低出生體重兒基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物檢測【技術領域】，具體涉及低出生體重兒基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用，該引物包括分別對應3個待檢變異位點的3對共6條引物，3個待檢變異位點分別為基因片段rs900400、rs1482853和rs900399，6條引物分別簡寫為：G1F、G1R、G2F、G2R、G3F和G3R；其中，引物G1F和G1R擴增位點為rs900400，G2F和G2R擴增位點為rs1482853，G3F和G3R擴增位點為rs900399。該引物能滿足3個待檢變異位點在同一個反應條件下擴增，引物特異性好。本發明的試劑盒包括上述引物，該試劑盒能檢測出待檢者生育低出生體重兒的風險性。
【專利說明】低出生體重兒基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測【技術領域】，具體涉及低出生體重兒基因變異檢測用引物及其檢測試劑盒、檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002]低出生體重兒(low birth weight, LBW)是指新生兒出生時體重不足2500g,它包括不足37孕周出生的早產和足月但是體重不到2500g的新生兒。聯合國兒童基金會2000年公布的世界兒童狀況數據表明全球每年低出生體重兒的出生率占新生兒的17%，約有2400萬。在我國，低出生體重兒的出生率為5.87%，在部分地區仍在10%以上。低出生體重，不僅直接對新生兒和嬰兒死亡率和疾病發生率產生影響，而且與小兒長期預后如身體發育、智力發育、殘疾、成人疾病等密切相關。研究表明，低出生體重所面臨的疾病風險、死亡率都比正常出生體重的孩子高，1998年全國低出生體重調查群體資料表明，低出生體重兒早期新生兒死亡率是正常體重兒的45倍。
[0003]近年的研究表明，遺傳因素是影響低出生體重兒的重要因素，2010年，Freathy等發表的文章“Variants in ADCY5 and near CCNLl are associated with fetal growthand birth weight”報道了歐洲人群中第3號染色體長臂上的ADCY5基因當中以及CCNLl基因附近的兩個變異(rs9883204與rs900400)與低出生體重相關，該研究采用meta分析GWAS病例對照的方法比較病例組和對照組微效基因頻率的差異性。但該研究只選取了歐洲人種作為研究對象，且只對rs9883204和rs900400這兩個變異位點進行檢測。
[0004]由于遺傳變異具有明顯的種族和地域等異質性，因此，有必要研發一種針對亞洲地區中國人群的低出生體重兒基因變異檢測試劑盒，且該試劑盒不僅只對rs9883204和rs900400這兩個變異位點進行檢測，還應該對更多的變異位點進行檢測，以增強檢測的準確性。
[0005]本 申請人:首次采用Sanger測序的方法研究了 rsl482853、rs900399變異位點與低出生體重兒相關性，并驗證了 rs900400變異位點在亞洲人群低出生體重兒中的關聯性，并將這3個變異位點的檢測首次研制成檢測試劑盒，該試劑盒可同時對低出生體重遺傳因素被證實是影響低出生體重兒的重要因素，且目前臨床上還沒有試劑盒檢測低出生體重兒的相關基因應用。

【發明內容】

[0006]為了克服現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的在于提供一種低出生體重兒基因變異檢測用引物，該引物能滿足3個待檢變異位點在同一個反應體系和反應條件下擴增，引物特異性好。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種低出生體重兒基因變異檢測試劑盒，該試劑盒針對中國人群低出生體重兒相關基因3個變異位點而開發，能闡明低出生體重兒的遺傳分子病理機制和預警、預防的作用，提高出生缺陷救治水平，降低由低出生體重引發的相關疾病的發病率。
[0008]本發明的另一目的在于提供一種低出生體重兒基因變異檢測試劑盒的檢測方法，該檢測方法準確性高、特異性強，能檢測出待檢者生育低出生體重兒的風險性以及預測低出生體重兒后期引發的相關疾病的風險性。
[0009]本發明的另一目的在于提供一種低出生體重兒基因變異檢測試劑盒在檢測低出生體重兒基因變異的應用，可以減少低出生體重兒的發病率，預防由低出生體重引發的相關疾病。
[0010]本發明的目的通過下述技術方案實現:低出生體重兒基因變異檢測用引物，包括分別對應3個待檢變異位點的3對共6條引物，3個待檢變異位點分別為基因片段rs900400、rsl482853 和 rs900399，6 條引物分別簡寫為:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F 和 G3R ;其中，引物GlF和GlR擴增位點為rs900400,G2F和G2R擴增位點為rs 1482853，G3F和G3R擴增位點為rs900399。3個待檢變異位點位于人基因組DNA中待檢的ADCY5基因、CCNLl基因當中及附近。
