水稻缺鐵誘導啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種水稻缺鐵誘導啟動子及其應用，具有：i)SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQID?NO.1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本發明還提供含有上述啟動子的載體、轉基因細胞系以及工程菌。還提供上述啟動子在啟動目的基因表達中的應用。還提供上述啟動子在轉基因植物中的應用；方法為將重組載體導入所述目的植物，從而在所述目的植物中用所述DNA片段啟動GUS基因的表達。本發明有益的效果是：本發明啟動子的發現及其功能的闡釋，將對水稻耐受缺鐵逆境生理機制的研究，有效地開展水稻抗缺鐵環境脅迫及富鐵育種均具有重要理論和實踐意義。
【專利說明】水稻缺鐵誘導啟動子及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學、基因工程【技術領域】，主要是一種水稻缺鐵誘導啟動子及 其應用。

【背景技術】
[0002] 鐵是植物生長必需的營養元素之一。鐵元素作為許多重要酶和蛋白質的組成成分 參與了生命活動中最基本的生化反應，如光合作用和呼吸作用。缺鐵是各種人類微量元素 缺乏癥中最普遍的一種，據2002年世界衛生組織統計，全世界有近半數的人口受鐵營養缺 乏的困擾（如缺鐵性貧血病，嬰幼兒的智力和體能發育障礙等）。因而提高和改良糧食作物 中鐵元素含量變得尤為重要。
[0003] 土壤中總鐵含量很高，但可被植物吸收利用的有效鐵含量卻很低。其中的絕大部 分都以可溶性極低的三價鐵形式存在，因而使得植物常常表現出缺鐵失綠癥狀。在農業生 產中，鐵素缺乏一直是限制作物生長發育以及作物產量和品質提高的主要因子之一。植物 主要以兩種方式吸收鐵：策略I和策略II。策略II是禾本科植物吸收土壤鐵素的主要途 徑，禾本科植物的根系向環境中分泌一種麥根酸類（MAs)天然鏊合劑，與環境中的Fe(III) 鏊合形成Fe (III) -MAs復合物，然后通過植物特殊的轉運載體YS1被植物所吸收。在缺鐵 條件下，禾本科植物能增加 MA合成和分泌。禾本科以外的植物都通過氧化還原的策略I方 式來吸收鐵。
[0004] 水稻是重要的糧食作物之一，為世界一半以上的人口提供了食物來源。研究發現， 水稻的根不但通過策略II途徑吸收Fe (III)，水稻的根也具有吸收Fe (II)的能力。由于水 稻中并未發現有功能的Fe(III)還原酶活性，水稻有可能對Fe(II)是直接轉運吸收的，這 可能與水稻長期適應淹水的特殊生長環境有關。


【發明內容】

[0005] 本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種水稻缺鐵誘導啟動子及其應用，該 啟動子含有IDE1和IDE2等缺鐵響應元件，對于水稻耐缺鐵分子機制的研究，以及水稻耐缺 鐵分子育種具有重要的理論與實踐意義。
[0006] 為了實現上述的目的，本發明采用了以下的技術方案：本發明的水稻缺鐵誘導啟 動子，該啟動子DNA片段具有：i)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序 列。
[0007] 本發明還提供含有上述啟動子的載體、含有上述啟動子的轉基因細胞系以及含有 上述啟動子的工程菌。
[0008] 本發明還提供上述啟動子在啟動目的基因表達中的應用，所述目的基因的表達為 缺鐵誘導表達。
[0009] 本發明還提供上述啟動子在轉基因植物中的應用，如培育耐缺鐵的轉基因水稻， 所述目的植物為水稻；所述目的基因為GUS基因；所述缺鐵條件為不供鐵的水稻培養液；方 法為將重組載體導入所述目的植物，從而在所述目的植物中用所述DNA片段啟動GUS基因 的表達。
[0010] 本發明有益的效果是：本發明啟動子的發現及其功能的闡釋，將對水稻耐受缺鐵 逆境生理機制的研究，有效地開展水稻抗缺鐵環境脅迫及富鐵育種均具有重要理論和實踐 意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為real-time PCR方法檢測在正常供鐵和缺鐵脅迫條件下基因的表達。
[0012] 圖2為本發明實施例中構建的啟動子載體圖譜。
[0013] 圖3為本發明實施例中轉基因水稻的葉片、根尖和側根的GUS組織染色結果；其 中，A為正常供鐵培養條件，B缺鐵脅迫條件。

【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明：
[0015] 以下實施例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規方法進行或按照制造生產廠 商的使用說明。
[0016] 水稻缺鐵誘導基因啟動子的發現
[0017] 1. 1水稻缺鐵誘導基因的發現
[0018] 本發明的發明人先前對正常供鐵和缺鐵脅迫培養的水稻為材料進行芯片（芯 片Affimetrix公司的水稻全基因組芯片GencChip? Rice Genome Array)雜交，在芯片 數據分析的基礎上，篩選缺鐵誘導相關基因 （Cheng LJ等Mutation in nicotianamine aminotransferase stimulated the Fe(II)acquisition system and led to iron accumulation in rice. Plant Physiology2007, 145:1647-1657 ；Zheng LQ 等 Physiological and transcriptome analysis of iron and phosphorus interaction in rice seedlings. Plant Physiology2009, 151: 262-274·)。根據基因的序列設計定量 PCR 分析的特異性引物，從圖1中可以看出，在缺鐵處理條件下，基因在水稻葉片和根中的表達 量明顯增加。
