一種γ-亞麻酸產生菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種γ-亞麻酸產生菌及其應用，其分類命名為雅致小克銀漢霉（Cunningnamellaelegans）CLA-N2-V，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號：CCTCCM2014191，本發明以離子束誘變，搖瓶發酵篩選獲γ-亞麻酸產量高的菌株作為下一輪誘變的出發菌株，最終篩選出目標菌株CLA-N2-V，該菌株可較大幅度提高發酵產物中γ-亞麻酸組分并減少其他組分，且遺傳穩定性良好。該菌株利用玉米淀粉為發酵碳源，在5L發酵罐中發酵產γ-亞麻酸產量可達2273μg/mL，可應用于工業生產并大幅度提高發酵單位，具有重大的經濟應用價值。
【專利說明】-種γ-亞麻酸產生菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種亞麻酸產生菌及其應用。

【背景技術】
[0002] Υ -亞麻酸（Y-linolenic acid)是一系列多不飽和脂肪酸的一個重要分支。根 據脂肪酸碳鏈的長短不同，可分為長鏈脂肪酸，中鏈脂肪酸和短鏈脂肪酸，碳鏈長度為 18的γ -亞麻酸則屬于長鏈脂肪酸的一種。根據飽和度來判斷，又可將脂肪酸分為飽和 脂肪酸（Saturated fatty acid)、一價多不飽和脂肪酸（Monoursaturated fatty acid)、 多不飽和脂肪酸（Polysaturated fatty acid)三種。作為一種人體必不可少的脂肪酸， 它是人體中多個重要反應的中間產物，例如由亞油酸轉化，可生成前列腺素和白細胞介 素等的前體物質。由于對于中老年人，它可以起到增強其身體抵抗力的功效。
[0003] Y -亞麻酸（Y -linolenic acid)是一種人體必需的對其產生多種生理功能的多 稀不飽和脂肪酸。它是參與人體多種生化反應，并與人體代謝和生長發育息息相關的一 種重要中間物質。具有廣泛的醫用實用價值。目前國際上常用的方法是從植物種子油中提 取Y -亞麻酸；另一種是通過絲狀真菌發酵產生。而近些年，由于不受環境影響，成本相 對較低等特點，亞麻酸的發展方向越來越側重于工業化發酵的研究。本專利以亞 麻酸（Y -linolenic acid)生產菌種小克銀漢霉菌為研究 對象，從菌種誘變到菌種篩選，以及發酵工藝優化等方面對小克銀漢霉菌 )進行多方面的研究。
[0004] 目前，國內外已有利用霉菌進行亞麻酸發酵的報道，如專利CN103484382A 公開了一種高產亞麻酸的突變株及制備方法和應用，利用深黃被孢霉進行發酵生產 亞麻酸。但這些方法大都產量不高，且發酵產物中雜酸偏多，不利于后道提取分離。因 此研究一種適于工業生產的Y-亞麻酸生產途徑具有很好的研究意義和很大的發展空間。


【發明內容】

[0005] 為了解決目前的小克銀漢霉菌亞麻酸產量低，無法滿足工業化生產的問題， 本發明提供一種亞麻酸產生菌及其應用。
[0006] 本發明采用的技術方案如下： 一種亞麻酸產生菌，其分類命名為雅致小克銀漢霉 CLA-N2-V已于2014年5月8日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC NO: Μ 2014191,地址：中國武漢武漢大學。
[0007] 本發明所述的亞麻酸產生菌雅致小克銀漢霉 CLA-N2-V的誘變篩選方法是：將γ -亞麻酸出發菌株雅致小克銀漢霉（ CLA-N2,經離子束誘變后，通過搖瓶發酵篩選獲得γ -亞麻酸產量高的菌株作 為下一輪誘變的出發菌株，重復上述誘變過程，最后篩選出Y -亞麻酸產量高的目標菌株 雅致小克銀漢霉CLA-N2-V，形態學及生理生化學特征如下： 菌落顏色：灰白色。
[0008] 需氧方式：好氧生長。
[0009] 菌落大小：6?8 mm η
[0010] 適宜生長溫度：27°C。
[0011] 適宜生長 pH :6. 5。
[0012] 菌體形態：圓形菌落，無光澤。
[0013] 本發明所提供的亞麻酸產生菌的誘變方法，具體步驟如下： (a)、單孢子懸浮液制備：將出發菌株雅致小克銀漢霉() CLA-N2孢子制成孢子懸液，鏡檢無細胞重疊。
[0014] (b)、低能氮離子注入誘變：取0. lmL的步驟（a)中單孢子懸液均勻涂布于無菌空 平皿上，以無菌風吹干，在l(Tl8KeV、注入劑量為40 X 1014?240 X 1014ions/cm2下，對雅致小 克銀漢霉CLA-N2進行氮離子注入，離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環境下用lmL無菌水 洗脫，涂布到固體培養基上，在26?30°C下倒置培養24?48h。
