水稻啟動子p-G8及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一個水稻啟動子p-G8及其應用。本發明提供的DNA片段，為如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在嚴格條件下與1）限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3）與1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。本發明的實驗證明，本發明發現的啟動子，含有ABRE逆境響應元件，在水稻小穗、穎殼和枝梗中特異表達，該啟動子為組織特異性啟動子；本發明在農業領域將具有廣闊的應用和市場前景。
【專利說明】水稻啟動子P-G8及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種水稻啟動子P-G8及其應用。
【背景技術】[0002]水資源短缺正成為制約我國乃至世界農業發展的重要因素。我國現人均水資源占有量僅為世界人均水平的1/4，缺水已經成為我國工農業生產和人民生活面臨的主要問題之一。培育耐旱品種是當前多種農作物育種工作中的重要課題。以水稻為例，水稻是我國最重要的糧食作物之一，總產量占糧食總產量40%左右，但同時又是一種需水量很大的作物，日益嚴峻的水資源短缺已經成為稻作生產面臨的重要問題之一。在有限的水資源條件下實現水稻高產、穩產，必須培育耐旱水稻品種。研究水稻耐旱遺傳學基礎，加強稻屬耐旱基因資源的發掘、創新和利用具有十分重要的現實意義。
[0003]普通野生稻(0.rufipogon Griff.)作為栽培稻(0.sativa L.)的祖先，是栽培稻遺傳改良的重要基因庫。野生稻在進化成栽培稻的過程中，不僅很多農藝性狀發生了很大的變化，而且遺傳多樣性降低，等位基因數減少，Sun等研究表明栽培稻中的等位基因僅為野生稻的60%。
[0004]被譽為“植物大熊貓”的江西東鄉野生稻(0.rufipogon Griff.)是目前世界上生境最北(28° 14' N)的野生稻，與栽培稻隔離條件好，沒有栽培稻基因滲入，具有耐低溫、耐干旱的特性。從野生稻中發掘、定位、克隆耐旱相關基因，將對水稻生產具有重要意義。
[0005]我國野生稻資源豐富，從野生稻中發掘、定位、克隆耐旱相關基因及其旱誘導啟動子，將對水稻生產具有重要意義。

【發明內容】

[0006]本發明的一個目的是提供一種DNA片段。
[0007]本發明提供的DNA片段，為如下I)或2)或3)的DNA分子:
[0008]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0009]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；
[0010]3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
[0011]上述嚴格條件可為在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0012]序列表中序列I的DNA序列由1830個核苷酸組成，含有ABRE作用元件。
[0013]含有上述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的范圍。
[0014]上述重組載體為將上述DNA片段插入表達載體中，得到重組載體；具體為將序列表中的序列I所示的DNA片段插入pCambial381的EcoRI和HindIII酶切識別位點間得到的重組質粒。
[0015]擴增上述DNA片段的全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的范圍。[0016]上述引物對中由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成。
[0017]上述DNA片段在啟動目的基因表達中的應用也是本發明保護的范圍。
[0018]上述應用中，所述目的基因表達為組織特異表達。
[0019]上述應用中，所述組織為植物的小穗、穎殼和枝梗中的至少一種。
[0020]上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
[0021]上述應用中，所述目的基因為⑶S基因。
[0022]本發明的實驗證明，本發明發現一種啟動子，含有ABRE逆境響應元件，將導入水稻，在水稻中驅動GUS基因的表達，結果表明，在水稻小穗、穎殼和枝梗中特異表達，該啟動子為組織特異性啟動子；本發明在農業領域將具有廣闊的應用和市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為基因在30%PEG處理前(O)和處理2、4、8、16、24、36、48和72小時后的表達
譜
[0024]圖2為以IL23基因組DNA為模板，在引物⑶S8引導下的PCR擴增產物
[0025]圖3為p-G8轉基因水稻的⑶S組織染色及基因G8在不同組織中的相對表達量分析
【具體實施方式】
[0026]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0027]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0028]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責任公司完成。
