一種手性純s-乙偶姻的生產(chǎn)方法
【專(zhuān)利摘要】一種手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：將丁二酮還原酶基因(dar)和葡萄糖脫氫酶基因(gdh)在大腸桿菌中共表達(dá)，并以此重組大腸桿菌休止細(xì)胞為生物催化劑，以丁二酮和葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)手性純S-乙偶姻。丁二酮還原酶具有催化丁二酮生成手性純S-乙偶姻的特性，而葡萄糖脫氫酶能夠提供丁二酮還原酶所需的輔酶NADH，S-乙偶姻的產(chǎn)量可達(dá)28g/L，光學(xué)純度為99.7％。本發(fā)明方法培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，操作過(guò)程簡(jiǎn)便，產(chǎn)物S-乙偶姻分離方便，不需要復(fù)雜的手性拆分步驟，并且實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)輔酶再生，成本低，極具工業(yè)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種手性純s-乙偶姻的生產(chǎn)方法，具體說(shuō)是將丁二酮還原酶基因 dar 和葡萄糖脫氫酶基因 gdh在大腸桿菌中表達(dá)，并以此重組大腸桿菌休止細(xì)胞為生物催化 齊IJ，以丁二酮和葡萄糖為底物高效生產(chǎn)手性純S-乙偶姻的方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 乙偶姻（acetoin)具有明顯的奶酪香、脂香特征，天然地存在于玉米、葡萄、蘋(píng)果、 草莓、黃油、干酪、酒類(lèi)、可可等各類(lèi)食品中，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-86規(guī)定其為允許添加食用 的食品香料。乙偶姻主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生產(chǎn)。此外，乙偶姻是一種 重要的化學(xué)合成中間體，2004年美國(guó)能源部將乙偶姻列為30種優(yōu)先開(kāi)發(fā)利用的平臺(tái)化合 物之一，可廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工等領(lǐng)域。乙偶姻有兩種旋光異構(gòu)體（S-乙偶姻和 R-乙偶姻），除了上述應(yīng)用之外，具有立體結(jié)構(gòu)專(zhuān)一性的手性乙偶姻還有特殊的用途，例如 合成手性液晶復(fù)合材料。在制藥工業(yè)中，手性乙偶姻可作為前體合成重要藥物中間體，如 4-氯-4, 5-二甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烷-2-酮（CDMD0)和4-溴甲基-5-甲基-1，3-二氧 戊環(huán)-2-酮。4-溴甲基-5-甲基-1，3-二氧戊環(huán)-2-酮是合成抗菌藥倫氨芐西林鹽酸的中 間體。CDMD0主要用于青霉素、氨芐青霉素等抗生素類(lèi)藥物的修飾，以合成具有光學(xué)活性的 手性藥物，較大程度地提高藥效，減輕藥物的副作用。
[0003] 手性乙偶姻的生產(chǎn)方法主要分為兩類(lèi)：化學(xué)合成法與生物合成法。化學(xué)法合成法 過(guò)程繁瑣，最后還需要進(jìn)行復(fù)雜的手性拆分，存在成本高、收率低、光學(xué)純度低、高能耗、高 污染的問(wèn)題，且原料來(lái)源于不可再生的化石資源--石油，原料來(lái)源受到限制。
[0004] 生物合成法是一種十分具有發(fā)展前景的環(huán)境友好合成方法，近年來(lái)受到了越來(lái)越 多的關(guān)注。然而，天然微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一般都是S-乙偶姻和R-乙偶姻的旋光異構(gòu)體混 合物，發(fā)酵產(chǎn)物手性拆分工藝繁瑣，成本高昂。因此，人們嘗試構(gòu)建重組大腸桿菌生物催化 劑來(lái)合成S-乙偶姻。休止細(xì)胞催化是指利用完整的休止細(xì)胞作為生物催化劑進(jìn)行生物 轉(zhuǎn)化，其本質(zhì)是利用細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行催化，綜合了發(fā)酵法和酶法催化這兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，克 服了發(fā)酵法存在的諸多缺點(diǎn)。研究者通過(guò)構(gòu)建重組大腸桿菌異源表達(dá)來(lái)自于枯草芽孢桿 菌（Bacillus subtilis)的（R，R) _2, 3_ 丁二醇脫氧酶和來(lái)自于短乳桿菌（Lactobacillus brevis)的NADH氧化酶，獲得能夠催化手性純meso-2, 3- 丁二醇成為S-乙偶姻的重組大 腸桿菌休止細(xì)胞生物催化劑，產(chǎn)物光學(xué)純度為96%【專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篊N200910013902. 8 ;PL〇S ONE, 2010, 5:e8860】。但是，上述的休止細(xì)胞催化反應(yīng)均需要使用工業(yè)難以制備的前體-- 手性純meso-2, 3- 丁二醇。丁二酮價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于手性純meso-2, 3- 丁二醇，若能利用其為 前體合成光學(xué)純S-乙偶姻，則能有效降低S-乙偶姻的生產(chǎn)成本，從而更具有商業(yè)化應(yīng)用前 旦 -5^ 〇