[0015] (c)、誘變菌株的篩選： 篩選：將步驟（b)誘變得到的固體單菌落接入種子培養基，在培養溫度26~30°C， 20(T220rpm搖床轉速下擴大培養24~48h后，按5~15%(v/v)的接種量接入發酵培養基。在 26?30°C、20(T220rpm搖床轉速下培養192h下搖床，取3mL發酵液于離心管中，3500rpm高 速離心lOmin，棄上清液，加入甲醇至9mL，在快速混勻器上震蕩30min ;3500rpm高速離心 lOmin，取上清液測定發酵液中γ -亞麻酸含量。取發酵液γ -亞麻酸含量最高的菌株作為 下次誘變的出發菌株，重復步驟（a) ~(c)，直至篩選出亞麻酸產量高的目標菌株雅致 小克傲漢霉 QCunningnamel laelegans) ClA-WZ-N。
[0016] 步驟（b)中所用的固體培養基為葡萄糖2.0%，馬鈴薯2%，瓊脂1.5%，pH 6. 5,其 余為水。
[0017] 步驟（b)中低能氮離子注入，優選誘變能量為16KeV，誘變劑量為160X1014ions/ cm2。
[0018] 步驟（c)中所用的種子培養基為：碳源4· 0%?6· 0%、氮源1 · 0%?3· 0%、無機鹽 0. 1°/Γ〇. 6%，其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖和玉米淀粉中的一種或兩種的 混合；所述氮源為酵母粉、大豆粉中的一種或兩種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽 中的一種或幾種的混合。
[0019] 步驟（c)中所用的發酵培養基為：碳源8.09Γ10.0%、氮源L09T3.0%、無機鹽 0. 19Π ). 6%，其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米淀粉中的一種或兩種的混 合；所述氮源為酵母粉、大豆粉中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽中 的一種或幾種的混合。
[0020] 上述篩選出的雅致小克銀漢霉CLA-N2-V在發酵生產 亞麻酸中的應用， 具體步驟如下： 1) 、固體培養：將雅致小克銀漢霉CLA-N2-V接種于固體培 養基上，培養溫度為27°C，培養時間為48h ; 2) 、種子培養：將步驟1)固體培養的雅致小克銀漢霉（) CLA-N2-V接種到種子培養基中，培養溫度為27°C，200rpm轉速下培養48h ; 3)、發酵培養：將步驟2)中的種子培養液接種到發酵培養基中，接種量為5~15%(v/v)， 培養溫度為27°C，200rpm轉速下發酵192h。
[0021] 步驟1)所述固體培養基包含如下質量百分數的組分：碳源2. 09Γ4.0%、氮源 0. 59Γ1. 5%、瓊脂1. 29Γ1. 8%、其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖和玉米淀粉中 的一種或兩種的混合；所述氮源為麥芽浸粉和酵母膏中的一種或兩種的混合。
[0022] 步驟2)所述種子培養基包含如下質量百分數的組分：碳源4. 09Γ6.0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、無機鹽0. 39Π ). 9%，其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖和玉米淀粉 中的一種或兩種的混合；所述氮源為酵母粉、大豆粉中的一種或兩種的混合；所述無機鹽 為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽中的一種或幾種的混合。
[0023] 步驟3)所述發酵培養基包含如下質量百分數的組分：碳源8. 09Γ15. 0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、無機鹽0. 39Γ1. 5%，其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米淀粉 中的一種或兩種的混合；所述氮源為酵母粉、大豆粉中的一種或幾種的混合；所述無機鹽 為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽中的一種或幾種的混合。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1 :實施例2發酵液中Y -亞麻酸色譜圖。