[0019] 1. 2水稻缺鐵誘導啟動子的發現
[0020] 按照水稻數據庫網站（http://rice. plantbiology. msu. edu/index. shtml)公布 的水稻基因組序列，設計其上游啟動子序列的PCR擴增引物，并在兩條引物的5'端分別添 加酶切位點序列和保護堿基。引物序列分別為：pr⑶S-F :5' -gcgtcgacTCTTCTGACTCCTTTT ACTCTAC-3' ；pr⑶S-R :5' -cgggtaccCACGCTGCCCCAGTACGTACC-3'。以日本晴水稻的基因組 DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件為熱啟動95°C 5分鐘；然后95°C 20秒，60°C 30秒， 72°C 2分鐘，30個循環后72°C延伸10分鐘。獲得的PCR產物進行測序，結果表明PCR產物 具有SEQ ID NO. 1所示的2Kb核苷酸片段。
[0021] 對啟動子序列進行分析，發現在其區域內含有與缺鐵脅迫相關的順式作用元件 IDE1 和 IDE2。
[0022] 實施例：缺鐵誘導啟動子轉基因水稻的獲得
[0023] 2· 1生物材料
[0024] 2· 1· 1植物材料
[0025] 水稻轉基因受體材料為粳稻日本晴
[0026] 2. 1. 2菌株和載體
[0027] 使用的農桿菌菌株為ΕΗΑ105,載體為pCAMBIA1300。
[0028] 2. 2 方法
[0029] 2. 2. 1缺鐵誘導啟動子植物表達載體的構建
[0030] 用Sal I和Κρη I (ΝΕΒ公司）酶切實施例1回收的PCR產物。
[0031] 通過Sal I和Κρη I雙酶切植物表達載體pCAMBIA1300,回收載體骨架。
[0032] 用T4DNA連接酶連接上述酶切的PCR產物與載體骨架。對重組質粒進行測序，所 構建的pCAMBIA1300-Pr〇-GUS載體圖譜如圖2所示。
[0033] 2. 2. 2轉基因水稻的獲得
[0034] 選取成熟飽滿的日本晴種子脫殼后，經消毒濾干后接種到愈傷誘導培養基上進行 誘導培養。選擇外觀顏色嫩黃、生長良好的顆粒狀愈傷組織用于遺傳轉化。采用農桿菌介 導法將pCAMBIA1300-Pr〇-GUS轉入水稻愈傷組織中，用含有乙酰丁香酮和0D600為0. 5的 農桿菌的AAM轉化液進行浸泡，將浸泡過的愈傷組織轉至共培養基上暗培養3天。然后轉 移至選擇培養基上培養，每10天繼代一次。30天后將篩選出的抗性愈傷轉至分化培養基 上分化培養40天。將分化出的綠色小苗移至生根培養基上生根并進行煉苗。當幼苗長至 10cm高時，取出幼苗并用無菌水洗凈根部附著的固體培養基。
[0035] 培養基配制如下：
[0036] 誘導培養基配方為：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 3g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH調至5. 8后加入植物凝膠 4g/L。
[0037] 共培養基配方為：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 6g/L水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，pH調至5. 2后 加入植物凝膠4g/L。滅菌后，加入乙酰丁香酮200 μ mol/L。
[0038] 選擇培養基配方為：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 0mg/L2, 4-D+O. 5g/L L-谷 氨酰胺+2. 8g/L L-脯氨酸+0. 6g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH調至5. 8后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后加入30mg/L潮霉素和400mg/L頭孢。
[0039] 分化培養基配方為：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+0. 5g/L L-谷氨酰胺+0. 5g/ L L-脯氨酸 +lg/L 水解酪蛋白 +3. 0mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+30g/L 鹿糖 +20g/L 山梨醇，pH 調至5. 8后加入植物凝膠4g/L。
[0040] 2. 2. 3轉基因水稻缺鐵誘導⑶S目的基因的表達
[0041] 取生長7天的轉基因水稻分別進行正常供鐵和缺鐵脅迫培養7天，隨后分別取葉 片和根部材料，同時進行GUS組織染色。結果如圖3所示，轉基因植株在正常培養時沒有 GUS表達活性，而缺鐵處理后植株葉片和根中的GUS表達活性很強，表明該啟動子能調控目 的基因在植株受到缺鐵脅迫時表達。
[0042] GUS 染色液配方為：100mmol/L 磷酸緩沖液（ρΗ7· 0)，5mmol/L EDTA，0· 5mmol/L 鐵 氰化鉀，〇· 5mmol/L 亞鐵氰化鉀，0· 5% Triton Χ-100,0· 2mg/L X-gluc，以水配制。
