利用海洋真菌生產免疫抑制化合物的方法及其培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用海洋真菌生產免疫抑制化合物的方法及其培養基。該培養基的組成成分為每升蒸餾水中包含有：葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麥芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氫鉀0.4-0.6g/L、七水硫酸鎂0.4-0.6g/L、氯化鐵0.004-0.006g/L，將上述組分以蒸餾水溶解，定容至1L，再以NaOH調節pH值至6.5-7.0，然后在121℃下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得所需培養基。本發明的培養基成分簡單，制備方法操作方便，成本低廉，不需特殊設備，能顯著提高海洋印尼紅藻共生真菌Daldiniaeschscholzii生產免疫抑制化合物DalesconolA和DalesconolB的產量。
【專利說明】利用海洋真菌生產免疫抑制化合物的方法及其培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物學領域，具體涉及用于生產免疫抑制化合物的培養基【技術領域】，更具體地，涉及利用海洋印尼紅藻共生真菌Daldinia eschscholzii生產免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B的方法及其所用培養基。
【背景技術】
[0002]海洋微生物是生物功能天然產物的重要來源之一，從海洋中尋找天然活性物質正在成為新藥開發的研究熱點。海洋生物生活在高壓、低營養、低溫(特別是深海)、無光照以及局部的高溫和高鹽等環境中,造成了海洋微生物的多樣性和特殊性。海洋微生物由于適應了海洋環境，有了新的特異性，能產生陸棲微生物所不能產生的結構新穎、作用特殊的活性物質，這些活性物質將極大地克服機體的抗藥性，同時為新藥研發提供新的先導化合物，可以作為重要的海洋藥物資源。
[0003]南京大學譚仁祥教授從海洋印尼紅藻(CraciJaria sp.5K?_7)分離得到了海洋印尼紅藻共生真菌escAscAohii，其屬于光輪層炭殼菌。該菌經過液體或固體發酵可產生多種代謝物質。Dalesconol A (簡稱DA)和Dalesconol B (簡稱DB)是其產生的一種聚酮類次級代謝物，其體外的T細胞增殖實驗表明DA和DB具有顯著的免疫抑制效應(IC50:
0.16~0.58 μ g/mL)，同目前臨床上使用最多的環孢素A相近(IC5tl: 0.06 μ g/mL)，而且相較于環孢素A，DA和DB具 有選擇性更廣、副作用更小的優點，是一種具有良好前景的免疫抑制候選藥物。
[0004]然而，化合物DA和DB在初始環境下的產率相當低，已成為制約DA和DB用于臨床前研究的瓶頸。因此需要通過優化其培養環境來使得化合物DA和DB獲得穩定的高產。但微生物發酵是一個極其復雜的生物過程，涉及到許多相互影響的因素，產物生物合成水平受到很多方面的影響，其中適宜的培養基是微生物發酵的一個關鍵性因素。因此，針對該菌種的培養基進行優化顯得十分重要。
[0005]目前比較成熟的優化培養基的方法有單因素實驗、Plackett-Burman (篩選試驗設計，簡稱PB)設計、正交實驗、響應面設計等。
[0006]其中，Plackett-Burman設計,可對多個不同因子對響應值的顯著性進行分析,從而找出對發酵產量或細胞生長最為重要的培養基組分，該方法分別對每個因子取高(+1)和低(-1 )兩個水平，通過每個因子兩水平之間的差異與整體差異之間的統計分析來確定各因子對相應變量的顯著性。該方法可大大提高篩選效率，能以最少的試驗次數使因素的主效果得到盡可能精確的估計。
[0007]響應面設計方法由Box-Wilson方法發展而來的，它是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過響應面和等高線分析，能夠精確地研究各因子與響應變量之間的關系，優化出最佳工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。響應面法是一種適用性強的實驗設計方法，包括實驗設計、建模及尋求因子水平最佳操作條件等功能，顯示出了其他方法所不具備的優點。該方法不但具備試驗次數少，周期短、精度高等優點，而且可以對各因子水平及其交互作用進行優化和評價，可快速有效的確定多因子系統的最佳條件。
[0008]因此，通過聯用PB設計和響應面設計，可以通過搖瓶實驗確定重要因素，再針對重要因素得到最佳的組分水平，從而可大大加快獲得最佳的培養基組成。

【發明內容】

[0009]本發明的主要目的就是針對以上現狀，解決限制對免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B深入研究的瓶頸問題,提供一種用于發酵海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii生產免疫抑制劑Dalesconol A和Dalesconol B的培養基及其制備方法,及使用該培養基發酵生產Dalesconol A和Dalesconol B的方法。該培養基成分簡單，制備方法操作方便，成本低廉，不需特殊設備，而使用該培養基發酵海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii 生產免疫抑制劑 Dalesconol A 和 Dalesconol B,能顯著提高 Dalesconol A和Dalesconol B 的產量。