[0029]耐旱系IL23水稻:(公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻:ZhangX, Zhou SX, Fu Y C，et al.1dentification of a drought tolerant introgressionlinederived from Dongxiang common wild rice(0.rufipogon Griff.).Plant MolBiol,2006, 62:247-259)。
[0030]桂朝2號水稻:(中國作物種質資源信息網，http://icgr.caas.net.cn/ ;庫編號:I1A49054)。
[0031]pCambial381 即 NCBI 中的 Binary vector pCAMBIA-1381,為環形質粒,其核苷酸序列見 NCBI 中的如下序列:GenBank:AF234302.1 ;VERSION:AF234302.1 ;G1: 7638091。植物表達載體pCambial381的核苷酸序列中，第9810至10590位核苷酸為CaMV35S啟動子(組成型啟動子)，用來啟動潮霉素基因；第2-1855位核苷酸為⑶S基因；第7214-8008位核苷酸為aadA基因(卡那霉素抗性基因)；第8749-9774位核苷酸為hpt II基因(潮霉素抗性基因)。
[0032]日本晴水稻:(中國作物種質資源信息網，http://icgr.caas.net.cn/ ;庫編號:I1A13071)。[0033]實施例1、水稻旱誘導啟動子p-G8的獲得
[0034]一、旱誘導基因的發現
[0035]首先以耐旱系IL23水稻及對照親本桂朝2號(GC2)水稻為材料進行芯片(芯片為Affimetrix 公司的水稻全基因組芯片(GeneChip* Rice Genome Array),貨號:900599)雜交，并在芯片數據分析的基礎上，結合比較基因組學分析，篩選耐旱相關基因，經過基因組比較、耐旱相關性分析，最后獲得耐旱基因G8，30%PEG處理條件下，基因的表達量明顯增加(圖1)，是旱誘導基因。
[0036]二、旱誘導啟動子P-G8的獲得
[0037]利用primerf引物設計軟件設計引物，并在引物兩端分別引入限制性內切酶EcoRI 和 HindIII 識別位點及保護堿基。GUS8F:5，-GCGAATTC GATATCGACTTCGGAGAGA-3’ ；GUS8R:5，-GCAAGCTT AGCCCAAGAAAGATCGCGCA-3’。⑶S8F中，帶下劃線堿基為限制性內切酶EcoRI識別位點及保護堿基；GUS8R中，帶下劃線堿基為限制性內切酶HindIII的識別位點及保護堿基。
[0038]以耐旱系IL23水稻的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為:先940C 5min ;然后 94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min,共 30 個循環；最后 72°C IOmin,獲得目的產物。反應結束后，對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示，I為Marker IIK所用Marker為天根生化科技有限公司的Marker III，貨號:MD103_01)，2為PCR產物。
[0039]將PCR產物進行測序，測序結果表明，PCR產物具有序列表的序列I自5’末端第I至1830位核苷酸所示的DNA片段，將序列表的序列I自5’末端第I至1830位核苷酸所示的DNA片段命名為p-G8 (旱誘導啟動子)。
[0040]用分析軟件(http://www.dna.affrc.g0.jp/PLACE)對啟動子進行分析,發現在其區域內含有與逆境脅迫相關的順式作用元件ABRE。
[0041]實施例2、p-G8轉基因水稻的獲得及其鑒定
[0042]一、p-G8植物表達載體的構建
[0043]1、以耐旱系IL23水稻的基因組DNA為模板，用特異性引物對⑶S8(⑶S8F/⑶S8R)進行PCR擴增，反應結束后，對PCR擴增產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化1830bp的DNA片段(p-G8)(所用回收試劑盒為天根生化科技有限公司的DNA產物純化試劑盒，貨號:DP204-02)。
[0044]2、用限制性內切酶EcoRI和HindIII酶切步驟I回收的PCR產物。
[0045]3、用限制性內切酶EcoRI和Hindi 11酶切植物表達載體pCambial381，回收載體骨架(約 10650bp)。
[0046]4、將步驟2的酶切產物與步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒。
[0047]5、將重組質粒進行測序,測序結果表明，得到了重組質粒pCambial381_pG8,該載體為將序列表的序列I自5’末端第I至1830位核苷酸所不的DNA片段插入pCambial381的EcoRI和HindIII酶切位點之間得到(pCambial381載體中的⑶S無自帶啟動子，其中NCBI中描述的35S是啟動潮霉素的啟動子)。。
[0048]二、p-G8轉基因水稻的獲得
[0049]將pCambial381_pG8用基因槍法轉化日本晴的成熟胚愈傷組織,用含50mg/L潮霉素的NB培養基進行2輪篩選，每輪篩選20-30天，經預分化、分化得到植株。
[0050]1、將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織作為基因槍轟擊的受體，用基因槍將重組質粒pCambial381-pG8轟擊到愈傷組織,具體步驟如下:
[0051](I)將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織在高滲透培養基(NB培養基+91.2g/L甘露醇)上進行滲透處理6h (28°C，暗培養)。
