一種大豆GmHKT蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大豆GmHKT蛋白及其編碼基因與應(yīng)用,屬于植物基因工程領(lǐng)域。該大豆GmHKT蛋白，是具有序列表中的SEQID№：2所述氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。該大豆GmHKT蛋白及其編碼基因可用于培育耐鹽植物種質(zhì)特別是耐鹽大豆新種質(zhì)。
【專利說(shuō)明】-種大豆GmHKT蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及與耐鹽性密切相關(guān)的HKT蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，屬于植物基因工 程領(lǐng)域。特別涉及來(lái)源于大豆的與耐鹽性相關(guān)的HKT蛋白GmHKT2及其編碼基因與其在培 育耐鹽植物種質(zhì)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于當(dāng)前土壤的過(guò)度使用，造成土壤有效成分不斷減少、鹽漬化程度嚴(yán)重。隨著干 旱與半干旱氣候的變化，土壤鹽漬化與次生鹽漬化現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，導(dǎo)致包括大豆在內(nèi)的 多種重要農(nóng)作物的減產(chǎn)與品質(zhì)下降。大豆[Glycine max(L.)merr]作為重要經(jīng)濟(jì)作物，在 栽培過(guò)程中受到土壤鹽漬化和次生鹽漬化的制約。因此，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)研究大豆離 子調(diào)控等耐鹽基因及其作用機(jī)理，將為培育耐鹽大豆新種質(zhì)提供扎實(shí)的基礎(chǔ)。
[0003] 鹽漬化土壤抑制大豆生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素是鹽脅迫導(dǎo)致K+吸收的匱乏和過(guò)量Na+的 離子特異性損害。因此，克隆與大豆K+吸收、Na+外排有關(guān)的基因，明確這類基因的分子作 用機(jī)理，將有助于利用基因工程技術(shù)提高大豆的耐鹽性。植物根部細(xì)胞與環(huán)境之間的物 質(zhì)交換通過(guò)位于細(xì)胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要包括各類離子泵、共轉(zhuǎn)運(yùn)體及 離子通道，由于共轉(zhuǎn)運(yùn)體可以在極端逆境條件下維持植物對(duì)關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)， 從而決定著處于逆境中的植物細(xì)胞的許多關(guān)鍵功能，高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（High affinity K+transporter，HKT)便是一種重要的由載體蛋白組成的高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。因此，發(fā)掘大豆 GmHKT新基因并研究其功能在理論和實(shí)踐上都具有重要的科學(xué)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問(wèn)題
[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型大豆GmHKT蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006] 技術(shù)方案
[0007] 本發(fā)明所提供的大豆GmHKT蛋白，名稱為GmHKT2,來(lái)源于大豆屬大豆[Glycine max(L.)]，是具有序列表中的SEQ ID Ns:2所述氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
[0008] 上述大豆GmHKT蛋白的編碼基因（GmHKT2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009] 上述大豆GmHKT蛋白GmHKT2的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
[0010] 1)序列表中SEQ ID Ns :1的DNA序列；
[0011] 2)編碼序列表中SEQ ID Ns :2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
[0012] 其中，序列表中的SEQ ID Ns :1由1440個(gè)脫氧核苷酸組成，本序列為GmHKT2基因 的讀碼框，編碼具有序列表中SEQ ID Ns :2的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
[0013] 含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 擴(kuò)增GmHKT2 -片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0015] 利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的GmHKT2的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)高鹽 脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
[0016] 使用GmHKT2構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng) 型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載 體進(jìn)彳丁加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因（GUS基因、GFP基因等）或抗生素 標(biāo)記物（抗除草劑標(biāo)記物、潮霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）。
[0017] 攜帶有本發(fā)明GmHKT2的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載 體、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化 的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植物，也可以是綠豆、番茄、花生、楊樹、草坪 草、苜宿等雙子葉植物。
[0018] 有益效果
