基于lamp的轉基因玉米m0n863基因快檢試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及生物檢測試劑及方法，具體是指轉基因玉米M0N863的環介導等溫擴增引物的設計及其環介導等溫擴增檢測試劑和方法。本發明針對M0N863基因整合圖譜中Cry3Bbl基因和tahspl7基因的連接區域設ii^一套引物，由兩對引物構成，特異性好。檢測方法包括基因組的提取、環介導等溫擴增以及顯色反應，操作簡便、靈敏度高、反應快速、結果判定方便。另外本發明的試劑盒由引物、反應液、BstDNA聚合酶、顯色劑等組成，利用該試劑盒檢測M0N863品系，具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、肉眼判定結果等優點，為轉基因植物檢測提供了有效、快速的檢測方法。
【專利說明】基于LAMP的轉基因玉米M0N863基因快檢試劑盒及檢測方 法

【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及生物檢測試劑及方法，基于環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP),涉及一種轉基因植物檢測方法，具體涉及一種用于檢 測轉基因玉米M0N863特定基因Cry3Bbl和tahspl7的環介導等溫擴增引物及其環介導等 溫擴增檢測方法。

【背景技術】
[0002] M0N863為孟山都公司產品，抗蟲基因為Cry3Bbl，來自蘇云金芽孢桿菌熊本亞種 (B. thuringiensis subsp. KumamotoensisXCrySBbl蛋白對鱗翅目家族的昆蟲具有抗性， 由于公眾對轉基因食品安全性的質疑，各國設定了相應的限量標準。并且目前基于M0N863 品系的檢測技術，主要集中在普通的定性及定量PCR方法和標準，尚無關于檢測轉基因玉 米M0N863品系特定位點的環介導等溫檢測技術。
[0003] 環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)是Notomi等于2000年發明的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基 因的6個區域設計4-6條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在等溫條件下（60-65°C)反應，在Ih內即可完成核酸擴增反應，目的片段可以 擴增109倍。該方法具有特異性強、靈敏度高、擴增效率高、省時、操作簡單等優點，在核酸 檢測方面具有明顯優勢。
[0004] 本發明具有較高的檢測靈敏度，最低檢測限可達約4個單倍體基因組拷貝數，為 轉基因植物檢測提供了一種快速的篩檢方法。


【發明內容】

[0005] 為了建立了一種針對于轉基因玉米M0N863的恒溫檢測方法，本發明的一個目的 是提供了一套環介導等溫擴增技術快速檢測用引物；本發明的第二個目的是建立了環介導 等溫擴增檢測方法；根據檢測方法實現了本發明的第三個目的，提供了使用上述檢測用引 物的試劑盒；本發明的試劑盒和檢測方法具有簡便、靈敏、快速、特異性好等特點，提供了一 種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米M0N863的檢測方法。
[0006] 本發明的第一個目的提供的用于M0N863鑒定的環介導等溫擴增的引物，包括兩 條外引物（M0N863-F3/M0N863-B3)、兩條內引物（M0N863-FIP/M0N863-BIP)、兩條環引物 (M0N863-LF/M0N863-LB)，該引物組對于檢測M0N863具有特異性。上述引物的核苷酸序列 分別為：

【權利要求】
1?轉基因玉米MON863品系環介導等溫擴增的檢測用引物，其特征在于，所述引物為一 套特征引物，一套引物由三對引物組成，一對引物為外引物，一對引物為內引物，一對引物 為環引物，序列分別為：
2. -種轉基因玉米M0N863品系的檢測方法，其特征在于，權利要求1的引物是以 M0N863的Cry3Bbl基因和tahspl7基因的連接片段為靶基因設計的，通過環介導等溫擴增 方法用權利要求1所述的檢測引物對樣品的DNA選擇性擴增所述的靶基因片段，確認是否 存在有擴增產物。
3. 根據權利要求2所述的轉基因玉米M0N863體系的檢測方法，其特征在于，該檢測方 法具體為： (1) 模板的提?。簩悠纺コ煞勰?，稱IOOmgilOmg樣品，用CTAB方法提取基因組。 (2) 環介導等溫擴增體系包括：1.4-2.0禮〇1仰？、2-811111§304、0.6-1.01甜菜堿， 0? 2-1. 6iiM 外引物（M0N863-F3，M0N863-B3)、0. 2y M 內引物（MON863-FIP，MON863-BIP)， 0.8liM 環引物（MON863-LF，MON863-LB)、3.0-10.0U Bst DNA 聚合酶、lx Thermopol buffer (包含：20mM Tris-HCl (pH8. 8@25。(：），IOmM KC1，IOmM(NM) 2S04, 2mM MgS04, 0. 1%. Triton X-100)。 (3) 環介導等溫反應產物的檢測： 利用電泳檢測、熒光檢測環介導反應產物是否有擴增產物。
4. 轉基因玉米M0N863品系環介導等溫擴增技術快速診斷試劑盒，其特征在于，該試劑 盒包括如權利要求1所述的引物組、權利要求 3所述的反應液、Bst DNA聚合酶以及一張陽 性定量標準曲線。
5. 根據權利要求5所述的轉基因玉米M0N863品系環介導等溫擴增技術快速診斷試劑 盒，其特征在于，所述的引物組由體積比為1:1:6:6:4:4的上下游外引物、上下游內引物與 上下游環引物組成。
6. 根據權利要求5所述的轉基因玉米M0N863品系環介導等溫擴增技術快速診斷試劑 盒，其特征在于，反應液是由體積比為5:8:1:10的lx Thermopol buffer、l_4_2. OmM dNTP、 2-8mM MgS04、0. 6-L OM 甜菜堿組成。
7. 根據權利要求5所述的轉基因玉米M0N863品系環介導等溫擴增技術快速診斷試劑 盒，其特征在于，Bst DNA聚合酶每微升含3-10個活性單位。
8. 根據權利要求5所述的轉基因玉米MON863品系環介導等溫擴增技術快速診斷試劑 盒，其特征在于，試劑盒還包括2〇X SYBR GREEN I熒光染料，稀釋后可作為顯色劑，以及一 份定量標準曲線圖。
9. 根據權利要求3所述的轉基因玉米MON863品系環介導等溫擴增技術快速診斷試劑 盒，其特征在于，普通定性環介導等溫擴增反應程序： 64°C反應40min。反應所使用的儀器 為普通PCR，水浴鍋以及恒溫培養箱。
10.根據權利要求3所述的轉基因玉米M0N863品系環介導等溫擴增技術快速診斷試 劑盒，其特征在于，定量環介導等溫擴增反應程序：64°C反應40min，85°C放置3min，終止反 應。反應所使用的儀器為定量PCR。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212880SQ201310313904
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年7月24日 優先權日:2013年7月24日
【發明者】黃昆侖, 許文濤, 閆興華, 翟百強, 羅云波, 徐瑗聰, 商穎, 董凱 申請人:北京福德安科技有限公司, 中國農業大學