一種光學純r-乙偶姻的生產(chǎn)方法
【專利摘要】一種光學純R-乙偶姻的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：將(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因(bdh)和葡萄糖脫氫酶基因(gdh)在大腸桿菌中共表達，并以此重組大腸桿菌休止細胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)光學純R-乙偶姻。葡萄糖脫氫酶能夠提供(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶所需的輔酶NADH，而(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶在NADH存在的條件下具有催化丁二酮生成光學純R-乙偶姻的特性，R-乙偶姻的產(chǎn)量可達26g/L，光學純度為99.6％。本發(fā)明的方法培養(yǎng)基簡單，操作過程簡便，產(chǎn)物分離方便，不需要復(fù)雜的手性拆分步驟，并且實現(xiàn)胞內(nèi)輔酶的再生，成本低，極具工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說明】一種光學純R-乙偶姻的生產(chǎn)方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種光學純R-乙偶姻的生產(chǎn)方法，具體是將（R，R)_2,3-丁二醇脫氫 酶基因（bdh)和葡萄糖脫氫酶基因（gdh)在大腸桿菌中表達，并以此重組大腸桿菌休止細 胞為生物催化劑，以丁二酮和葡萄糖為底物高效生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 乙偶姻（acetoin)，即 3_ 輕基 _2_ 丁酮（3-hydroxy-2_butanone)，有兩種旋光異 構(gòu)體（R-乙偶姻和S-乙偶姻），天然地存在于乳品、黃油、干酪、酒類、玉米、葡萄、蘋果、草 莓、可可等各類食品中，國家標準GB2760-86規(guī)定其為允許添加食用的食品香料。乙偶姻應(yīng) 用廣泛，其具有明顯的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生產(chǎn)。此 夕卜，乙偶姻是一種重要的化學合成中間體和多功能材料，2004年美國能源部將乙偶姻列為 30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺化合物之一，可廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工等領(lǐng)域。例如，80%含 量的乙偶姻俗稱"醋嗡"，是酒類調(diào)香中一個極其重要的品種。含有乙偶姻和丁二酮的混合 物還可以用來治療乳腺炎。在制藥工業(yè)中，光學純乙偶姻作為具有立體結(jié)構(gòu)專一的化合物 可以用來合成合成具有光學活性的手性藥物，從而較大程度地提高藥效，減輕藥物的副作 用。此外，光學純乙偶姻還可用于合成手性液晶復(fù)合材料。
[0003] 光學純乙偶姻的生產(chǎn)方法主要分為兩類：化學合成法與生物合成法。化學合成 的原料來源于不可再生的化石資源--石油，原料來源受到限制，且合成過程繁瑣，最后 還需要通過化學法進行復(fù)雜的手性拆分，存在成本高、收率低、光學純度低、高能耗、高污 染的問題，因此難以實現(xiàn)低成本大規(guī)模生產(chǎn)。生物合成方法生產(chǎn)乙偶姻具有諸多優(yōu)點， 如產(chǎn)品綠色天然、反應(yīng)條件溫和、污染少、能耗低，是一種十分具有發(fā)展前景的環(huán)境友好 合成方法，近年來受到了越來越多的關(guān)注。然而，天然微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一般都是R-乙 偶姻和S-乙偶姻的旋光異構(gòu)體混合物，發(fā)酵產(chǎn)物手性拆分工藝繁瑣，成本高昂。1984 年，Ui等報道了利用Pseudomonas sp. S-4發(fā)酵法合成單一構(gòu)型R-乙偶姻【]\?61'1116111:· Technol·，1984, 62:151-156】。該法存在產(chǎn)物濃度低（1.72g/L)和發(fā)酵周期長（48h)的 問題。中國專利申請?zhí)朇N201310346916. 8于2013年公開了郝健等利用一株克雷伯氏 肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)突變菌株發(fā)酵生產(chǎn)R-乙偶姻，最高產(chǎn)量為35. 7g/ L。然而，Κ· pneumoniae被世界衛(wèi)生組織列為致病菌株（Risk group2, pathogenic microorganisms)，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的安全性原則在很大程度上限制了其應(yīng)用 [Biotechnol. Adv. , 2009, 27:715-725 ；Appl.Environ. Microbiol. , 2011, 77:5467-5475 ； Bioresour. Technol. , 2012, 124:237-244】。