[0005] 研究者嘗試使用純酶催化還原丁二酮的方法制備手性純S-乙偶姻，他們通過(guò)構(gòu)建 重組大腸桿菌分別表達(dá)氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans)DSM2003的丁二酮還 原酶和B. subtilisl68的葡萄糖脫氫酶。這兩株重組大腸桿菌經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)目的產(chǎn)物后， 收集細(xì)胞進(jìn)行破碎，然后通過(guò)酶分離純化獲得條帶單一的丁二酮還原酶和葡萄糖脫氫酶。 利用純化的丁二酮還原酶偶聯(lián)純化的葡萄糖脫氫酶組成催化體系，在加入輔酶NADPH的條 件下，可催化丁二酮產(chǎn)生手性純S-乙偶姻【Bioresource Technol.，2013, 137:111-115】。 純酶催化的方法具有產(chǎn)物分離純化簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但需要破碎細(xì)胞和分離純化酶，而且需要 加入昂貴的輔酶NADPH，工藝繁瑣，成本較高。
[0006] 多粘類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)的丁二酮還原酶在NADH存在下可 以催化丁二酮還原為 S-乙偶姻【Appl. Environ. Microbiol.，2011，77:4230-4233】。兩株 P. polymyxa(ATCC12321和ZJ-9)的dar基因已被證明編碼丁二酮還原酶【4口口1』11￥；[1'〇11· Microbiol.，2011，77:4230-4233 ;Lett.Appl. Microbiol.，2013, 57:274-281】，但目前尚未 有P. polymyxa DSM365菌株dar基因的相關(guān)信息報(bào)道。2013年，Gao等在大腸桿菌中表達(dá) P. polymyxa ZJ-9的丁二酮還原酶，可獲得能夠催化丁二酮產(chǎn)生手性純S-乙偶姻的重組大 腸桿菌休止細(xì)胞生物催化劑【Acta Biotechnol，2002, 22:355-362】，但該研究沒(méi)有偶聯(lián)葡 萄糖脫氫酶催化輔酶NADH再生。
[0007] 經(jīng)廣泛的文獻(xiàn)和專(zhuān)利檢索，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)源于枯草芽孢桿菌168的葡萄 糖脫氧酶基因 gdh，作為輔酶在文獻(xiàn)Engineering of cofactor regeneration enhances (2S，3S)-2, 3-butanediol production from diacetyl·中已被報(bào)道[SCIENTIFIC REPORTS. ,2013,3:1-6]。但迄今為止尚未有關(guān)于P. polymyxa DSM365菌株丁二酮還原酶基 因（dar)的報(bào)道；而將該基因與葡萄糖脫氫酶基因（gdh)在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，并以此 重組菌株制備休止細(xì)胞生物催化劑實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)丁二酮還原和輔酶NADH再生的S-乙偶姻生產(chǎn) 方法，國(guó)內(nèi)外亦無(wú)公開(kāi)文獻(xiàn)專(zhuān)利報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，它能夠克服現(xiàn)有方法存 在工藝繁瑣、產(chǎn)量低、光學(xué)純度低、成本高的缺陷。
[0009] 本發(fā)明是利用丁二酮還原酶可以立體專(zhuān)一的催化丁二酮生成手性純S-乙偶姻， 以及葡萄糖脫氫酶能夠?qū)崿F(xiàn)胞內(nèi)輔酶NADH再生的性質(zhì)，將丁二酮還原酶基因（dar)和葡萄 糖脫氫酶基因（gdh)導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，以此重組大腸桿菌休止細(xì)胞為生物催化 劑轉(zhuǎn)化丁二酮，實(shí)現(xiàn)手性純S-乙偶姻的高效低成本合成。
[0010] 本發(fā)明所述生產(chǎn)手性純S-乙偶姻的方法，是將丁二酮還原酶基因（dar)和葡萄 糖脫氫酶基因（gdh)導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，以此重組大腸桿菌休止細(xì)胞為生物催化 齊IJ，以丁二酮為前體，葡萄糖為輔酶再生原料，實(shí)現(xiàn)手性純S-乙偶姻的高效低成本合成。