[0001] 說明書核苷酸及氨基酸序列表 序列表 <1〗〇>浙江6'農業利學院 <120)水稻缺鐵誘導啟動子及其應用 <130'> 無 <140> <141> <160> 1 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> 7_)C稻(Oryza. sativa ssp. japonica) <400> 1 tctlct^act ccttttautc tactctcltc ctattctagt atacaatata i；tacaaiaga 60 gcctcttata atttatctca a^cttggaag Tgtatgttga agtgagtgag atgat^tcct 120 tatatagggg taggtatgac ggttggcgaa gggaaaatgt ccgaagtgcc ctccaaccgt 180 catcagggat gtatctggga cgtccacgcc aaaccccaca tccaacggtg gaggtggtgg 240 ttcggccgna cc1ggctagg cctat ctd^c ctggcciltd gcccttgi tc tcccctggtc 300 ctcctctatt cattcttcgg tattttggRt tgattcact^ atgttttcat gaaattcaca 360 acccatcctt gtatggatac ataattctcc tcactttagt ctagatttcc tccaacatca 420 gggcttatct tctgcataca aatatacacc aacacttgtg gaatatgtgs gatigagcac 480 ctatcactat ^tta^atutt ttattatccu aactttatgc agat^ttg^c ngtac^aaat 540 cgcaatttaa caactgtcaa cartcgacgc ttraatrctt cttgagatgg tatgatatgg 600 tctttaggta atctaatttg tttttctt.gc aaaagataat. caaagatctt atcacacttg 660 gccacatcaa aactatactt aacctcactt tgcggatttt tacgaggagt ctgcattaaa 720 ttagagcaag cagaaggctt atttttgtta gtccatgacc acicagcaac atacatatca 780 IgaLcacccL caccUcaci aicactagcc Lcagaglatit ctitULgaa丨 L aacaL laggc 84Q trcttctcat atagtcaggt ttcgartttt ctggttxttt gagttttttt ctggcacttc 900 cgttgtttgc cgcgtggctt gttttttatg ttntaattta tittttctag tgtgaccggc 960 tggttcccag cttaattttt gtatccggta tatgactttg atagcc^aag ttttcagc^t 1020 ggs t Lagiac gta tacgtgc ctgtca tagt actt tttclc tctccgtttg aUctggcag 1080 acggttcgtt ct-tatcctgt tttctagctg ttcacattag ctatttgtgc atgctttgtg 1140 cttgcaagcg tactgcgcat gctgccatgc ggccacaaac tgtagtccac gcgctagctg 1200 ctggctttgc ttgtgcctac atgtgctgtg cacgtgctgc ccccatgcca tttatattat 1260 a11g1111ca cllgalatiLL accalalala caallaalll galgctacal gcclacalac 1320
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【權利要求】
1. 一種水稻缺鐵誘導啟動子，其特征在于：啟動子DNA片段的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
2. -種表達載體，其特征在于：含有權利要求1的DNA核苷酸序列。
3. -種轉基因細胞系，其特征在于：含有權利要求1的DNA核苷酸序列。
4. 一種工程菌，其特征在于：含有權利要求1的DNA核苷酸序列。
5. 根據權利要求1所述的水稻缺鐵誘導啟動子在啟動目的基因表達中的應用。
6. 根據權利要求5所述的水稻缺鐵誘導啟動子在啟動目的基因表達中的應用，其特征 在于：在目的植物中用所述DNA片段啟動目的基因的表達，得到目的基因表達受到缺鐵誘 導的轉基因植物。
7. 根據權利要求6所述的水稻缺鐵誘導啟動子在啟動目的基因表達中的應用，其特征 在于：所述目的植物為水稻；所述目的基因為GUS基因；所述缺鐵條件為不供鐵的水稻培養 液；方法為將重組載體導入所述目的植物，從而在所述目的植物中用所述DNA片段啟動GUS 基因的表達。
【文檔編號】C12N1/15GK104059912SQ201410249644
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】王芳, 鄧敏娟, 徐磊, 趙紅玉, 魏溪娟, 易可可 申請人:浙江省農業科學院