一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑的制作方法
【專利摘要】一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，涉及一種乳酸菌復(fù)合菌劑。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的發(fā)酵工藝無(wú)法兼顧發(fā)酵時(shí)間短和風(fēng)味、品質(zhì)佳的問(wèn)題。該乳酸菌復(fù)合菌劑的活性成分包括Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri和Lactobacillus oligofermentans。所述菌劑具有高度的協(xié)同作用，自體形成穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，不僅可以使蔬菜迅速進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài)，且能在發(fā)酵體系中快速繁殖產(chǎn)乳酸、乙酸、乙醇等風(fēng)味物質(zhì)，使人工發(fā)酵蔬菜接近自然發(fā)酵風(fēng)味，且操作簡(jiǎn)易、成本低廉。用于發(fā)酵白菜、圓白菜、蘿卜、黃瓜等蔬菜。
【專利說(shuō)明】一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種乳酸菌復(fù)合菌劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜是我國(guó)蔬菜加工產(chǎn)品中產(chǎn)量最多的一種，是利用天然存在的乳酸菌 等微生物進(jìn)行發(fā)酵制作而成的。大約3000年前，我國(guó)就有了發(fā)酵蔬菜的制作工藝，如四川 泡菜、榨菜、揚(yáng)州醬菜等。隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展以及消費(fèi)者對(duì)食品安全和健康要求的不 斷提高，迫切需要生產(chǎn)低鹽、低亞硝酸鹽含量的發(fā)酵蔬菜，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)加工的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；?人工發(fā)酵蔬菜完全可以滿足人們的這些要求。
[0003] 目前美國(guó)、日本、韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)酵蔬菜加工多采用人工發(fā)酵，并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?生產(chǎn)，而我國(guó)大部分的產(chǎn)品還是自然發(fā)酵，由于發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系復(fù)雜多變，導(dǎo)致發(fā)酵 進(jìn)程難以控制，產(chǎn)品質(zhì)量波動(dòng)不定，嚴(yán)重制約蔬菜發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展。
[0004] 東北酸菜是傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜食品，以白菜為主要發(fā)酵原料，其味道咸酸，口感脆嫩， 開(kāi)胃提神，醒酒去膩，不但能增進(jìn)食欲、幫助消化，還可以促進(jìn)人體對(duì)鐵元素的吸收。過(guò)去， 在我國(guó)東北和華北等地，由于冬季時(shí)間長(zhǎng)，鮮菜不宜貯藏，為了將白菜長(zhǎng)期保存起來(lái)，人們 發(fā)明了腌制酸菜的方法。隨著酸菜知名度的提高以及現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，對(duì)其需求量越 來(lái)越大，質(zhì)量要求也越來(lái)越高，傳統(tǒng)自然發(fā)酵的方法已經(jīng)滿足不了人們的需求，需求的不斷 擴(kuò)大加速了酸菜生產(chǎn)的規(guī)?；?。
[0005] 然而，至今為止，整個(gè)東北酸菜的加工企業(yè)依然多采用傳統(tǒng)的發(fā)酵池進(jìn)行自然發(fā) 酵，存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)品品質(zhì)差、質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題。人工接種發(fā)酵工藝具有發(fā)酵時(shí)間短、 受季節(jié)影響小、品質(zhì)易于控制的特點(diǎn)，但是其風(fēng)味上不及自然發(fā)酵的酸菜自然、醇厚。因此， 采用人工可控的方式進(jìn)行發(fā)酵，使其風(fēng)味逐步接近自然發(fā)酵是東北酸菜規(guī)模化生產(chǎn)需要不 斷努力的目標(biāo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的發(fā)酵工藝無(wú)法兼顧發(fā)酵時(shí)間短和風(fēng)味、品質(zhì)佳的問(wèn)題，提 供一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑。
[0007] 本發(fā)明用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑的活性成分包括Lactobacillus sunkii、 Lactobacillus curvatus、 Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus o1i gofermentans 〇
[0008] 所述乳酸菌復(fù)合菌劑中 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、 Lactobacillusparabnchneri 矛口 Lactobacillus oligofermentans 的集落形成單位數(shù)目比 為（1 ?3) : (4 ?6) : (4 ?6) : (1 ?3)。
[0009] 所述 Lactobacillus sunkii 具體可為 Lactobacillus sunkii DSM19904 ; 所述 Lactobacillus curvatus 具體可為 Lactobacillus curvatus DSM20019 ;所述 Lactobacillus parabuchneri 具體可為 Lactobacillus parabuchneri DSM20173 ;所述 Lactobacillus oligofermentans 具體可為 Lactobacillus oligofermentans DSM15707。
