轉基因玉米mir604轉化事件特異性定量pcr精準檢測的引物和探針及方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法。本發明采用設計的特異性上游引物序列MIR604eveF、下游引物序列MIR604eveR、熒光探針序列MIR604eveP、MIR604的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix（2×）和水配制成PCR反應體系，進行定量PCR檢測。本發明主要建立了一種高擴增效率、高準確度的Taqman定量PCR檢測技術，適用于國內農業轉基因生物及產品監督檢驗、進出境口岸轉基因生物及產品檢驗、企業內部進口原材料含轉基因MIR604品系生物成分檢測。
【專利說明】轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測的引物和探針及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技術】
[0002]國際上很多國家對轉基因產品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉基因產品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，同時彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系，更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，建立一種新型轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法已成為必要。
[0003]目前關于轉基因玉米MIR604的檢測技術，主要集中在普通定性PCR分析方法和標準，尚無關于擴增檢測轉基因玉米MIR604及產品的轉化事件特異性某特定位點(基因序列)的定量PCR精準檢測技術。

【發明內容】

[0004]本發明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米MIR604及產品的轉化事件特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術。
[0005]本發明通過下述技術 方案實現:
轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測的引物和探針，
其中，上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’ ；
下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’ ；
熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’。
[0006]轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法，包括以下步驟:
(1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’
下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’
熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’ ；
(2)制備MIR604的DNA稀釋液；
(3)配制PCR反應體系；
(4)定量PCR檢測。
[0007]進一步地，步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
[0008]再進一步地，步驟(3)所述的配制PCR反應體系，即將DNA稀釋液加入到反應體系中配制成20μ1的反應體系，所述20μ1的反應體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物ιμL下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液4.ΟμL
水3.5μ1。
[0009]另外，所述PCR反應條件為:95°C預變性lOmin，I個循環；95°C變性15s，60°C退火60s, 45個循環。
[0010]本發明具有以下優點及有益效果:
(1)本發明打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘；
(2)本發明彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系；
(3)本發明提供的檢測技術可更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權；
(4)本發明擴增效率高、準確度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發明對非目標轉化體的轉基因作物和非轉基因作物的檢測結果圖。【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式并不限于此。實施例
[0013]轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法，主要包括以下步驟:
(I)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’
下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’
熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’。
[0014]本實施例引物及熒光探針的合成濃度均為10Mmol/l。
[0015]以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對轉基因玉米MIR604及產品的轉化事件特異性某特定位點，即目的基因與受體玉米基因組旁側位點設計；通過該設計就可以精準檢測轉基因玉米中MIR604的轉化事件。
[0016](2)制備MIR604的DNA稀釋液；即采用常規的DNA提取手段，從轉基因玉米MIR604中提取出濃度為50ng/^l的DNA稀釋液。
[0017](3)配制PCR反應體系；即將DNA稀釋液加入到反應體系中配制成20μ1的反應體系，所述20μ1的反應體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物ιμL
下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液4.ΟμL
水3.5μ1。
[0018](4)定量 PCR 檢測。[0019]根據上述PCR反應體系，在以下PCR反應條件下對產物進行擴增并檢測，所述PCR反應條件為:95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，60°C退火60s，45個循環。本實施例中采用的是ABI公司生產的7500型熒光定量PCR儀器。
[0020]采用本發明對非轉基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個玉米轉化體，5個水稻轉化體，5個大豆轉化體，3個棉花轉化體，3個油菜轉化體和I個甜菜轉化體進行了特異性檢測，檢測結果如圖1所示，從圖1可看出本發明設計的引物和探針對以上非轉基因作物和轉基因轉化體均沒有非特異擴增。另外圖1中Λ Rn代表熒光原始信號減去背景信號的值。
[0021]同時，采用本發明對1%的轉基因玉米MIR604轉化事件特異性片段進行定量檢測，連續重復做10個平行樣品的檢測數據見表1。
[0022] 表1檢測樣品(1%，CRM)轉基因玉米MIR604特異片段定量檢測結果
【權利要求】
1.轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測的引物和探針，其特征在于， 上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’ ； 下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’ ； 熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’。
2.轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’ 下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’ 熒光探針序列，MIR604eveP:5’-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’ ； (2)制備MIR604的DNA稀釋液； (3)配制PCR反應體系； (4)定量PCR檢測。
3.根據權利要求2所述的轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(1)所 述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4.根據權利要求3所述的轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的配制PCR反應體系，即將DNA稀釋液加入到反應體系中配制成2θμL的反應體系,所述2θμL的反應體系包括以下組分: Taqman Master mix (2X )10M-1 上游引物ιμL 下游引物ιμL 熒光探針0.5μ1 DNA稀釋液4.ΟμL 水3.5μ1。
5.根據權利要求2或4所述的轉基因玉米MIR604轉化事件特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，所述PCR反應條件為:95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，60°C退火60s,45個循環。
【文檔編號】C12N15/11GK104032027SQ201410304821
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】常麗娟, 宋君, 雷紹榮, 郭靈安, 劉勇, 王東, 尹全, 劉文娟, 張富麗 申請人:四川省農業科學院分析測試中心