解液的發酵培養基中進行厭氧發酵產生乙醇，發酵溫度30-35°C，發酵pH值控制在6.0-6.5，發酵周期為40-50h。
[0013](6)步驟5中所述的自絮凝酵母為實驗室自主篩選得到的Lachancea fermentatiY309。該自絮凝酵母菌落呈白色，圓形，表面有褶皺。液體培養過程中細胞會自發絮凝形成毫米級大小的顆粒，如附圖1所示。每升種子培養基組成為葡萄糖20g，酵母膏4g，蛋白胨3g，硫酸鎂lg。向IL步驟4的木糖渣酶解液中加入磷酸二氫鉀l_2g，硫酸銨2-4g，硫酸鎂0.1-1g配制成發酵培養基。
[0014](7)發酵結束后，將發酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發酵液分離。利用高效液相色譜分析發酵液中殘糖和乙醇含量，計算乙醇收率。
[0015]步驟(4)和步驟(7)中的葡萄糖收率和乙醇收率的計算公式為:
[0016]葡萄糖收率=酶解液中葡萄糖濃度(g/L) X酶解液體積(L)/木糖渣中纖維素的質量(g) χιοο% ；
[0017]乙醇收率=發酵液中乙醇濃度(g/L) X發酵液體積(L)/發酵培養基中葡萄糖濃度(g)/乙醇理論收率(0.51) X 100%
[0018]與現有技術相比，本專利具有以下優勢:
[0019](I)本發明使用的纖維素原料為木糖生產過程中的副產物木糖渣，由于其半纖維素已經大部分被去除，纖維素含量高，因此通過簡單處理即可酶解糖化。特別是玉米芯蒸汽爆破殘渣，可以直接被纖維素酶高效降解，從而進一步降低了酶解成本和設備投資。
[0020](2)本發明使用的自絮凝酵母在發酵過程中能自發形成毫米級大小的顆粒，從而在發酵罐中能夠實現無載體固定化，增加細胞密度，縮短發酵周期，尤其適用于大規模連續發酵過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為自絮凝酵母Lachancea fermentati Y309的掃描電鏡圖
【具體實施方式】
[0022]實施例1
[0023]向IL堿性溶液中加入150g的木糖渣A。其中堿性溶液中亞硫酸鈉的質量分數為2%，雙氧水的質量分數為1%。在80°C，150rpm下預處理3h后進行固液分離得到預處理后的木糖渣A。向lLpH4.8的醋酸緩沖溶液中加入100g預處理后的木糖渣A，再加入2000FPU的纖維素酶，在50°C，150rpm下酶解65h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為86.8 %。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為150g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.5g，硫酸銨3g，硫酸鎂0.5g配制成 發酵培養基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養基中，搖床溫度30°C，搖床轉速150rpm下培養22h。取上述種子液，按照8% (v/v)的接種量接入到發酵培養基中進行厭氧發酵產生乙醇，發酵溫度35°C，發酵pH值控制在6.5，發酵周期為45h。發酵結束后，將發酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發酵液分離。此時發酵液中殘糖濃度為4.8g/L,乙醇濃度為64.6g/L，乙醇收率為理論轉化率的84.5%。
[0024]實施例2
[0025]向IL堿性溶液中加入180g的木糖渣A。其中堿性溶液中亞硫酸鈉的質量分數為4%，雙氧水的質量分數為1.5%。在120°C，150rpm下預處理1.5h后進行固液分離得到預處理后的木糖渣A。向lLpH4.8的醋酸緩沖溶液中加入120g預處理后的木糖渣A，再加入3000FPU的纖維素酶，在50°C，200rpm下酶解70h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為89.3 %。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為180g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.Sg，硫酸銨3.6g，硫酸鎂Ig配制成發酵培養基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養基中，搖床溫度35°C，搖床轉速200rpm下培養20h。取上述種子液，按照10% (v/v)的接種量接入到發酵培養基中進行厭氧發酵產生乙醇，發酵溫度35°C，發酵pH值控制在6.5，發酵周期為50h。發酵結束后，將發酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發酵液分離。此時發酵液中殘糖濃度為7.3g/L,乙醇濃度為81.3g/L，乙醇收率為理論轉化率的88.6%。
[0026]實施例3