[0004] 鑒于此，人們嘗試構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌株來合成R_乙偶姻。1998年，Ui 等將Κ· pneumoniae編碼α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脫羧酶和meso-2, 3-丁二 醇脫氫酶的基因簇整合到大腸桿菌中，然后將meso-2, 3-丁二醇脫氫酶的編碼基因敲 除，獲得的重組大腸桿菌可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生17. 5g/L光學純R-乙偶姻【Lett. Appl. Microbiol.，1998, 26:275-278】，但發(fā)酵法由于發(fā)酵液成分復(fù)雜，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物分離提取困 難。此外，該法還存在發(fā)酵周期長和底物轉(zhuǎn)化率低的問題，限制了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
[0005] 多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)的（R, R)-2, 3- 丁 二醇脫 氫酶在NADH存在的條件下可以催化丁二酮還原為R-乙偶姻【Appl. Environ. Microbiol.，2011，77:4230-4233】。兩株 P. polymyxa(ATCC12321 和 ZJ-9)的 bdh 基因已 被證明編碼（R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶【Appl. Environ. Microbiol.，2011，77:4230-4233 ; J. Basic.Microbiol.，2012, 52, 1-9】，但目前尚未有 P. polymyxa DSM365 菌株 bdh 基因 的相關(guān)信息報道。中國專利申請?zhí)朇N201010564858公開了一種使用純酶催化還原丁 二酮的方法制備光學純R-乙偶姻，通過構(gòu)建重組大腸桿菌表達P. polymyxa ATCC12321 菌株的（R，R)_2, 3- 丁二醇脫氫酶，然后破碎細胞，通過表達產(chǎn)物分離純化獲得純化的 (R，R) -2, 3- 丁二醇脫氫酶。在加入輔酶NADH的條件下，純化的（R，R) -2, 3- 丁二醇脫氫酶 可以轉(zhuǎn)化丁二酮產(chǎn)生光學純R-乙偶姻。純酶催化方法具有產(chǎn)物分離純化簡便的優(yōu)點，但需 要破碎細胞和分離純化酶，而且需要加入昂貴的輔酶NADH，工藝繁瑣，成本較高。
[0006] 休止細胞催化是指利用完整的休止細胞作為生物催化劑進行生物轉(zhuǎn)化，其本質(zhì) 是利用細胞內(nèi)的各種酶進行催化反應(yīng)，綜合了發(fā)酵法和酶法催化這兩種技術(shù)的優(yōu)點，克 服了發(fā)酵法存在的諸多缺點。至今有兩篇文獻報道使用休止細胞催化的方法制備光學 純R -乙偶姻。2002年，Yamada-Onodera等在大腸桿菌中表達Hansenula polymorpha 的甘油脫氫酶，然后將重組大腸桿菌休止細胞作為全細胞生物催化劑轉(zhuǎn)化光學純 〇?，1〇-2,3-丁二醇為1?-乙偶姻，產(chǎn)物光學純度達到了99.9%，但是產(chǎn)量很低（9.68 8/ L)【Acta Biotechnol, 2002, 22:355-362】。此外，中國專利申請?zhí)?CN200910013902. 8; PLoS ONE, 2010,5:e8860等通過構(gòu)建重組大腸桿菌異源表達來自于Bacillus subtilis的 (R, R)-2, 3-丁二醇脫氫酶和來自于Lactobacillus brevis的NADH氧化酶，獲得能夠催 化光學純（R，R)-2, 3- 丁二醇成為光學純R-乙偶姻的重組大腸桿菌生物催化劑，但產(chǎn)物光 學純度較低（96%)。然而，上述的休止細胞催化反應(yīng)均需要使用工業(yè)難以制備的昂貴原 料--光學純（R，R)_2, 3-丁二醇，難以實現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。而丁二酮價格遠遠低于 光學純（R，R)-2, 3- 丁二醇，若能利用其為前體合成光學純R-乙偶姻，則能有效降低R-乙 偶姻的生產(chǎn)成本，從而更具有商業(yè)化應(yīng)用前景。