[0011]優選的，所述6條引物的序列分別為:
GlF:5’ -ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
GIR: 5 ’ -AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3，
G2F:5’ -ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G2R:5’ -AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G3F:5’ -TACATCAATGTCCTTTACTTGCAT-3’
G3R:5’ -CAAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAA-3’。
[0012]本發明的另一目的通過下述技術方案實現:一種用于檢測低出生體重」L基因變異的試劑盒，該試劑盒包括上述的引物。
[0013]本發明的另一目的通過下述技術方案實現:一種使用上述的試劑盒檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，依次包括如下步驟:
A、提取模板DNA:從待檢者的血液中提取基因組DNA，作為PCR擴增的模板DNA ；
B、PCR擴增:以上述提取的基因組DNA為模板，采用所述引物進行PCR擴增，得到DNA擴增產物；
C、PCR產物純化:采用純化板對上述DNA擴增產物進行純化，得到純化DNA；
D、測序反應:采用Sanger方法對純化DNA進行測序；
E、結果分析:采用測序峰圖分析軟件對測序結果進行分析。
[0014]優選的，所述步驟B中，PCR擴增的反應體系以30μL計為:
IOX rTaq 緩沖液3μL
2.5mM dNTP2μL
IOmM 引物 FIμL
IOmM 引物 RIμL
10~30ng/^L 模板 DNA2μL
rTaq聚合酶0.2μL
ddH2020.8μL。[0015]優選的，所述步驟B中，PCR擴增的反應條件為:1) 95°C預變性5min ；2) 95°C變性30s，56。。退火 30s、72°C延伸 45s，共 35 個循環；3) 72°C后延伸 IOmin ；4) 12°C保藏。
[0016]優選的，所述步驟C中，PCR產物純化的步驟具體為:向96孔純化板孔中加入100μL ddH20,將上述DNA擴增產物加入96孔純化板中室溫靜置lOmin，真空抽濾IOmin至抽干；向96孔純化板中加入40μL ddH20，室溫溶解lOmin，取出對應的孔中的純化產物至另一個96孔PCR板中，回收純化產物，得到純化DNA。
[0017]優選的，所述步驟D中，測序的反應體系以6μL計為:
30~50ng /μL 純化 DNA2μ L
3ρΜ測序引物?μL
Bigdye2 M-L
DMSO?μL。
[0018]Bigdye包含Taq聚合酶以及標記了大熒光染料的ddNTP等，在DNA聚合酶催化的測序反應中需要測序引物，不論是單鏈DNA模板，還是雙鏈DNA模板，都可通過使用克隆位點兩側的載體序列互補的通用引物，本發明的測序引物采用Bigdye的通用引物。
[0019]優選的，所述步驟D中，測序的反應條件為:1)95°C預變性2min ;2)95°C變性30s，55°C退火30s、60°C延伸45s，共30個循環；3) 12°C保藏。
[0020]所述步驟E中，結果分析的步驟具體為:使用測序峰圖分析軟件，對測序結果進行分析，得到每個測試樣本相應位點的堿基信息，從而分析待檢者生育低出生體重兒的風險性以及預測低出生體重兒后期引發的相關疾病的風險性。
[0021 ] 本發明的另一目的通過下述技術方案實現:一種上述的試劑盒在檢測低出生體重兒基因變異的應用。
[0022]本發明的有益效果在于:本發明首次根據3個待檢變異位點設計了 6條引物，這些引物能滿足3個待檢變異位點在同一個反應體系和反應條件下擴增，引物特異性好。
[0023]本發明首次通過測序技術平臺針對低出生體重兒遺傳基因開發一種檢測試劑盒，對相關的基因3個風險變異位點(rs900400、rsl482853、rs900399)進行檢測分析，以達到闡明低出生體重兒的遺傳分子病理機制和預警、預防的作用，提高出生缺陷救治水平，降低由低出生體重引發的相關疾病的發病率。
[0024]本發明的檢測方法準確性高、特異性強，能檢測出待檢者生育低出生體重兒的風險性以及預測低出生體重兒后期引發的相關疾病的風險性。
[0025]本發明的試劑盒在檢測低出生體重」L基因變異的應用，可以減少低出生體重」L的發病率，預防由低出生體重引發的相關疾病。
[0026]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1是本發明實施例的測試樣本與對照樣本在rs900400變異位點的測序比對圖。
[0027]圖2是本發明實施例的測試樣本與對照樣本在rsl482853變異位點的測序比對圖。