[0010]為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
一種用于發酵培養海洋真菌生產免疫抑制化合物的培養基，其組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麥芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氫鉀 0.4-0.6g/L、七水硫酸鎂 0.4-0.6g/L、氯化鐵 0.004-0.006g/L。
[0011]作為本發明的優選方案之一，所述培養基的組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖22.98g/L、尿素1.48g/L、麥芽浸膏37.5g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、七水硫酸鎂0.5g/L、氯化鐵0.005g/L。
[0012]一種用于發酵培養海洋真菌生產免疫抑制化合物的培養基之制備方法，該制備方法的步驟為:
將葡萄糖、尿素、麥芽浸膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鐵加入蒸餾水中定容至1L，使上述成分在培養基中的終濃度分別為11.6-28.4g/L、0.87-2.13g/L、17.39-42.61g/L、
0.4-0.6g/L、0.4-0.6g/L、0.004-0.006g/L，再以 NaOH 調節 pH 值至 6.5-7.0，然后在 121 °C下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得海洋真菌生產免疫抑制化合物的培養基。
[0013]一種利用海洋真菌生產免疫抑制化合物的方法，該方法包括如下步驟:
a.將冷凍保存的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii解凍后,在固體平板培養基中央進行點樣并活化培養7-10天，獲得新鮮固體平板培養基，固體平板培養基每隔30天重新活化一次；
b.從新鮮的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii的固體平板培養基中挖取I塊瓊脂塊，接種至種子培養基中發酵培養3-4天，獲得新鮮種子液；
c.取所述新鮮種子液，按5-20%(v/v)的接種量接入權利要求1和2任一項所述培養基，以28±2° C、180±20 rpm搖床振蕩培養6_8天后，獲得發酵液；以及
d.取所述發酵液進行抽提、萃取、純化，獲得免疫抑制化合物DalesconolA和Dalesconol B。
[0014]其中，所述海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii是一種光輪層炭殼菌。
[0015]與現有技術相比，本發明提供的一種利用海洋真菌生產免疫抑制化合物的方法及其培養基的主要優點如下:本發明的培養基成分簡單，制備方法操作方便，成本低廉，不需特殊設備，能顯著提高海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii生產免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B 的產量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為基于Plackett-Burman實驗結果，以葡萄糖(Xl)為確定最優區域的中心點而進行的單因素的實驗結果圖；
圖2為基于Plackett-Burman實驗結果，以尿素(X2)為確定最優區域的中心點而進行的單因素的實驗結果圖；
圖3為基于Plackett-Burman實驗結果，以麥芽浸膏(X3)為確定最優區域的中心點而進行的單因素的實驗結果圖；
圖4-6為利用Design Expert 8.0數據處理軟件,建立回歸方程后獲得的三個因子葡萄糖、尿素、麥芽浸膏對Dalesconol A和Dalesconol B產量的響應面分析圖。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例是對本發明的進一步說明，但本發明不限于下述實施例。
[0018]本發明所用菌種、培養基為:
菌種:海洋真菌eschscholzii是由南京大學譚仁祥教授課題組從海洋印尼HiGreicileiriei sp.S GR-1)中分離的一株能夠生產免疫抑制化合物的絲狀真菌,鑒定此菌為光輪層炭殼菌屬。
[0019]培養基制備:葡萄糖20g、尿素lg、麥芽浸膏20g、磷酸二氫鉀0.5g、七水硫酸鎂
0.5g、氯化鐵0.005g，瓊脂20g (固體培養基)，加入蒸餾水中定容至1L，再以NaOH調節pH值至6.5-7.0，然后在121°C下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得海洋真菌生產免疫抑制化合物
的培養基。
[0020]以下給出發酵操作過程以及Dalesconol A和Dalesconol B的檢測方法:
I)發酵操作過程