[0027]向IL堿性溶液中加入200g的木糖渣A。其中堿性溶液中亞硫酸鈉的質量分數為6%，雙氧水的質量分數為2%。在150°C，150rpm下預處理Ih后進行固液分離得到預處理后的木糖渣A。向lLpH4.8的檸檬酸緩沖溶液中加入150g預處理后的木糖渣A，再加入4500FPU的纖維素酶，在50°C，250rpm下酶解72h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為81.5%。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為120g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.2g，硫酸銨2.6g，硫酸鎂0.2g配制成發酵培養基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養基中，搖床溫度35°C，搖床轉速120rpm下培養24h。取上述種子液，按照5% (v/v)的接種量接入到發酵培養基中進行厭氧發酵產生乙醇，發酵溫度35°C，發酵pH值控制在6.0,發酵周期為40h。發酵結束后，將發酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發酵液分離。此時發酵液中殘糖濃度為2.6g/L,乙醇濃度為55.2g/L，乙醇收率為理論轉化率的90.2%。
[0028]實施例4
[0029]向lLpH4.8的醋酸緩沖溶液中加入100g的木糖渣B，再加入2000FPU的纖維素酶，在50°C，150rpm下酶解65h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為85.4%。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃度為150g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.58，硫酸銨38，硫酸鎂0.5g配制成發酵培養基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養基中，搖床溫度30°C，搖床轉速150rpm下培養22h。取上述種子液，按照8% (v/v)的接種量接入到發酵培養基中進行厭氧發酵產生乙醇，發酵溫度35°C，發酵pH值控制在6.5，發酵周期為45h。發酵結束后，將發酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發酵液分離。此時發酵液中殘糖濃度為4.4g/L,乙醇濃度為66.3g/L，乙醇收率為理論轉化率的86.7%。
[0030]實施例5
[0031]向lLpH4.8的檸檬酸緩沖溶液中加入120g的木糖渣B，再加入3000FPU的纖維素酶，在50°C，200rpm下酶解70h得到富含葡萄糖的酶解液，其葡萄糖收率為88.7%。將IL酶解液濃縮至葡萄糖濃 度為180g/L，再向其中加入磷酸二氫鉀1.Sg，硫酸銨3.6g，硫酸鎂Ig配制成發酵培養基。將甘油管保藏的自絮凝酵母接種到種子培養基中，搖床溫度35°C，搖床轉速200rpm下培養20h。取上述種子液，按照10% (v/v)的接種量接入到發酵培養基中進行厭氧發酵產生乙醇，發酵溫度35°C，發酵pH值控制在6.5，發酵周期為50h。發酵結束后，將發酵液靜置5秒鐘，自絮凝酵母自由沉降在容器底部，與發酵液分離。此時發酵液中殘糖濃度為6.9g/L,乙醇濃度為82.4g/L，乙醇收率為理論轉化率的89.8%。
[0032]本發明中上述實施例中的溫度及時間等參數均為較優的選擇，經實驗證明在超出上述實施例范圍外也能實現本發明的目的，因不能窮盡所有的數值，在此不再贅述。
[0033]以上實施例僅為本發明的示例性實施例，不用于限制本發明，本發明的保護范圍由權利要求書限定。本領域的技術人員可以在本發明的實質和保護范圍內，對本發明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應視為落在本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種發酵生產乙醇的自絮凝酵母，其拉丁文名為Lachancea fermentati Y309,保藏號為 CGMCC8844。
2.應用權利要求1所述的一種發酵生產乙醇的自絮凝酵母發酵生產乙醇的方法，包括以下步驟: 木糖渣分為兩種，其中木糖渣A為玉米芯酸解殘渣，木糖渣B為玉米芯蒸汽爆破殘渣；對于木糖渣A，需要先將木糖渣在堿性溶液中進行預處理，然后再將預處理后的木糖渣A進行酶解糖化；對于木糖渣B，則直接將其進行酶解糖化； 所述的堿性溶液為亞硫酸鈉和雙氧水的混合溶液，其中亞硫酸鈉的質量分數為1% _8%，雙氧水的質量分數為0.5% -2.5%;向IL堿性溶液中加入150-200g的木糖渣A;預處理溫度為80-150°C，預處理攪拌轉速為100-300rpm，預處理時間為l_3h ； 所述的預處理后的木糖渣A和木糖渣B的酶解糖化方法相同；使用pH4.8的醋酸或檸檬酸緩沖溶液作為酶解緩沖液，向IL緩沖液中加入100-150g木糖渣，再加入15-30FPU/g木糖渣用量的纖維素酶，酶解溫度為45-55°C，酶解攪拌轉速為100-300rpm，酶解時間66-72h ； 酶解結束后，通過固液分離得到富含葡萄糖的木糖渣酶解液；然后將木糖渣酶解液濃縮至葡萄糖濃度為100-200g/L ;向IL木糖渣酶解液中加入磷酸二氫鉀l_2g，硫酸銨2_4g，硫酸鎂0.1-1g配制成發酵培養基； 將自絮凝酵母接種到種子培養基中，搖床溫度30-35°C，搖床轉速100-200rpm下培養18_24h得到種子液；所 述的自絮凝酵母為Lachancea fermentati Y309 ;每升種子培養基組成為葡萄糖20g,酵母膏4g,蛋白胨3g,硫酸鎂Ig ； 取上述種子液，按照5% -10%的接種量接入到含有木糖渣酶解液的發酵培養基中進行厭氧發酵產生乙醇，發酵溫度30-35°C，發酵pH值控制在6.0-6.5，發酵周期為40_50h。
【文檔編號】C12P7/10GK104004669SQ201410168809
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】袁其朋, 范曉光, 霍辰青, 王世曾, 譚旭 申請人:北京化工大學