[0028]圖3是本發明實施例的測試樣本與對照樣本在rs900399變異位點的測序比對圖。
[0029]【具體實施方式】:
為了便于本領域技術人員的理解，下面結合實施例及附圖1-3對本發明作進一步的說明，實施方式提及的內容并非對本發明的限定。[0030]低出生體重兒基因變異檢測用引物，包括分別對應3個待檢變異位點的3對共6條引物，3個待檢變異位點分別為基因片段rs900400、rsl482853和rs900399，6條引物分別簡寫為:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F和G3R ;其中，引物GlF和GlR擴增位點為rs900400,G2F和G2R擴增位點為rsl482853，G3F和G3R擴增位點為rs900399。
[0031]所述6條引物的序列分別為:
GlF:5’ -ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
GIR: 5 ’ -AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3，
G2F:5’ -ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G2R:5’ -AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G3F:5’ -TACATCAATGTCCTTTACTTGCAT-3’
G3R:5’ -CAAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAA-3’。
[0032]本發明首次根據3個待檢變異位點設計了 6條引物，這些引物能滿足3個待檢變異位點在同一個反應體系和反應條件下擴增，引物特異性好。
[0033]一種用于檢測低出生體重兒基因變異的試劑盒，該試劑盒包括上述的引物。
[0034]本發明首次 通過測序技術平臺針對低出生體重兒遺傳基因開發一種檢測試劑盒，對相關的基因3個風險變異位點(rs900400、rsl482853、rs900399)進行檢測分析，以達到闡明低出生體重兒的遺傳分子病理機制和預警、預防的作用，提高出生缺陷救治水平，降低由低出生體重引發的相關疾病的發病率。
[0035]一種使用上述的試劑盒檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，依次包括如下步驟:
A、提取模板DNA:從待檢者的血液中提取基因組DNA，作為PCR擴增的模板DNA ；
B、PCR擴增:以上述提取的基因組DNA為模板，采用所述引物進行PCR擴增，得到DNA擴增產物；所述步驟B中，PCR擴增的反應體系以30μL計為:
IOX rTaq 緩沖液3μL
2.5mM dNTP2μL
IOmM 引物 FIμL
IOmM 引物 RIμL
10~30ng/^L 模板 DNA2μL
rTaq聚合酶0.2μL
ddH2020.8μL。
[0036]所述步驟B中，PCR擴增的反應條件為:1)95°C預變性5min ;2)95°C變性30s，56°C退火30s、72°C延伸45s，共35個循環；3) 72°C后延伸IOmin ；4) 12°C保藏。
[0037]C、PCR產物純化:采用純化板對上述DNA擴增產物進行純化，得到純化DNA ;所述步驟C中，PCR產物純化的步驟具體為:向Millipore 96孔純化板孔中加入100μL ddH20，將上述DNA擴增產物加入96孔純化板中室溫靜置lOmin，真空抽濾IOmin至抽干；向96孔純化板中加入40μL ddH20，室溫溶解lOmin，取出對應的孔中的純化產物至另一個96孔PCR板中，回收純化產物，得到純化DNA。
[0038]D、測序反應:采用Sanger方法對純化DNA進行測序；所述步驟D中，測序的反應體系以6ML計為:30~50ng /μL 純化 DNA2μL
3ρΜ測序引物?μL
Bigdye2 M-L
DMSO?μL。
[0039]所述步驟D中，測序的反應條件為:1) 95°C預變性2min ；2) 95°C變性30s，55°C退火30s、60°C延伸45s，共30個循環；3) 12°C保藏。
[0040]E、結果分析:采用測序峰圖分析軟件對測序結果進行分析。所述步驟E中，結果分析的步驟具體為:使用Applied Biosystems Inc.公司自帶的測序峰圖分析軟件,對測序結果進行分析，得到每個測試樣本相應位點的堿基信息，從而分析待檢者生育低出生體重兒的風險性以及預測低出生體重兒后期引發的相關疾病的風險性。如圖廣3所示，如果測試樣本的基因在3個風險變異位點(rs900400、rsl482853、rs900399)中的任意一個變異位點的堿基發生突變，即可判斷待檢者為生育低出生體重兒的高危人群。 [0041]本發明的檢測方法準確性高、特異性強，能檢測出待檢者生育低出生體重兒的風險性以及預測低出生體重兒后期引發的相關疾病的風險性。
[0042]一種上述的試劑盒在檢測低出生體重兒基因變異的應用。本發明的試劑盒在檢測低出生體重兒基因變異的應用，可以減少低出生體重兒的發病率，預防由低出生體重引發的相關疾病。