[0010]所述乳酸菌復(fù)合菌劑中，Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、 Lactobacillus parabuchneri>Lactobacillus oligofermentans 可分別獨(dú)立包裝，也可混 合在一起。
[0011] 本發(fā)明的乳酸菌復(fù)合菌劑可以為液體制劑，包括活性成分、甘油和EDTA，所述活性 成分、甘油和EDTA的配比為（1?L 2) X 10nCFU : (1?5) g甘油：lgEDTA。
[0012] 本發(fā)明的乳酸菌復(fù)合菌劑可以為固體制劑，菌劑的生產(chǎn)采用凍干法，即將培養(yǎng)好 的菌液離心，轉(zhuǎn)速5800g離心10min，棄上清，將凍干保護(hù)劑加入，加入比例按菌液與保護(hù)劑 的體積比為5 : 1，于-20°C冷凍10h，之后在壓力為3?5Pa、溫度為-50°C條件下冷凍干燥 24h得凍干的菌粉。
[0013] 本發(fā)明所述菌劑可以發(fā)酵白菜為酸菜。
[0014] 本發(fā)明所述菌劑優(yōu)先但不僅限于發(fā)酵白菜，其發(fā)酵對(duì)象還包括圓白菜、蘿卜、黃瓜 等蔬菜。所述菌劑具有高度的協(xié)同作用，自體形成穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，不僅可以使蔬菜迅速進(jìn) 入發(fā)酵狀態(tài)，且能在發(fā)酵體系中快速繁殖產(chǎn)乳酸、乙酸、乙醇等風(fēng)味物質(zhì)，使人工發(fā)酵蔬菜 接近自然發(fā)酵風(fēng)味，且操作簡(jiǎn)易、成本低廉。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。

【具體實(shí)施方式】 [0016] 一：本實(shí)施方式用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑的活性成分包 括 Lactobacillus sunkii> Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans。

【具體實(shí)施方式】 [0017] 二：本實(shí)施方式與一不同的是：所述乳酸菌復(fù)合菌劑 中 Lactobacillus sunkii> Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans的集落形成單位數(shù)目比為（1?3) : (4?6) : (4? 6) : (1?3)。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0018] 三：本實(shí)施方式與二不同的是：所述乳酸菌復(fù)合菌 劑中 Lactobacillus sunkii> Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri 和Lactobacillus oligofermentans的集落形成單位數(shù)目比為1 : 4 : 4 : 1或 1 : 2 : 2 : 1。其它與二相同。

【具體實(shí)施方式】 [0019] 四：本實(shí)施方式與一至三之一不同的是：所述 Lactobacillus sunkii 為 Lactobacillus sunkii DSM19904 ；所述 Lactobacillus curvatus 為 Lactobacillus curvatus DSM20019 ；所述 Lactobacillus parabuchneri 為 Lactobacillus parabuchneri DSM20173 ;所述 Lactobacillus oligofermentans 為 Lactobacillus oligofermentans DSM15707。其它與一至三之一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0020] 五：本實(shí)施方式與一至四之一不同的是：所述乳 酸菌復(fù)合菌劑包括活性成分、甘油和EDTA，所述活性成分、甘油和EDTA的配比為（1? 1.2)X10 nCFU : (1?5)g甘油：lgEDTA。其它與一至四之一相同。
[0021]

【具體實(shí)施方式】六：本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是：所 述乳酸菌復(fù)合菌劑包括活性成分和脫脂乳粉，所述活性成分和脫脂乳粉的配比為 (1-1.2)X108CFU : (1?6)g脫脂乳粉。其它與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0022] 七：本實(shí)施方式與一至六之一不同的是：所述乳酸菌 復(fù)合菌劑在發(fā)酵白菜、圓白菜、蘿卜或黃瓜中的用途。其它與一至六之一相 同。
[0023] 通過(guò)以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：
[0024] 實(shí)施例1、發(fā)酵菌劑中活性成分的篩選。
[0025] MRS液體培養(yǎng)基的組成：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖20g， K2HP042g，檸檬酸二銨 2g，無(wú)水乙酸鈉 5g，吐溫 80ml，MgS04 · 7Η200· 58g，MnS04 · 4Η200· 25g， ρΗ6· 2 ?64,蒸饋水 1000ml。
[0026] 取東北三個(gè)地區(qū)傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵液5ml分別接入到95ml MRS培養(yǎng)基中，于5°C冰箱 中厭氧培養(yǎng)l〇d。
[0027] 10d后，分別取上述三種培養(yǎng)液各5ml，或相互組合總體積為5ml的培養(yǎng)物接入 95ml新鮮的MRS培養(yǎng)基中，每4d轉(zhuǎn)接一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)。測(cè)定培養(yǎng)液的pH值、乳酸、乙酸 和乙醇的產(chǎn)量。選擇pH值下降迅速，產(chǎn)乳酸、乙酸、乙醇較多且對(duì)外界環(huán)境變化相對(duì)穩(wěn)定的 培養(yǎng)物，篩選其中的活性成分。
[0028] 通過(guò)變性梯度凝膠電泳（DGGE)和16S rDNA克隆文庫(kù)對(duì)上述獲得的培養(yǎng)物進(jìn)行 研究，結(jié)果表明，上述培養(yǎng)物中的組成菌主要為L(zhǎng)actobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus> Lactobacillus parabuchneri> Lactobacillus oligofermentans。
[0029] 實(shí)施例2、制備液體乳酸菌復(fù)合菌劑，用于白菜發(fā)酵。
[0030] 一、菌劑的制備