[0007] 經(jīng)廣泛的文獻和專利檢索，我們發(fā)現(xiàn)來源于枯草芽孢桿菌168的葡萄 糖脫氧酶基因 gdh，作為輔酶在文獻Engineering of cofactor regeneration enhances (2S，3S)-2, 3-butanediol production from diacetyl·中已被報道[SCIENTIFIC REPORTS.，2013, 3:1-6]。但目前尚未有 P. polymyxa DSM365 菌株（R, R)-2, 3- 丁二醇脫氫 酶基因（bdh)的相關(guān)信息報道；而將該基因與葡萄糖脫氫酶基因（gdh)在大腸桿菌中進行 共表達，并以此重組菌株制備休止細胞生物催化劑實現(xiàn)偶聯(lián)丁二酮還原和輔酶NADH再生 的R-乙偶姻生產(chǎn)方法，國內(nèi)外亦無公開文獻專利報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對上述現(xiàn)有方法中存在的R-乙偶姻產(chǎn)量低、光學純度低、產(chǎn)物提取困難、成本 高、難以大規(guī)模低成本生產(chǎn)的不足，本發(fā)明提供一種光學純R-乙偶姻的生產(chǎn)方法。
[0009] 本發(fā)明是利用（R，R)_2, 3- 丁二醇脫氫酶可以立體專一的催化丁二酮生成光學純 R-乙偶姻，以及葡萄糖脫氫酶能夠?qū)崿F(xiàn)胞內(nèi)輔酶NADH再生的性質(zhì)，將（R，R)-2, 3-丁二醇脫 氫酶基因（bdh)和葡萄糖脫氫酶基因（gdh)導(dǎo)入大腸桿菌中進行共表達，以此重組大腸桿 菌休止細胞為生物催化劑轉(zhuǎn)化丁二酮，實現(xiàn)光學純R-乙偶姻的高效低成本合成。
[〇〇1〇] 本發(fā)明所述生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法，是將（R，R)_2, 3-丁二醇脫氫酶基因 (bdh)和葡萄糖脫氫酶基因（gdh)導(dǎo)入大腸桿菌中進行共表達，以此重組大腸桿菌休止細 胞為生物催化劑，以丁二酮為前體，葡萄糖為輔酶再生原料，實現(xiàn)光學純R-乙偶姻的高效 低成本合成。
[0011] 其中：所述（R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶基因可來源于多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、解淀粉芽抱桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯 菌（Klebsiella oxytoca)、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)和地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)〇
[0012] 進一步的，所述（R，R)_2, 3-丁二醇脫氫酶基因來源菌株優(yōu)選是Paenibacillus polymyxa DSM365。該菌株購于德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，菌株編號是 DSM365。
[0013] 上述的重組大腸桿菌是采用常規(guī)的方法先克?。≧，R)_2, 3- 丁二醇脫氫酶基因 (bdh)和葡萄糖脫氫酶基因（gdh)，再構(gòu)建pETDuet-bdh-gdh重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，優(yōu) 選大腸桿菌BL21中，然后經(jīng)篩選獲得；其含有bdh和gdh基因，為革蘭氏陰性菌，需氧或兼 性厭氧生長，較佳培養(yǎng)溫度為37°C，其休止細胞可用于催化丁二酮生產(chǎn)光學純R-乙偶姻。
[0014] 其中，上述重組大腸桿菌所含的Paenibacillus polymyxa DSM365的 (R，R)-2, 3-丁二醇脫氫酶基因（bdh)序列長度為1053個堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所含的Bacillus subtilisl68的葡萄糖脫氫酶基因（gdh)序列長度為786個 堿基，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0015] 本發(fā)明所述生產(chǎn)光學純R_乙偶姻的方法中，以重組大腸桿菌/pETDuet-bdh-gdh 休止細胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的具體方法是：
[0016] (1)平板培養(yǎng)：將重組大腸桿菌劃線到含有質(zhì)量體積比為1. 5?1. 8%瓊脂的并含 有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時；
[0017] (2)種子培養(yǎng)：在無菌的條件下，用牙簽挑取步驟（1)平板上的一個單菌落，然后 接種到10?100mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)；
[0018] (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，取步驟（2)所得的菌液以體積比為1?10%的接 種量接種到〇. 5?10L的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2?10 小時，然后再加入終濃度為〇. 1?3mM的IPTG，10?37°C誘導(dǎo)2?20小時，得到一種培養(yǎng) 物；
[0019] 其中，上述步驟（1)?⑶中所述的LB培養(yǎng)基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母 粉，10g/L NaCl，121°C條件下滅菌15分鐘；