[0052](2)用重組質粒pCambial381-pG8包裹直徑110 μ m金粉，采用PDS-1000/He基因槍Bio-Red公司生產)，選擇IlOOPsi的可裂膜,載樣距祀材料6cm進行轟擊。
[0053](3)轟擊后的愈傷組織繼續在原培養基上培養16h (28°C，暗培養)。
[0054]2、將完成步驟I的愈傷組織轉移到恢復培養基(NB培養基+2mg/L 2，4_D)上，恢復培養I周(28°C，暗培養)。
[0055]3、將完成步驟2的愈傷組織轉移到篩選培養基(NB培養基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培養30天，篩兩輪。
[0056]4、將步驟3得到的愈傷組織轉移到預分化培養基上(NB培養基+5mg/L ABA+50mg/L 潮霉素 +2mg/L NAA+lmg/L 6-BA)暗培養 15 天，28°C。
[0057]5、將步驟4得到的抗性愈傷轉到分化培養基上(NB培養基+2mg/L6_BA+ Img/LNAA+lmg/L KT+50mg/L潮霉素)28°C光照培養約15天。
[0058]6、將步驟5中幼苗移到生根培養基上(1/2MS+0.5mg/L NAA+0.09g/L肌醇+30g/L蔗糖)28 °C光照培養約30天。
[0059]7、將步驟6中苗高7-8cm且根系發達的植株移栽到花盆，放置于溫室中培養3周，成活的植株即為Ttl代植株。
[0060]將植株進行PCR鑒定(引物為潮霉素引物1F5’ -tacttctaca cagccatc-3’和IR，5’-cgtctgtcga gaagtttc-3’得到約1000bp的為陽性植株),結果表明，得到的陽性植株為Ttl代轉基因水稻。
[0061]將空載pCambial381用基因槍法轉化日本晴的成熟胚愈傷組織，用上述方法得到Ttl代轉空載體對照水稻(引物為潮霉素引物1F5’ -tacttctaca cagccatc-3’和IR，5’ -cgtctgtcga gaagtttc-3’ 得到約 1000bp 的為陽性植株)。
[0062]三、轉基因水稻的組織表達特異性分析
[0063]1、⑶S組織染色
[0064]對Ttl代轉基因水稻、Ttl代轉空載體對照水稻的根、葉片、葉鞘、莖、莖節、葉節、枝梗、穎殼和小穗進行⑶S組織染色。
[0065] 結果如圖3A所示，3A為p_G8轉基因水稻的⑶S組織染色結果；結果發現Ttl代轉基因水稻的⑶S基因在小穗、穎殼和枝梗中具有較高的表達活性(藍色)，而在其他組織中的表達量極低，甚至不表達(沒有顏色)，而Ttl代轉空載體對照水稻任何組織均不表達GUS (空載中沒有啟動子啟動⑶S表達，而載體中的35S啟動子只是啟動潮霉素基因的表達)。
[0066]上述實驗結果均表明，T0代轉基因水稻中的⑶S基因得到表達，證明P-G8為啟動子，可以啟動GUS的表達，且為組織特異性啟動子。
[0067]2、G8基因在IL23和GC2各組織中的相對表達量
[0068]分別提取IL23和桂朝2號水稻的根、葉片、葉鞘、莖、莖節、穎殼、枝梗和小穗的 RNA，反轉錄得到 cDNA 作為模板，以 G8F:5’ -TCAAAAACATCGGTCGATCA-3’，G8R:5’ -CTCTACAGGCGGGCTTCTTA-3’ ；為引物，進行RT-PCR，以18S為內參，內參的引物為18S-F5'-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3' , 18S-R 5' -GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。實驗重復三次，結果取平均值。[0069]結果如圖3B所示，基因G8僅在滲入系IL23的枝梗、小穗和穎殼中具有較高的表達量，而在其他組織中及桂朝2號的各組織中表達量極低，甚至不表達。[0001]
【權利要求】
1.一種DNA片段，為如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子； 3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
2.含有權利要求1所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權利要求1所述DNA片段插入表達載體中，得到重組載體。
4.擴增權利要求1所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對。
5.根據權利要求4所述的引物對，其特征在于:所述引物對由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所不的單鏈DNA分子組成。
6.權利要求1所述DNA片段在啟動目的基因表達中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于:所述目的基因表達為組織特異表達。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于:所述組織為植物的小穗、穎殼和枝梗中的至少一種。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于: 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
10.如權利要求6-9中任一所述的應用，其特征在于: 所述目的基因為GUS基因。
【文檔編號】C12N15/11GK103834654SQ201210479112
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月22日 優先權日:2012年11月22日
【發明者】孫傳清, 劉鳳霞, 張俠, 周少霞, 王娜, 譚祿賓, 朱作峰, 付永彩, 才宏偉 申請人:中國農業大學