[0043]上述實施例為本發明較佳的實現方案，除此之外，本發明還可以其它方式實現，在不脫離本發明構思的前提下任何顯而易見的替換均在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.低出生體重兒基因變異檢測用引物，其特征在于:包括分別對應3個待檢變異位點的3對共6條引物，3個待檢變異位點分別為基因片段rs900400、rsl482853和rs900399，6條引物分別簡寫為:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F和G3R ;其中，引物GlF和GlR擴增位點為rs900400, G2F 和 G2R 擴增位點為 rsl482853，G3F 和 G3R 擴增位點為 rs900399。
2.根據權利要求1所述的低出生體重兒基因變異檢測用引物，其特征在于:所述6條引物的序列分別為:
GlF:5’ -ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
GIR: 5 ’ -AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3，
G2F:5’ -ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G2R:5’ -AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G3F:5’ -TACATCAATGTCCTTTACTTGCAT-3’
G3R:5’ -CAAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAA-3’。
3.一種用于檢測低出生體重兒基因變異的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括權利要求廣2任一項所述的引物。
4.一種使用權利要求3所述的試劑盒檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，其特征在于:依次包括如下步驟: A、提取模板DNA:從待檢者的血液中提取基因組DNA，作為PCR擴增的模板DNA ； B、PCR擴增:以上述提取的基因組DNA為模板，采用所述引物進行PCR擴增，得到DNA擴增產物； C、PCR產物純化:采用純化板對上述DNA擴增產物進行純化，得到純化DNA； D、測序反應:采用Sanger方法對純化DNA進行測序； E、結果分析:采用測序峰圖分析軟件對測序結果進行分析。
5.根據權利要求4所述的一種檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟B中，PCR擴增的反應體系以30μL計為: IOX rTaq 緩沖液3μL 2.5mM dNTP2μL IOmM 引物 FIμL IOmM 引物 RIμL 10~30ng/^L 模板 DNA2μL rTaq聚合酶0.2μL ddH2020.8μL。
6.根據權利要求4所述的一種檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟B中，PCR擴增的反應條件為:1)95°C預變性5min ;2)95°C變性30s，56°C退火30s、72°C延伸45s，共35個循環；3) 72°C后延伸IOmin ；4) 12°C保藏。
7.根據權利要求4所述的一種檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟C中，PCR產物純化的步驟具體為:向96孔純化板孔中加入100μL ddH20，將上述DNA擴增產物加入96孔純化板中室溫靜置lOmin，真空抽濾IOmin至抽干；向96孔純化板中加入40μL ddH20，室溫溶解lOmin，取出對應的孔中的純化產物至另一個96孔PCR板中，回收純化產物，得到純化DNA。
8.根據權利要求4所述的一種檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟D中，測序的反應體系以6PL計為: 30~50ng /μL 純化 DNA2μL 3ρΜ測序引物?μL Bigdye2 M-L DMSO1μL。
9.根據權利要求4所述的一種檢測低出生體重兒基因變異的檢測方法，其特征在于:所述步驟D中，測序的反應條件為:I) 95°C預變性2min ；2) 95°C變性30s，55 V退火30s、60°C延伸45s，共30個循環；3) 12°C保藏。
10.一種權利要求3所述的試劑盒在檢測低出生體重兒基因變異的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103981279SQ201410251946
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】范雪金, 馬可澤, 何曉光, 曾娟, 劉紹基, 陸小梅, 彭琪 申請人:東莞市石龍博愛醫院