[0020] (4)收集菌體：將步驟（3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物5, 000?8, OOOrpm離心5?15分 鐘；并用生理鹽水洗滌菌體2?3遍，然后將細胞懸浮于pH6?8的緩沖液中，使細胞干重的 終濃度為2?20g/L，即得到重組大腸桿菌休止細胞生物催化劑，置于4°C的冰箱中待用；
[0021] (5)轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備光學純R-乙偶姻：以細胞干重濃度為2?20g/L的生物催化劑， 在10?42°C、pH5?9條件下，50?200rpm震蕩條件下對底物進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化初始濃度為 5?25g/L的丁二酮，并加入10?100g/L的葡萄糖以補充反應(yīng)所需輔酶因子的消耗；每隔 3小時取樣，樣品以8, 000?12000rpm離心5?15分鐘，去除所加入的全細胞生物催化劑； 利用氣相色譜方法檢測上清中丁二酮的濃度，間隔補加丁二酮，使反應(yīng)體系中的丁二酮濃 度維持在5?25g/L之間；利用SBA生物傳感分析儀檢測葡萄糖濃度，使反應(yīng)體系中的葡萄 糖濃度維持在5?50g/L之間。對上清進行氣相色譜分析測定轉(zhuǎn)化液中乙偶姻的濃度及光 學純度，R-乙偶姻光學純度的計算方法：ee= ([R] - [S]V([R] + [S])X100% ;當R-乙偶 姻的濃度不再增加時，停止轉(zhuǎn)化。
[0022] 上述生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法中：
[0023] 步驟（3)所述誘導(dǎo)溫度優(yōu)選10?30°C ;誘導(dǎo)時間優(yōu)選10?20小時。
[0024] 步驟（5)所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)優(yōu)選細胞干重濃度為5?20g/L，在20?37°C，pH6?9條 件下對丁二酮進行轉(zhuǎn)化。
[0025] 步驟（5)所述初始丁二酮濃度優(yōu)選10?20g/L，初始葡萄糖濃度優(yōu)選20?50g/ L〇
[0026] 步驟（5)所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中補加丁二酮和葡萄糖，丁二酮濃度優(yōu)選維持在10? 20g/L，葡萄糖濃度優(yōu)選維持在10?50g/L。
[0027] 本發(fā)明首次成功的實現(xiàn)了將（R，R)_2, 3- 丁二醇脫氫酶基因（bdh)和葡萄糖脫氫 酶基因（gdh)在大腸桿菌中表達，并以此重組大腸桿菌休止細胞作為生物催化劑，以丁二 酮為前體，葡萄糖為輔酶再生原料，高效生產(chǎn)光學純R-乙偶姻。
[0028] 本發(fā)明具有以下特點：
[0029] (1)首次構(gòu)建并應(yīng)用了可以共表達（R，R)_2, 3-丁二醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的 重組大腸桿菌，其休止細胞可作為生物催化劑用于轉(zhuǎn)化丁二酮高效生產(chǎn)光學純R-乙偶姻。
[0030] (2) (R，R)-2, 3-丁二醇脫氫酶催化丁二酮生成光學純R-乙偶姻；葡萄糖脫氫酶能 夠?qū)崿F(xiàn)胞內(nèi)輔酶的再生，提供（R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶所需的NADH。
[0031] (3)菌株要求的培養(yǎng)基簡單、成本低。
[0032] (4)直接用完整的重組大腸桿菌休止細胞作為生物催化劑進行轉(zhuǎn)化，不需要破碎 細胞和分離純化酶，操作過程簡單。
[0033] (5)反應(yīng)體系中僅存在單一構(gòu)型的R-乙偶姻，因此不需要復(fù)雜的手性拆分步驟。
[0034] (6)生物催化劑可以用過濾法或離心法去除，后續(xù)精餾分離提取費用低廉。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1大腸桿菌的蛋白電泳圖。M:Maker ;1 :大腸桿菌BL21 ;2 :大腸桿菌BL21/ pETDuet-1 ;3 :大腸桿菌 BL21/pETDuet_gdh ;4 :大腸桿菌 BL21/pETDuet_bdh-gdh ;5 :純化 的（R, R) _2, 3- 丁二醇脫氫酶。 【具體實施方式】
[0036] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所述的內(nèi)容僅限于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā) 明。
[0037] 實施例1
[0038] 重組大腸桿菌BL21/pETDuet-bdh_gdh的構(gòu)建
