基于dna條形碼的鑒別烏梢蛇的引物及pcr-rflp方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于中藥品種鑒定【技術領域】，提出一種鑒別烏梢蛇及其偽品的聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR-RFLP)。本發明提出的PCR擴增所用引物序列為：DK1-CO1：5’-CAA?CTA?ACC?ACA?AAG?ACA?TCG?G-3’，DK1-CO2：5’-CTT?CTG?GGT?GGC?CGA?AAAATC?A-3’；烏梢蛇的特征DNA堿基序列為：5’-ACTAGT-3’(位于COI序列第121位至126位)及5’-GGAAACC-3’(位于COI序列第353位至359位)；限制性內切酶Spe?I可識別并切割特征序列5’-ACTAGT-3’，而限制性內切酶BstE?II不能識別特征序列5’-GGAAACC-3’，兩種限制性內切酶僅將烏梢蛇雙酶切成兩條片段。本發明鑒定過程為：提取樣本DNA；用引物DK1-CO1、DK1-CO2進行PCR擴增；純化PCR產物；用限制性內切酶Spe?I和BstE?II消化PCR產物；瓊脂糖凝膠電泳分析結果；通過與烏梢蛇的PCR-RFLP特征結果相比較，即可判斷供試品是否為烏梢蛇。本發明還提供用于鑒別方法的試劑盒。本發明方法準確、快速、可靠，可廣泛用于中藥材鑒定。
【專利說明】基于DNA條形碼的鑒別烏梢蛇的引物及PCR-RFLP方法和試劑盒

【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥的品種鑒定【技術領域】，具體涉及一種鑒別烏梢蛇的引物及PCR-RFLP鑒定方法和試劑盒。

【背景技術】
[0002]烏梢蛇(Zaocys dhumnades)來源于游蛇科動物的干燥體,具有祛風、通絡、止疫之功效，用于風濕頑痹、麻木拘攣、半身不遂、抽搐痙攣等。目前商品流通中烏梢蛇藥材的混淆品種越來越多，而且游蛇科的常見種類都有可能被當做烏梢蛇，難以根據形態學上的特征進行單一鑒別，使得品種的鑒定越來越困難。因此尋找快速、準確的方法鑒別烏梢蛇是保證烏梢蛇用藥安全的重要任務。