將-4°C保存的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii解凍后,用接種針在固體平板培養基中央進行點樣，置于28°C恒溫培養箱，活化培養7-10天，獲得新鮮固體平板培養基，然后置于4°C冰箱保存。然后用接種鏟從新鮮的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii的固體平板培養基中挖取I塊5X5 mm瓊脂塊,接種至裝有400 ml種子培養基的100ml搖瓶中，以28。C、180 rpm搖床發酵培養3_4天，獲得新鮮種子液。取新鮮種子液，按5-20% (v/v)的接種量接入所述發酵培養基，以28° C、180 rpm搖床振蕩培養6_8天，獲得發酵液。
[0021]2) Dalesconol A 和 Dalesconol B 的產量檢測
取50 ml所獲發酵液于250 ml錐形瓶中，加入50 ml乙酸乙酯和30顆直徑為3 mm的玻璃珠，密封后，置于28°C和200 rpm搖床環境進行研磨、萃取I小時，并重復三次，然后取3 ml上層有機相進行減壓旋轉蒸餾除去乙酸乙酯；殘留物用I ml無水甲醇溶解；在相對離心力為13780Xg的條件下離心3分鐘后，取500 μ I上清液，用高效液相色譜法測定Dalesconol A和Dalesconol B的含量，進而通過標準曲線換算成所述發酵液中DalesconolA和Dalesconol B的實際含量。
[0022]本實施例的試驗設計、數據分析及檢測結果如下:
1.Plackett-Burman 試驗設計
Plackett-Burman設計,可對多個不同因子對響應值的顯著性進行分析，從而找出對發酵產量或細胞生長最為重要的培養基組分，分別對每個因子取高(+1)和低(-1 )兩個水平，通過每個因子兩水平之間的差異與整體差異之間的統計分析來確定各因子對相應變量的顯著性。通過Design Expert 8.0數據處理軟件設計,本實驗選取影響因素6個,選用了N=12的PB試驗設計表。各參數所代表的因素及水平見表格(參見表1和表2)。表1中X1,X2, X3，X4，X5和X6分別代表葡萄糖、尿素、麥芽浸膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鐵；￥代表免疫抑制化合物Dalesconol A (以下簡稱DA)和Dalesconol B (以下簡稱DB)的產量和。
[0023]表1 Placket-Burman設計實驗結果
【權利要求】
1.一種用于發酵培養海洋真菌生產免疫抑制化合物的培養基，其特征在于，所述培養基的組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麥芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氫鉀0.4-0.6g/L、七水硫酸鎂0.4-0.6g/L、氯化鐵0.004-0.006g/L。
2.根據權利要求1所述的用于發酵培養海洋真菌生產免疫抑制化合物的培養基，其特征在于，所述培養基的組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖22.98g/L、尿素1.48g/L、麥芽浸膏37.5g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、七水硫酸鎂0.5g/L、氯化鐵0.005g/L。
3.一種用于發酵培養海洋真菌生產免疫抑制化合物的培養基之制備方法，其特征在于，該制備方法的步驟為: 將葡萄糖、尿素、麥芽浸膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鐵加入蒸餾水中定容至1L，使上述成分在培養基中的終濃度分別為11.6-28.4g/L、0.87-2.13g/L、17.39-42.61g/L、0.4-0.6g/L、0.4-0.6g/L、0.004-0.006g/L，再以 NaOH 調節 pH 值至 6.5-7.0，然后在 121。。下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得海洋真菌生產免疫抑制化合物的培養基。
4.一種利用海洋真菌生產免疫抑制化 合物的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: a.將冷凍保存的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii解凍后,在固體平板培養基中央進行點樣并活化培養7-10天，獲得新鮮固體平板培養基，固體平板培養基每隔30天重新活化一次； b.從新鮮的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii的固體平板培養基中挖取I塊瓊脂塊，接種至種子培養基中發酵培養3-4天，獲得新鮮種子液； c.取所述新鮮種子液，按5-20%(v/v)的接種量接入權利要求1和2任一項所述培養基，以28±2° C、180±20 rpm搖床振蕩培養6-8天后，獲得發酵液；以及 d.取所述發酵液進行抽提、萃取、純化，獲得免疫抑制化合物DalesconolA和Dalesconol B。
5.根據權利要求4所述的利用海洋真菌生產免疫抑制化合物的方法，其特征在于，所述海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii是一種光輪層炭殼菌。
【文檔編號】C12P7/26GK104031948SQ201410299672
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】盧艷花, 潘正驊, 譚仁祥, 焦瑞華, 趙國琰 申請人:華東理工大學, 南京大學