[0011] 其中：所述丁二酮還原酶基因可來(lái)源于多粘類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca)、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens)、解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)和地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis) 〇
[0012] 進(jìn)一步的，所述丁二酮還原酶基因來(lái)源菌株優(yōu)選是Paenibacillus polymyxa DSM365。該菌株可購(gòu)于德國(guó)微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，菌株編號(hào)是 DSM365。
[0013] 上述的重組大腸桿菌是采用常規(guī)的方法先克隆丁二酮還原酶基因（dar)和葡萄 糖脫氫酶基因（gdh)，再構(gòu)建pETDuet-dar-gdh重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（優(yōu)選大腸桿菌 BL21)中，然后經(jīng)篩選獲得；其含有dar和gdh基因，為革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生 長(zhǎng)，較佳培養(yǎng)溫度為37°C，其休止細(xì)胞可用于催化丁二酮生產(chǎn)手性純S-乙偶姻。
[0014] 其中，上述重組大腸桿菌所含的Paenibacillus polymyxa DSM365的丁二酮還原 酶基因（dar)序列長(zhǎng)度為720個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所含的Bacillus subtilisl68的葡萄糖脫氫酶基因（gdh)序列長(zhǎng)度為786個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 本發(fā)明所述生產(chǎn)手性純S-乙偶姻的方法中，以重組大腸桿菌/pETDuet-dar-gdh 休止細(xì)胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)手性純S-乙偶姻的具體方法是：
[0016] (1)平板培養(yǎng)：將重組大腸桿菌劃線到含有質(zhì)量體積比為1. 5?1. 8%瓊脂的并含 有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)；
[0017] (2)種子培養(yǎng)：在無(wú)菌的條件下，用牙簽挑取步驟（1)平板上的一個(gè)單菌落，然后 接種到10?100mL的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25?40°C搖床過(guò)夜 培養(yǎng)；
[0018] (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，取步驟（2)所得的菌液以體積比為1?10%的接 種量接種到〇. 5?10L的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2?10 小時(shí)，然后再加入終濃度為〇. 1?3mM的IPTG，10?37°C誘導(dǎo)2?20小時(shí)，停止培養(yǎng)；
[0019] 其中，上述步驟（1)?⑶中所述的LB培養(yǎng)基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母 粉，10g/LNaCl，121°C條件下滅菌15分鐘；
[0020] (5)收集菌體：將步驟（3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物5, 000?8, OOOrpm離心5?15分 鐘；并用生理鹽水洗滌菌體2?3遍，然后將細(xì)胞懸浮于pH6?8的緩沖液中，使細(xì)胞干重的 終濃度為2?20g/L，即得到重組大腸桿菌休止細(xì)胞生物催化劑，置于4°C的冰箱中待用；
[0021] 轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備手性純S-乙偶姻：以細(xì)胞干重濃度為2?20g/L的生物催化劑，在 10?42°C、pH5?9條件下，50?200rpm搖床震蕩對(duì)底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化初始濃度為5? 25g/L的丁二酮，并加入10?100g/L的葡萄糖以補(bǔ)充反應(yīng)所需輔酶因子的消耗；每隔3小 時(shí)取樣，樣品以8, 000?12000rpm離心5?15分鐘，去除所加入的全細(xì)胞生物催化劑；利 用氣相色譜方法檢測(cè)上清中丁二酮的濃度，間隔補(bǔ)加丁二酮，使反應(yīng)體系中的丁二酮濃度 維持在5?25g/L之間；利用SBA生物傳感分析儀檢測(cè)葡萄糖濃度，使反應(yīng)體系中的葡萄糖 濃度維持在5?50g/L之間。對(duì)上清進(jìn)行氣相色譜分析測(cè)定轉(zhuǎn)化液中乙偶姻的濃度及光學(xué) 純度，S-乙偶姻光學(xué)純度的計(jì)算方法：ee= ([S] - [R]V([S] + [R])X100% ;當(dāng)S-乙偶姻 的濃度不再增加時(shí)，停止轉(zhuǎn)化。