【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種準確鑒別烏梢蛇的PCR-RFLP分子鑒定方法，包括烏梢蛇的特征DNA堿基序列、一對PCR引物、限制性內切酶酶切位點、鑒定方法及其試劑盒。
[0004]本發明基于DNA條形碼。DNA條形碼(DNA barcoding)是利用一個或少數幾個DNA片段對物種進行識別和鑒定的一項新技術。2003年Herbert等選取線粒體細胞色素C氧化酶亞基I的一段序列在動物界不同分類水平上(門、目、種)進行分析，發現無論在哪個分類水平上該基因都具有良好的識別能力，從而提出建立以一段長度為650bp的COI基因序列為基礎的條形碼識別方法。隨后的研究表明，COI (線粒體細胞色素氧化酶亞基I)基因序列種內變異小，種間變異大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，對動物物種的識別和鑒定切實可行，被公認為動物界中標準的DNA條形碼基因。
[0005]本發明的技術方案如下:首先從各樣本中提取總DNA，利用引物DKl-COl及DK1-C02,用PCR方法擴增COI片段，經純化后，對該片段進行DNA序列測定，將所得序列登錄到Genbank系統獲得登錄號，并建立各樣品的DNA序列數據庫；在比較數據庫DNA序列的基礎上，得到烏梢蛇的特征DNA堿基序列:5’ -ACTAGT-3’ (位于COI序列第121位至126位)，該序列可被限制性內切酶Spe I識別并切割；然而該特征DNA序列并非烏梢蛇所特有，在金錢白花蛇原動物銀環蛇的COI序列中也存在該特征序列，為了有效區分烏梢蛇與銀環蛇，本發明人加選了烏梢蛇的另一特征DNA序列5’ -GGAAACC-3’ (位于COI序列第353位至359位)，在銀環蛇的相同位點出現的是5’ -GGTAACC-3’，僅有銀環蛇的特征序列可被限制性內切酶BstE II識別并切割；序列5’ -ACTAGT-3’與序列5’ -GGAAACC-3’共同組成烏梢蛇的特征DNA序列，利用能夠識別烏梢蛇特征DNA堿基序列(5’-ACTAGT-3’)的限制性內切酶Spe I，與不能識別烏梢蛇特征DNA堿基序列(5’-GGAAACC-3’)的限制性內切酶BstEII，共同對純化后的PCR產物進行消化，產生瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜，通過分析上述雙酶切圖譜差異，達到快速、準確鑒別烏梢蛇的目的。
[0006]對需要鑒定的烏梢蛇樣品，提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(DK1-C0UDK1-C02)擴增，供試品能夠擴增出一段DNA片段；用限制性內切酶Spe I及BstEII對供試品的PCR擴增產物進行雙酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，烏梢蛇會出現分子量為121bp和537bp的兩條DNA片段，而其它種類的蛇不出現上述兩條片段或多于上述兩條片段。當供試品經本法進行PCR擴增，并對PCR產物進行限制性內切酶雙酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小，便可準確鑒定供試品是否為烏梢蛇。
[0007]本發明用于鑒別烏梢蛇PCR-RFLP方法的PCR擴增引物，所述引物序列為:
[0008]DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
[0009]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
[0010]本發明用于鑒別烏梢蛇PCR-RFLP分子鑒定方法，利用能夠識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5’ -ACTAGT-3’的限制性內切酶Spe I，與不能識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5 ’ -GGAAACC-3 ’的限制性內切酶BstE 11，共同對純化后的PCR產物進行消化，產生瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜；具體步驟如下:
[0011]I)提取待測樣品DNA ；
[0012]2)擴增DNA片段，PCR反應參數包括:93°C預變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復性45s，70。。延伸45s, 35個循環;70°C延伸5min。所述引物DKl-COl和DK1-C02，其序列為:
[0013]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]3)純化PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0016]4)純化產物中加入限制性內切酶Spe I和BstE II進行雙酶切，限制性內切酶SpeI酶切位點為:A~CTAGT ;限制性內切酶BstE II的酶切位點為:G~GTNACC ；
[0017]5)瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0018]6)鑒定結果的判斷，若在所述電泳產物中檢測到分子量為121bp和537bp的兩條片段，則待測樣品為烏梢蛇；若不出現上述兩條片段或多于兩條片段，則供試品不為烏梢蛇。
[0019]本發明方法中，步驟I)和3)中，采用現有技術的試劑盒提取DNA及純化PCR產物的方法，不需要配制任何試劑，使得操作時間大大縮短。
[0020]本發明還提出了一種用于烏梢蛇PCR-RFLP鑒定方法的試劑盒。所述試劑盒包括:引物DKl-COl(1yM);引物DK1-C02 (10 μ M) ；2XTaq DNA聚合酶混合緩沖液，其包括:TaqDNA聚合酶(0.1U/ μ L)，四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500 μ Μ)，Tris-HCl (20 μ Μ、ρΗ8.3)，KCl (100 μ Μ)，MgCl2 (3 μ Μ)等；Spe I 酶(1U/ μ L) ；BstE II 酶(?ου/μ L);酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
[0021]綜上所述，本發明解決了鑒定烏梢蛇與其它品種蛇的難題，提供了鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應條件、烏梢蛇特征DNA堿基序列、兩種限制性內切酶、鑒定方法及其試劑盒，建立了快速、便捷、準確的PCR-RFLP鑒別方法，對于保證烏梢蛇的藥材質量，打擊烏梢蛇偽品的市場行為具有重要的價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為各樣本擴增COI條形碼序列PCR產物電泳結果:1.銀環蛇2.金環蛇3.眼鏡蛇4.赤鏈蛇5.灰鼠蛇6.黑背白環蛇7.玉斑錦蛇8.百花錦蛇9.赤鏈華游蛇10.滑鼠蛇11.烏梢蛇12.黃斑漁游蛇13.陰性對照(其它反應條件不變，以水替代模板DNA)；MK.DNA 分子量標準:從上到下依次為 1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
[0023]圖2各樣本PCR產物酶切結果:1.銀環蛇2.金環蛇3.眼鏡蛇4.赤鏈蛇5.灰鼠蛇6.黑背白環蛇7.玉斑錦蛇8.百花錦蛇9.赤鏈華游蛇10.滑鼠蛇11.烏梢蛇12.黃斑漁游蛇；MK.DNA分子量標準:從上到下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp0

【具體實施方式】
[0024]結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限于以下實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。
[0025]1、材料
[0026]12份蛇類原動物，主要采自廣東省、湖南省、廣西壯族自治區(表1)。全部樣本均由華南瀕危動物研究所張亮進行性狀鑒定。
[0027]表1 12份蛇類原動物樣本
[0028]

【權利要求】
1.用于鑒別烏梢蛇PCR-RFLP方法的PCR擴增引物，其特征在于，所述引物序列為:
DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一種烏梢蛇的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于，利用能夠識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5’ -ACTAGT-3’的限制性內切酶Spe I，與不能識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5 ’ -GGAAACC-3 ’的限制性內切酶BstE 11，共同對純化后的PCR產物進行消化，產生瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜；所述鑒定方法包括以下步驟: 1)樣品DNA的提取； 2)擴增DNA片段:利用權利要求1所述的引物進行聚合酶鏈反應，得到聚合酶鏈反應擴增產物，所述PCR反應參數包括:93°C預變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復性45s, 70°C延伸 45s, 35 個循環;70°C延伸 5min ； 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化PCR產物； 4)在所述PCR純化產物中加入限制性內切酶SpeI和BstE II進行雙酶切，所述限制性內切酶Spe I的酶切位點為A'CTAGT ;所述限制性內切酶BstE II的酶切位點為G'GTNACC ； 5)瓊脂糖凝膠電泳分析； 6)鑒定結果的判斷:若在所述電泳產物中檢測到分子量為121bp和537bp的兩條片段，則待測樣品為烏梢蛇；若不出現上述兩條片段或多于兩條片段，則供試品不為烏梢蛇。
3.一種用于烏梢蛇PCR-RFLP鑒定方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:10μΜ引物 DKl-COl ;10y]\^_DKl-C02 ；2XTaq DNA 聚合酶混合緩沖液，其包括:0.1U/μ L TaqDNA 聚合酶，dATP、dTTP、dCTP 及 dGTP 各 500yM，20yMTris-HCl、pH8.3,100 μ M KCl,3yMMgCl2 ;10υ/μ L Spe I酶；10U/yL BstE II酶；酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
【文檔編號】C12N15/11GK104164494SQ201410348910
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】晁志 申請人:晁志