[0031] 菌株活化：將 Lactobacillus sunkii DSM19904、Lactobacillus curvatus DSM20019、 Lactobacillus parabuchneri DSM20173、 Lactobacillus oligofermentans DSM15707 分別接到 MRS 固體培養(yǎng)基上，Lactobacillus sunkii DSM19904、Lactobacillus curvatus DSM20019、Lactobacillus parabuchneri DSM20173 于 30 °C 培養(yǎng) 2d， Lactobacillus oligofermentans DSM15707 于 25°C培養(yǎng) 2d。
[0032] MRS固體培養(yǎng)基的組成：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖20g， K2HP042g，檸檬酸二銨 2g，無(wú)水乙酸鈉 5g，吐溫 80ml，MgS04 · 7Η200· 58g，MnS04 · 4Η200· 25g， 瓊脂 15g，ρΗ6· 2 ?6. 4,蒸饋水 1000ml。
[0033] Lactobacillus sunkii DSM19904、 Lactobacillus curvatus DSM20019、 Lactobacillus parabuchneri DSM20173、 Lactobacillus oligofermentans DSM15707 均 購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心。
[0034] 將已經(jīng)活化的菌株單菌落分別接種于50mlMRS液體培養(yǎng)基中，于相應(yīng)溫度下培養(yǎng) 24h。取 Lactobacillus sunkii DSM1990410ml、Lactobacillus curvatus DSM2001940ml、 Lactobacillus parabuchneri DSM2017340ml、 Lactobacillus oligofermentans DSM1570710ml，使四種菌的最終集落形成單位數(shù)目比為1 : 4 : 4 : 1，該混合培養(yǎng)液中的 集落形成單位數(shù)目為1X l〇8CFU/ml。
[0035] 將上述混合發(fā)酵液、甘油和EDTA按照l(shuí)X103ml : 5g : lg的配比混合，得到菌劑
[0036] 二、用于發(fā)酵白菜
[0037] 秋季白菜收獲后，晾曬2d進(jìn)行修整，清洗后層層碼入陶缸，陶缸容積為750L，加入 鹽，鹽與鮮菜重比為1 : 100,將l〇〇ml菌劑A與水混合，倒入缸內(nèi)，用腌菜石壓實(shí)，發(fā)酵平均 溫度為16°C，發(fā)酵時(shí)間為24d。
[0038] 在發(fā)酵的第6d，12d，18d，24d取樣，測(cè)定酸菜發(fā)酵體系中乳酸菌和揮發(fā)性產(chǎn)物。
[0039] 菌落計(jì)數(shù)（CFUs)采用平板稀釋法，乳酸菌培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2d計(jì) 數(shù)，所得值為三次重復(fù)平均值。
[0040] 采用HPLC測(cè)定酸菜中的揮發(fā)性產(chǎn)物，色譜柱為美國(guó)Bio-Rad公司Aminex87,色譜 分析有機(jī)酸條件為：5mM的硫酸作為流動(dòng)相，總程序進(jìn)行時(shí)間為30min，流速為0. 6mL/min， 柱溫40°C，進(jìn)樣量為10 μ L，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為205nm。重復(fù)測(cè)定三次。
[0041] 酸菜發(fā)酵18d全部腌透，質(zhì)地脆嫩，呈鮮黃色。
[0042] 表1菌劑A發(fā)酵白菜24d發(fā)酵體系內(nèi)乳酸菌及揮發(fā)性產(chǎn)物分析
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，其特征在于該乳酸菌復(fù)合菌劑的活性成分 包括 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，其特征在于所述 乳酸菌復(fù)合菌劑中 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans 的集落形成單位數(shù)目比為（1 ? 3) : (4 ?6) : (4 ?6) : (1 ?3)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，其特征在于所述 乳酸菌復(fù)合菌劑中 Lactobacillus sunkii、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus parabuchneri 和 Lactobacillus oligofermentans 的集落形成單位數(shù)目比為1 : 4 : 4 : 1 或 1 : 2 : 2 : 1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，其特征在于 所述 Lactobacillus sunkii 為 Lactobacillus sunkii DSM19904 ;所述 Lactobacillus curvatus 為 Lactobacillus curvatus DSM20019 ；所述 Lactobacillus parabuchneri 為 Lactobacillus parabuchneri DSM20173 ;所述 Lactobacillus oligofermentans 為 Lactobacillus oligofermentans DSM15707。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，其特征在于所述 乳酸菌復(fù)合菌劑包括活性成分、甘油和EDTA，所述活性成分、甘油和EDTA的配比為（1? 1.2)X10 nCFU : (1 ?5)g 甘油：lgEDTA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，其特征在于所述 乳酸菌復(fù)合菌劑包括活性成分和脫脂乳粉，所述活性成分和脫脂乳粉的配比為（1? 1. 2) X 108CFU : (1 ?6) g 脫脂乳粉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一所述的一種用于酸菜發(fā)酵的乳酸菌復(fù)合菌劑，其特征在 于所述乳酸菌復(fù)合菌劑在發(fā)酵白菜、圓白菜、蘿卜或黃瓜中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104232506SQ201410341787
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】楊洪巖, 吳昊 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 楊洪巖