[0022] 上述生產(chǎn)手性純S-乙偶姻的方法中：
[0023] 步驟（3)所述誘導(dǎo)溫度優(yōu)選10?30°C ;誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)選10?20小時(shí)。
[0024] 步驟（5)所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)優(yōu)選細(xì)胞干重濃度為5?20g/L，在20?37°C，pH6?9條 件下對(duì)丁二酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0025] 步驟（5)所述初始丁二酮濃度優(yōu)選10?20g/L，初始葡萄糖濃度優(yōu)選20?50g/ L〇
[0026] 步驟（5)所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中補(bǔ)加丁二酮和葡萄糖，丁二酮濃度優(yōu)選維持在10? 20g/L，葡萄糖濃度優(yōu)選維持在10?50g/L。
[0027] 本發(fā)明首次成功實(shí)現(xiàn)了將丁二酮還原酶基因（dar)和葡萄糖脫氫酶基因（gdh)在 大腸桿菌中表達(dá)，并以此重組大腸桿菌休止細(xì)胞作為生物催化劑，以丁二酮為前體，葡萄糖 為輔酶再生原料，高效生產(chǎn)手性純S-乙偶姻。
[0028] 本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：
[0029] (1)首次構(gòu)建并應(yīng)用了可以共表達(dá)丁二酮還原酶和葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿 菌，其休止細(xì)胞可作為生物催化劑用于轉(zhuǎn)化丁二酮高效生產(chǎn)手性純S-乙偶姻。
[0030] (2) 丁二酮還原酶催化丁二酮生成手性純S-乙偶姻；葡萄糖脫氫酶能夠?qū)崿F(xiàn)胞內(nèi) 輔酶的再生，提供丁二酮還原酶所需的NADH。
[0031] (3)菌株要求的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單、成本低。
[0032] (4)直接用完整的重組大腸桿菌休止細(xì)胞作為生物催化劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化，不需要破碎 細(xì)胞和分離純化酶，操作過(guò)程簡(jiǎn)單。
[0033] (5)本發(fā)明的反應(yīng)體系中僅存在單一構(gòu)型的S-乙偶姻，因此不需要復(fù)雜的手性拆 分步驟。
[0034] (6)本發(fā)明的生物催化劑可以用過(guò)濾法或離心法去除，后續(xù)精餾分離提取費(fèi)用低 廉。 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1大腸桿菌的蛋白電泳圖。M:Maker ;1 :大腸桿菌BL21 ;2 :大腸桿菌BL21/ pETDuet-1 ;3 :大腸桿菌 BL21/pETDuet_dar ;4 :大腸桿菌 BL21/pETDuet_dar-gdh ;5 :純化 的丁二酮還原酶。 【具體實(shí)施方式】
[0036] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所述的內(nèi)容僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā) 明。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 重組大腸桿菌BL21/pETDuet-dar_gdh的構(gòu)建
[0039] 用常規(guī)的方法制備菌株P(guān)aenibacillus polymyxa DSM365的基因組DNA，對(duì)該菌株 的基因組進(jìn)行全序列測(cè)序和代謝網(wǎng)絡(luò)解析，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行注釋和功能鑒定，獲得了該 菌株的丁二酮還原酶基因的編碼序列；使用合成的引物P1和P2,以P. polymyxa DSM365的 基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到丁二酮還原酶基因（dar)。Bacillus subtilisl68菌株 的基因組序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上獲得，使用合成的引物P3和P4，以B. subti 1 is 168的基因組 DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到葡萄糖脫氫酶基因（gdh)。