[0019] GmHKT2的表達(dá)受高濃度NaCl的誘導(dǎo)，在150mM NaCl的脅迫下，GmHKT2在大豆的 根中受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)并高效表達(dá)，在莖中的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，而在葉中 的相對(duì)表達(dá)量較低。導(dǎo)入過(guò)量表達(dá)GmHKT2的煙草與未轉(zhuǎn)基因煙草相比，其在鹽脅迫下的耐 受能力明顯得到增強(qiáng)，說(shuō)明GmHKT2基因與植物的耐鹽性密切相關(guān)。鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株 與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾龋l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的根部積累較多鉀離子和較少鈉離子，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn) 基因植株的根部具有較低的Na +/K+比，而較低的Na+/K+比是植物在鹽脅迫下實(shí)現(xiàn)高耐鹽性 的關(guān)鍵所在。
[0020] 本發(fā)明的GmHKT2對(duì)培育耐鹽植物新種質(zhì)特別是耐鹽大豆新種質(zhì)具有重要意義。
[0021] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為GmHKT2在150mM NaCl脅迫下的表達(dá)特性圖
[0023] 圖2為含有GmHKT2的植物表達(dá)載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖
[0024] 圖3為轉(zhuǎn)GmHKT2煙草株系Line3與非轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的表型比較圖
[0025] 圖4為轉(zhuǎn)基因植株Line3、Linel2和非轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的根中的Na+和K+ 分析

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0027] 實(shí)施例1、大豆GmHKT2及其編碼基因的cDNA克隆與鑒定
[0028] 以大豆耐鹽品種 Lee68 (Chen et al.，Aus J Agric Res, 2008, 59:1086 - 1091)為 材料，通過(guò)生物信息學(xué)的方法，以已報(bào)道的GmHKTl蛋白序列為種子序列，BLAST大豆基因組 數(shù)據(jù)庫(kù)，在大豆第7號(hào)染色體上鑒定出一條高度同源的序列，命名為GmHKT2。GmHKT2基因 0RF全長(zhǎng)為1440bp，編碼479個(gè)氨基酸。
[0029] 根據(jù)GmHKT2基因序列設(shè)計(jì)引物：GmHKT2 0RF正向引 物：5 '-ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3，，GmHKT2 0RF 反向引物：5 '-TTAGGAGAGGTTCCAGGCTT-3，， 應(yīng)用RT-PCR方法從大豆總RNA中擴(kuò)增GmHKT2基因。取大豆耐鹽品種Lee68葉片，用QiaGen 試劑盒提取總RNA。取2 μ 1總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Τ0Υ0Β0公司）按試劑盒的方法進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。20 μ 1 PCR反應(yīng)體系為：1 μ 1 cDNA、各 Ιμ? 引物（1〇μΜ)、2μ1 10XPCR 緩沖液、0·5μ1 dNTP(lOmM)和 0.5UTaqDNA 聚合酶，用 滅菌水補(bǔ)足20 μ 1。PCR反應(yīng)在東勝龍EDC-810型PCR儀上進(jìn)行，其程序?yàn)?4°C變性4min ; 再 94°C lmin，55°C lmin，72°C 2min，共 30 個(gè)循環(huán)；然后 72°C延伸 lOmin ;4°C保存。PCR 產(chǎn) 物經(jīng)回收后序列分析，結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1的核苷酸序列。
[0030] 實(shí)施例2、GmHKT2基因在高鹽脅迫下的表達(dá)特征
[0031] 對(duì)大豆耐鹽品種Lee68進(jìn)行NaCl脅迫處理用于分析大豆GmHKT2在鹽脅迫 下的表達(dá)情況。為了進(jìn)行Real-timePCR分析GmHKT2在鹽脅迫下的表達(dá)規(guī)律，先將大 豆品種Lee68的種子萌發(fā)4天，然后轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中水培，待大豆 植株的第一簇復(fù)葉長(zhǎng)出后，使用含有150mM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行脅迫 處理，分別取鹽處理后0、6、12、24、36及48h等時(shí)期的根、莖及葉等樣品，經(jīng)液氮速凍 后-80°C保存?zhèn)溆谩？俁NA的提取同實(shí)施例一。以大豆組成型表達(dá)的β-tublin基 因 （Genbank Ν〇·ΝΜ_001252709·1)為內(nèi)參基因（5'-ATCACTTGATCTCCGCAACC-3，和 5' -CATCCCACATTTGCTGTGTC-3'）。以來(lái)自大豆不同組織及鹽誘導(dǎo)不同時(shí)間段的不同組織 的cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR分析。目的基因 Real-time PCR分析的引物序列是 5, -CTTGTCCTCCCACACATCCT-3' 和 5, -CCAAAGAGCAAAGCATCACA-3，， Real-time PCR 的儀 器是 Applied biosystems(USA)7500Fast，20y 1 反應(yīng)體系為：1 μ 1 模板、各 0· 5μ 1 引物 (10μΜ)、2μ1 10XPCR緩沖液、Ιμ? SYBR(20X)、2yl Mg2+(25mM)、0.5yl dNTP(25mM)和 0· 2 μ 1的Hatinu·* Taq DNA聚合酶（Invitrogen公司），用蒸饋7jC補(bǔ)足20 μ 1。反應(yīng)程序 是 95°C變性 2min，95°C 10s，60°C 30s, 70°C 30s，共 40 個(gè)循環(huán)，然后 70-95°C之間進(jìn)行 melt 反應(yīng)。結(jié)果表明（圖1)，在150mM NaCl脅迫下，GmHKT2在根中的表達(dá)受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，根中 的表達(dá)量在鹽處理后有一個(gè)明顯的上調(diào)并處于高水平表達(dá)，在莖中的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升 后下降的變化趨勢(shì)，而其在葉中的表達(dá)量處于一個(gè)相對(duì)較低的水平。
[0032] 實(shí)施例3、GmHKT2編碼蛋白的功能鑒定