[0039] 用常規(guī)的方法制備菌株P(guān)aenibacillus polymyxa DSM365的基因組DNA，對該 菌株的基因組進行全序列測序和代謝網(wǎng)絡(luò)解析，并對相關(guān)基因進行注釋和功能鑒定，獲 得了該菌株的（R，R)_2, 3- 丁二醇脫氫酶基因的編碼序列；使用合成的引物P1和P2,以 P. polymyxa DSM365的基因組DNA為模板，PCR擴增得到（R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶基因 (bdh)。Bacillus subtilisl68菌株的基因組序列從NCBI數(shù)據(jù)庫上獲得，使用合成的引物 P3和P4,以B. subtilisl68的基因組DNA為模板，PCR擴增得到葡萄糖脫氫酶基因（gdh)。
[0040] 所述的PI、P2、P3和P4序列分別為：
[0041] P1 :5, -GATGCCATGGAAGCATTGAGATGGCATGG-3,；
[0042] P2 :5, -TCGCGAGCTCTTAAGCTTGCGGAGATACCAG-3，。
[0043] P3 :5' -CGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGG-3' ；
[0044] P4 :5' -GATCCAGACGTCTTAACCGCGGCCTGC-3'。
[0045] 上述bdh基因序列長度為1053個堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述；gdh基 因序列長度為786個堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
[0046] 將PCR擴增得到的兩個PCR產(chǎn)物分別雙酶切并連接到pETDuet-1質(zhì)粒，得到重組 質(zhì)粒pETDuet-bdh-gdh ;將上述重組質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主大腸桿菌BL21，得到重組大腸 桿菌BL21/pETDuet-bdh-gdh。該菌株在含100μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)3小時，加入終濃度為0. 5mM的IPTG，16°C誘導(dǎo)10小時，得到表達有（R，R)-2, 3- 丁二 醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌細胞，經(jīng)12. 5%的SDS-PAGE驗證，結(jié)果如圖1所 /_J、1 〇
[0047] 上述重組大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生長，可以用于催化丁二酮 生產(chǎn)光學純R-乙偶姻。
[0048] 實施例2
[0049] 重組大腸桿菌休止細胞生物催化劑的制備
[0050] (1)平板培養(yǎng)：將重組大腸桿菌BL21/pETDuet-bdh-gdh劃線到含有質(zhì)量體積比為 1. 8%瓊脂的并含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時；
[0051] (2)種子培養(yǎng)：在無菌的條件下，用牙簽挑取步驟（1)平板上的一個單菌落，然后 接種到20mL的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)12小 時；
[0052] (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，取步驟⑵所得的菌液以體積比為1%的接種量 接種到2L含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3小時，然后再加入終 濃度為〇. 5mM的IPTG，16°C誘導(dǎo)10小時，停止培養(yǎng)；
[0053] 其中，上述步驟（1)?⑶中所述的LB培養(yǎng)基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母 粉，10g/LNaCl，121°C條件下滅菌15分鐘；
[0054] (4)收集菌體：將步驟（3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物8, OOOrpm離心5分鐘；并用生理鹽 水洗滌菌體2遍，然后將細胞懸浮于pH7的緩沖液中，使細胞干重的終濃度為15g/L，即得到 重組大腸桿菌休止細胞生物催化劑，置于4°C的冰箱中待用。
[0055] 實施例3
[0056] 利用重組大腸桿菌休止細胞作為生物催化劑制備光學純R_乙偶姻
[0057] 選擇上述獲得的重組大腸桿菌休止細胞作為催化劑進行如下轉(zhuǎn)化過程：在30°C、 pH7條件下，180rpm搖床震蕩，轉(zhuǎn)化初始濃度為20g/L的丁二酮，并加入20g/L的葡萄糖以 補充反應(yīng)所需輔因子的消耗；每隔3小時取樣，樣品以8, OOOrpm離心10分鐘，去除所加入 的全細胞生物催化劑，利用氣相色譜方法檢測上清中丁二酮的濃度，根據(jù)丁二酮濃度補加 丁二酮，使丁二酮濃度維持在10?20g/L之間；對上清進行氣相色譜分析測定轉(zhuǎn)化液中 R-乙偶姻的濃度及光學純度；16小時后檢測結(jié)果顯示：R-乙偶姻的濃度為26g/L，其光學 純度為99. 6%。
[0001]
[0002]
[0003]
【權(quán)利要求】