[0040] 所述的PI、P2、P3和P4序列分別為：
[0041] P1 :5, -CTCATGCCATGGAACTTAAGAATAAAACAGCT-3,；
[0042] P2 :5, -GTCGCGAGCTCTTACTGTGGGTTGGTTGTCC-3，。
[0043] P3 :5' -CGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGG-3' ；
[0044] P4 :5' -GATCCAGACGTCTTAACCGCGGCCTGC-3'。
[0045] 上述dar基因序列長(zhǎng)度為720個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述；gdh基 因序列長(zhǎng)度為786個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
[0046] 將PCR擴(kuò)增得到的兩個(gè)PCR產(chǎn)物分別雙酶切并連接到pETDuet-1質(zhì)粒，得到重組 質(zhì)粒pETDuet-dar-gdh ;將上述重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主大腸桿菌BL21，得到重組大腸 桿菌BL21/pETDuet-dar-gdh。該菌株在含100μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)3小時(shí)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG，16°C誘導(dǎo)10小時(shí)，得到表達(dá)有丁二酮還原酶和葡 萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)12. 5 %的SDS-PAGE驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。
[0047] 上述重組大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生長(zhǎng)，可以用于催化丁二酮 生產(chǎn)手性純S-乙偶姻。
[0048] 實(shí)施例2
[0049] 重組大腸桿菌休止細(xì)胞生物催化劑的制備，包括如下步驟：
[0050] (1)平板培養(yǎng)：將重組大腸桿菌BL21/pETDuet-dar-gdh劃線到含有質(zhì)量體積比為 1. 8%瓊脂的并含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)；
[0051] (2)種子培養(yǎng)：在無(wú)菌的條件下，用牙簽挑取步驟（1)平板上的一個(gè)單菌落，然后 接種到20mL的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)；
[0052] (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，取步驟（2)所得的菌液接種到2L含有100 μ g/mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3小時(shí)，然后再加入終濃度為0. 5mM的IPTG，16°C 誘導(dǎo)10小時(shí)，停止培養(yǎng)；
[0053] 其中，上述步驟（1)?⑶中所述的LB培養(yǎng)基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母 粉，10g/LNaCl，121°C條件下滅菌15分鐘；
[0054] (4)收集菌體：將步驟（3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物8, OOOrpm離心5分鐘；并用生理鹽 水洗滌菌體2遍，然后將細(xì)胞懸浮于pH7的緩沖液中，使細(xì)胞干重的終濃度為15g/L，即得到 重組大腸桿菌休止細(xì)胞生物催化劑，置于4°C的冰箱中待用。
[0055] 實(shí)施例3
[0056] 利用重組大腸桿菌休止細(xì)胞作為生物催化劑制備手性純S-乙偶姻
[0057] 選擇上述獲得的重組大腸桿菌休止細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行如下轉(zhuǎn)化過(guò)程：在30°C、 pH7條件下，180rpm搖床震蕩，轉(zhuǎn)化初始濃度為20g/L的丁二酮，并加入20g/L的葡萄糖以 補(bǔ)充反應(yīng)所需輔因子的消耗；每隔3小時(shí)取樣，樣品以8, OOOrpm離心10分鐘，去除所加 入的全細(xì)胞生物催化劑，利用氣相色譜方法檢測(cè)上清中丁二酮的濃度，間隔補(bǔ)加丁二酮，使 丁二酮濃度維持在10?20g/L之間；對(duì)上清進(jìn)行氣相色譜分析測(cè)定轉(zhuǎn)化液中S-乙偶姻 的濃度及光學(xué)純度；16小時(shí)后檢測(cè)結(jié)果顯示：S-乙偶姻的濃度為28g/L，其光學(xué)純度大于 99. 7%。
[0001]
【權(quán)利要求】