[0025] 有益效果 本發明采用離子束誘變，最終篩選獲得一株亞麻酸產生菌雅致小克銀漢霉 CLA-N2-V，可較大幅度提高發酵產物中γ-亞麻酸組分且遺傳 穩定性好，菌株連續傳代5次后效價并無明顯變化。在5L發酵罐中，以廉價玉米淀粉為碳 源，發酵產亞麻酸產量達到2273 μ g/mL，相比原始出發菌株提高了 21. 9%，同時也超過 國內外目前有報道的發酵產量最高的菌株(產量在1800 μ g/mL左右)。本技術發明完全符 合工業化Y -亞麻酸生產菌株的誘變和篩選需要，并可應用于工業化發酵生產，具有重大 的社會意義和經濟價值。

【具體實施方式】
[0026] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0027] 實施例1 本實施例說明將雅致小克銀漢霉CLA-N2 進行誘變的方法。
[0028] 以實驗室保存的雅致小克銀漢霉CLA-N2為出發菌 株，進行誘變，具體步驟如下： (a)、單孢子懸浮液制備：取26~30°C恒溫固體培養24~48h的小克銀漢霉菌加無菌水 10mL，刮洗下孢子傾于帶有玻璃珠的250mL三角瓶內震蕩搖勻20min(250rpm)，打散孢子 鏈，三層脫脂紗布過濾，濾液用血球計數板計數，鏡檢無細胞重疊者進行低能氮離子注入。
[0029] (b)、低能氮離子注入誘變：取0. lmL的步驟（a)中孢子懸液均勻涂布于無菌空 平皿上，鏡檢無細胞重疊者進行低能氮離子注入。本實驗低能氮離子注入機為多功能注入 機。分別在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下對小克銀漢霉菌進行離子注入。注入劑量 分別為 40X 1014ions/cm2、80X 1014ions/cm2、120X 1014ions/cm2、160X 1014ions/cm2、 200X 1014ions /cm2、240X 1014ions/cm2。靶室真空度為 10_3Pa，以 5S 脈沖式注入，間隔 15s，靶室內放置不接受注入的對照樣。確定誘變能量16KeV，誘變劑量160X1014ion S/cm2 為最佳低能氮離子注入誘變條件。離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環境下用lml無菌水 洗脫，涂布到固體培養基上，在24?30°C下倒置培養36飛Oh。
[0030] (C)篩選：將步驟（b)誘變得到的固體單菌落接入種子培養基，在培養溫度 26?30°C，20(T220rpm搖床轉速下擴大培養24?48h后，按5?15%(v/v)的接種量接入發酵培 養基。在26~30°C、20(T220rpm搖床轉速下培養192h下搖床，取3mL發酵液于離心管中， 3500rpm高速離心lOmin，棄上清液，加入甲醇至9mL，在快速混勻器上震蕩30min ;3500rpm 高速離心lOmin，取上清液測定發酵液中γ-亞麻酸含量。取發酵液γ-亞麻酸含量最高的 菌株作為下次誘變的出發菌株，重復步驟（a) ~(c)，直至篩選出番茄紅素產量高的目標菌 株雅致小克銀漢霉)CLA_N2_V。
[0031] 步驟（b)中所用的固體培養基為葡萄糖2.0%，馬鈴薯2%，瓊脂1.5%，pH 6. 5,其 余為水。
[0032] 步驟（c)中所用的種子培養基為：葡萄糖6. 0%，酵母粉1.0%，NaN03 0. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 3%, MgS04 · 7H20 0· 03%，pH 6· 5,其余為水。
[0033] 步驟（c)中所用的發酵培養基為：葡萄糖10. 0%，酵母粉1. 5%，NaN03 0. 5%， ΚΗ2Ρ04 0· 3%, MgS04 · 7H20 0· 03%，pH 6. 5,其余為水。
[0034] 實施例2本實施例說明高產菌株雅致小克銀漢霉CLA-N2-V發酵生產γ -亞麻酸 的工藝。