1. (R，R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因 bdh，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
2. -種光學純R_乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟：將所述 (R，R) -2, 3- 丁二醇脫氫酶基因 bdh以及葡萄糖脫氫酶基因 gdh在大腸桿菌中表達，并以此 重組大腸桿菌休止細胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)光學純R-乙偶姻。
3. 如權(quán)利要求2所述生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，所述以重組大腸桿 菌休止細胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法，包括如下步 驟： (1) 平板培養(yǎng)：將重組大腸桿菌劃線到含有質(zhì)量體積比為1. 5?1. 8%瓊脂的并含有 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)； (2) 種子培養(yǎng)：在無菌的條件下，用牙簽挑取步驟（1)平板上的一個單菌落，然后接種 到10?100mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)； (3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，取步驟（2)所得的菌液以體積比為1?10%的接種量 接種到0. 5?10L的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)2?10小 時，然后再加入終濃度為〇. 1?3mM的IPTG，10?37°C誘導(dǎo)2?20小時，得到一種培養(yǎng)物； 其中，上述步驟（1)?（3)中所述的LB培養(yǎng)基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/ LNaCl，121°C條件下滅菌15分鐘； (4) 收集菌體：將步驟（3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物5, 000?8, OOOrpm離心5?15分鐘；并 用生理鹽水洗滌菌體2?3遍，然后將細胞懸浮于pH6?8的緩沖液中，使細胞干重的終濃 度為2?20g/L，即得到重組大腸桿菌休止細胞生物催化劑，置于4°C的冰箱中待用； (5) 轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備光學純R-乙偶姻：以細胞干重濃度為2?20g/L的生物催化劑，在 10?42°C、pH5?9條件下，50?200rpm震蕩條件下對底物進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化初始濃度為5? 25g/L的丁二酮，并加入10?100g/L的葡萄糖以補充反應(yīng)所需輔酶因子的消耗；間隔補加 丁二酮和葡萄糖，使反應(yīng)體系中的丁二酮濃度維持在5?25g/L之間，葡萄糖濃度維持在 5?50g/L之間，當R-乙偶姻的濃度不再增加時，停止轉(zhuǎn)化。
4. 如權(quán)利要求3所述生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟（3)所述誘導(dǎo)溫 度優(yōu)選10?30°C ;誘導(dǎo)時間優(yōu)選10?20小時。
5. 如權(quán)利要求3所述生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟（5)所述轉(zhuǎn)化反 應(yīng)優(yōu)選細胞干重濃度為5?20g/L，在20?37°C，pH6?9條件下對丁二酮進行轉(zhuǎn)化。
6. 如權(quán)利要求3所述生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟（5)所述初始丁 二酮濃度優(yōu)選10?20g/L，初始葡萄糖濃度優(yōu)選20?50g/L。
7. 如權(quán)利要求3所述生產(chǎn)光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟（5)所述轉(zhuǎn)化反 應(yīng)過程中補加丁二酮和葡萄糖，丁二酮濃度優(yōu)選維持在10?20g/L，葡萄糖濃度優(yōu)選維持 在 10 ?50g/L。
8. (R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶基因 bdh在光學純R-乙偶姻生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/19GK104087602SQ201410341765
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】謝能中, 黃日波, 李檢秀, 郭鈴, 黃艷燕, 杜奇石, 王青艷, 李億 申請人:廣西科學院