1. 丁二酮還原酶基因 dar，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟：將所述丁二酮還原 酶基因 dar以及葡萄糖脫氫酶基因 gdh在大腸桿菌中表達(dá)，并以此重組大腸桿菌休止細(xì)胞 為生物催化劑，以丁二酮為前體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)手性純S-乙偶姻。
3. 如權(quán)利要求2所述的手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述以重組大腸桿 菌休止細(xì)胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)手性純S-乙偶姻的方法，包含如下步 驟： (1) 平板培養(yǎng)：將重組大腸桿菌劃線到含有質(zhì)量體積比為1. 5?1. 8%瓊脂的并含有 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)； (2) 種子培養(yǎng)：在無(wú)菌的條件下，用牙簽挑取步驟（1)平板上的一個(gè)單菌落，然后接種 到10?100mL的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25?40°C過(guò)夜培養(yǎng)； (3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，取步驟（2)所得的菌液以體積比為1?10%的接種量 接種到0. 5?10L的含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25?40°C培養(yǎng)2? 10小時(shí)，然后再加入終濃度為〇. 1?3mM的IPTG，10?37°C誘導(dǎo)5?24小時(shí)，得到一種培 養(yǎng)物； 其中，上述步驟（1)?（3)中所述的LB培養(yǎng)基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/ LNaCl，121°C條件下滅菌15分鐘； (4) 收集菌體：將步驟（3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物5, 000?8, OOOrpm離心5?15分鐘；并 用生理鹽水洗滌菌體2?3遍，然后將細(xì)胞懸浮于pH6?8的緩沖液中，使細(xì)胞干重的終濃 度為2?20g/L，即得到重組大腸桿菌休止細(xì)胞生物催化劑，置于4°C的冰箱中待用； (5) 轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備手性純S-乙偶姻：以細(xì)胞干重濃度為2?20g/L的生物催化劑，在 10?42°C、pH5?9條件下，50?200rpm搖床條件下對(duì)底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化初始濃度為5? 25g/L的丁二酮，并加入10?100g/L的葡萄糖以補(bǔ)充反應(yīng)所需輔酶因子的消耗；間隔補(bǔ)加 丁二酮和葡萄糖，使反應(yīng)體系中的丁二酮濃度維持在5?25g/L之間；葡萄糖濃度維持在 5?50g/L之間，當(dāng)S-乙偶姻的濃度不再增加時(shí)，停止轉(zhuǎn)化。
4. 如權(quán)利要求3所述的手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（3)所述誘導(dǎo) 溫度優(yōu)選10?30°C ;誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)選10?20小時(shí)。
5. 如權(quán)利要求3所述的手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（5)所述轉(zhuǎn)化 反應(yīng)優(yōu)選細(xì)胞干重濃度為5?20g/L，在20?37°C，pH6?9條件下對(duì)丁二酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
6. 如權(quán)利要求3所述的手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（5)所述初始 丁二酮濃度優(yōu)選10?20g/L，初始葡萄糖濃度優(yōu)選20?50g/L。
7. 如權(quán)利要求3所述的手性純S-乙偶姻的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（5)所述轉(zhuǎn)化 反應(yīng)過(guò)程中補(bǔ)加丁二酮和葡萄糖，丁二酮濃度優(yōu)選維持在10?20g/L，葡萄糖濃度優(yōu)選維 持在10?50g/L。
8. 丁二酮還原酶基因 dar在手性純S-乙偶姻生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104087601SQ201410341755
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】謝能中, 黃日波, 李檢秀, 黃艷燕, 郭鈴, 杜奇石, 陳東, 李億 申請(qǐng)人:廣西科學(xué)院