[0035] 本實施例所用的培養基配方： 固體培養基為：葡萄糖2. 0%，馬鈴薯2%，瓊脂1. 5%，pH 6. 5,其余為水； 種子培養基為：葡萄糖 6. 0%，酵母粉 1. 0%，NaN03 0. 5%, ΚΗ2Ρ04 0. 3%, MgS04 · 7H20 0.03%，pH 6.5,其余為水； 發酵培養基為：葡萄糖 10. 〇%，酵母粉 1. 5%，NaN03 0. 5%, ΚΗ2Ρ04 0. 3%, MgS04 · 7H20 0.03%，pH 6.5,其余為水； 將小克銀漢霉菌CLA-N2-V接種于固體培養基上，培養溫度為27°C，培養時間為48h ;將 固體培養的小克銀漢霉菌CLA-N2-V培養物接種至種子培養基中，250mL培養瓶中裝液量為 30mL，培養溫度為27°C，200rpm轉速下培養48h ;將種子培養液接種到發酵培養基中，初始 pH為6. 5,接種量為10%(v/v)，500mL培養瓶中裝液量為50mL，培養溫度為27°C，200rpm搖 床轉速下培養發酵168h。發酵產γ-亞麻酸產量為2097 μ g/mL，相對于原始出發菌株提高 了 18. 6%。
[0036] 實施例3本實施例說明突變株的形態學及生理生化學特征和傳代穩定性 雅致小克銀漢霉CLA-N2-V，形態學及生理生化學特征如下：菌落顏色：灰白色；需氧方 式：好氧生長；菌落大小：6~8mm ;適宜生長溫度：27°C ;適宜生長pH :6. 5 ;菌體形態：圓形菌 落，無光澤。
[0037] 在以葡萄糖為碳源的發酵培養基中（發酵培養條件同實施例2)，檢測突變株小克 銀漢CLA-N2-V產量，觀察期傳代穩定性，菌株傳代發酵試驗結果如表1所示： 表1高產突變菌株小克銀漢CLA-N2-V穩定性試驗

【權利要求】
1. 一種γ-亞麻酸產生菌，其分類命名為雅致小克銀漢霉 CLA-N2-V，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC NO: Μ 2014191。
2. 權利要求1所述的Υ-亞麻酸產生菌在發酵生產Υ-亞麻酸中的應用。
3. 根據權利要求2所述γ-亞麻酸產生菌在發酵生產γ-亞麻酸中的應用，其特征在 于包含如下步驟： 1) 、固體培養：將雅致小克銀漢霉CLA-N2-V接種于固體培 養基上，培養溫度為27°C，培養時間為48h ; 2) 、種子培養：將步驟1)固體培養的雅致小克銀漢霉（ CLA-N2-V接種到種子培養基中，培養溫度為27°C，200rpm轉速下培養48h ; 3) 、發酵培養：將步驟2)中的種子培養液接種到發酵培養基中，接種量為5~15%(v/v)， 培養溫度為27°C，200rpm轉速下發酵168?192h。
4. 根據權利要求3所述γ-亞麻酸產生菌在發酵生產γ-亞麻酸中的應用，其特征在 于：步驟1)所述固體培養基包含如下質量百分數的組分：碳源2. 09Γ4. 0%、氮源0. 59Γ1. 5%、 瓊脂1. 29Γ1. 8%、其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖和馬鈴薯中的一種或兩種 的混合；所述氮源為馬鈴薯、麥芽浸粉和酵母膏中的至少一種。
5. 根據權利要求3所述γ-亞麻酸產生菌在發酵生產γ-亞麻酸中的應用，其特征在 于：步驟2)所述種子培養基包含如下質量百分數的組分：碳源4. 09Γ6. 0%、氮源1. 09Γ3. 0%、 無機鹽0. 39Π ). 9%，其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖和玉米淀粉中的一種 或兩種的混合；所述氮源為酵母粉、大豆粉中的一種或兩種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀 鹽、鎂鹽中的一種或幾種的混合。
6. 根據權利要求3所述γ-亞麻酸產生菌在發酵生產γ-亞麻酸中的應用，其特 征在于：步驟3)所述發酵培養基包含如下質量百分數的組分：碳源8. 09Γ15. 0%、氮源 1. 09Γ3. 0%、無機鹽0. 39Γ1. 5%，其余為水，pH 6. (Γ6. 5 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米淀粉 中的一種或兩種的混合；所述氮源為酵母粉、大豆粉中的一種或幾種的混合；所述無機鹽 為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽中的一種或幾種的混合。
【文檔編號】C12R1/645GK104195049SQ201410243977
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年6月4日 優先權日:2014年6月4日
【發明者】虞龍, 張旭琛, 黃思思, 陳曉雙 申請人:南京工業大學