轉基因玉米das-40278-9品系特異定量pcr精準檢測的引物和探針及方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測方法。本發明采用設計的特異性上游引物序列DAS-40278-9event-F、下游引物序列DAS-40278-9event-R、熒光探針序列DAS-40278-9event-P、DAS-40278-9品系的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix（2×）和水配制成PCR反應體系，進行定量PCR檢測。本發明主要建立了一種高擴增效率、高準確度的Taqman定量PCR檢測技術，適用于國內農業轉基因生物及產品監督檢驗、進出境口岸轉基因生物及產品檢驗、企業內部進口原材料含轉基因DAS-40278-9品系生物成分檢測。
【專利說明】轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測的引物和探針及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技術】
[0002]國際上很多國家對轉基因產品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉基因產品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，同時彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系，更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，建立一種新型轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測方法已成為必要。
[0003]目前關于轉基因玉米DAS-40278-9的檢測技術，主要集中在普通定性PCR分析方法和標準，尚無關于擴增檢測轉基因玉米DAS-40278-9及產品的品系特異性某特定位點(基因序列)的定量PCR精準檢測技術。

【發明內容】

[0004]本發明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米DAS-40278-9及產品的品系特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術。
[0005]本發明通過下述技術方案實現:
[0006]轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測的引物和探針，
`[0007]上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’-GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’ ；
[0008]下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’ ；
[0009]熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3，。
[0010]轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測方法，包括以下步驟:
[0011](I)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
[0012]上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’ -GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’
[0013]下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’
[0014]熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3’ ；
[0015](2)制備DAS-40278-9品系的DNA稀釋液；
[0016](3)配制PCR反應體系；
[0017](4)定量 PCR 檢測。
[0018]進一步地，步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為ΙΟμπιοΙ/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/ μ I。
[0019]再進一步地，步驟(3)所述的配制PCR反應體系，即將3 μ I的DNA稀釋液加入到20 μ I反應體系中，所述20 μ I的反應體系包括以下組分:[0020]
【權利要求】
1.轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測的引物和探針，其特征在于， 上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’ -GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’ ； 下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’ ； 熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3，。
2.轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’ -GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’ 下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’ 熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3，； (2)制備DAS-40278-9品系的DNA稀釋液； (3)配制PCR反應體系； (4)定量PCR檢測。
3.根據權利要求2所述的轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4.根據權利要求3所述的轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的配制PCR反應體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到20μ1反應體系中，所述2θμ?的反應體系包括以下組分: Taqman Master mix (2X )10M-1上游引物1ul下游引物1ul 熒光探針0.5μ1 DNA稀釋液3.0ul水4.5μ1。
5.根據權利要求2或4所述的轉基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，所述PCR反應條件為:95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，60°C退火60s，45個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK103820566SQ201410094053
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】尹全, 宋君, 雷紹榮, 郭靈安, 劉勇, 王東, 張富麗, 劉文娟, 常麗娟 申請人:四川省農業科學院分析測試中心