[0033] 利用 Invitrogen 公司的 Gateway? Technology with Clonase?II 試劑盒，將 GmHKT2正向插入到表達(dá)載體pMDC83中（Invitrogen公司）（圖2)，得到2X35S-GmHKT2-Nos 植物過(guò)量表達(dá)載體，用凍融法將2X35S-GmHKT2-N〇s轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株（本實(shí) 驗(yàn)室保存）中。利用農(nóng)桿菌EHA105的介導(dǎo)將2X35S-GmHKT2-Nos導(dǎo)入煙草，檢測(cè)結(jié)果表 明獲得38株陽(yáng)性植株，結(jié)合Real-time PCR分析結(jié)果選擇了 2個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系（Line3、 Linel2)進(jìn)行功能驗(yàn)證，將Line3和Linel2的種子種入MS培養(yǎng)基，待非轉(zhuǎn)基因型煙草（CK) 以及T2代轉(zhuǎn)基因株系（Line3、Linel2)萌發(fā)生長(zhǎng)成小苗后（2周左右），將它們轉(zhuǎn)入含200mM NaCl的1/2MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽處理（2周左右），結(jié)果如圖3所示，表明在200mM的NaCL 脅迫下，非轉(zhuǎn)基因型煙草（CK)植株矮小，葉片萎黃，長(zhǎng)勢(shì)較差，而在同樣條件下的過(guò)量表達(dá) 該基因的轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)正常。在200mM的NaCl脅迫下，分析了非轉(zhuǎn)基因型煙草（CK)與 轉(zhuǎn)基因株系根中的鉀離子和鈉離子含量，結(jié)果如圖4所示，鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基 因?qū)φ障啾龋l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的根部積累相對(duì)較多的鉀離子和較少的鈉離子，進(jìn)而導(dǎo)致與 對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株的根部具有較低的Na+/K+比。
[0034] SEQ ID Ns : 1 的 DNA 序列：
[0035] a I gen I it la: nccii Ui：i i Ι? ttCHnei l ggl latt leg lg<iUu:U tc let ggl 60 tael! gggl c Icaaggtctc naagccaagg acccccgti<\ cttg<uicct c 120 11 Uncacci t：igU icIrc l i l：c<icIrI l 1 ctiigualgg i tgcccl i ga H<t t gg<igc 11 180 t ictccaail cccaactcHt let cct race ctlet caigi tlet eggegg ggaagiU tc 210 hc i teealge tegae clt ct alt I get tee tacaaat t cc naai-K-agm (' 300 ac-caH icana lagnacl igg l.l tag 11 let a lee cl gad caaaalcagci aaa \ lacccic 360 <uiHccgHgt-g alga! Hgl fiH laUnacgac gacagtgH la gacttiuigtn tanct gtet 1 420 ngi Uitclga ci l Ugtagi 11 taggttac ctagtgglgg ttcaalt tgl iggclt tagt 480 1Lcgiglci i iglaciilaac 111gglaccg aglgcaagac aagtacigaa aaMcaaaggc 540 h1 Utrigal Ig lancgi t Uc 11 tgt t lace a tagt itcca cgtU.gct.ag itglggt l tt 600 giccc caeca acgagfiaca t gai ggt i l tc aagaagaa 1.1. egggae i tel tct.cc t tgt c 660 clcccacaca t.ccUclagg taacacccl l latccaccat gti igagget tx1!gaUiatg 720 gttt tgaaaa aggt tacaaa aaaagaggaa tt ctcgtact t gct gaagaa 11tcaaagac 780 gtgggt tatg atcaratget ctctgctct t cat tgttgee tcctggt tgt tactgtcttg 840 ggtt tcaatc ttatacaatt tgtgatgett tgetet ttgg agtggaacac caaaatcatg 900 gaggglitga atgigtaiga gaaaglgglg gcglcit tat itcaaglaac aaaigegaga 960 cacgclggig aalclgl tit IgaIcIdea tccatclct l cagccatal l egtectct tc 1020 gt.tgt: tatga tgtacclccc accatacaci. acatU at ac cagtaagaga gcacgaaaai 1080 gaiglcaaga gaaacaaaaa aagegiagig gagigtcilg tailaidca actclctiac 1140 tiggicatit icatlattct galltgcalc aetgagggta agagett 遍 a agaggatccc 1200 clcaaci tta aigtgiltaa rateaecUa gaaglcatca gtgcitatgg gaacgtaggg 1260 ttctcaacgg ga tacagclg egetaggcaa at gatu-igeeg atgcciitgtg eaaagat tea 1320 tgggtt ggat tctcgggtag gtggagtagc aaaggcaagt tcatcct ta r. ct tggt ca tg 1380 ttctttggga ggctcaagaa actcaacatg aaaggtggca aagcctggaa cctctcctaa 14-10
[0036] SEQ ID M :2 序列：
[0037] WII-III^-'FIQI. CYFVH.SLVG YI.GI.KVSKf^ ΙΡνΠ .ΚΠ?.ΚΙ. FVTSVSASTV SS\1VAI.KVIHL 60 PSNSQLIiJJ LIA1FIi}GHVl·' T$yU)LU;AS YKI;Q1\RSV]S IKQIKLCLVS IPDSKSKNVH 120
[0038] KPSDDSKFND DSDRUYNCI, SYLTFVVLGY LVVVQFVGFS FVSLYITLVP SARQVLKNKG 180 IKTVTFSLFT IVSTFASCGF VPTKEMMF KKKSGLU.LV LPHILLGNTI. YPPCLRI.LTM 240 VLKKV11KHH FSYLLKNFKD VGVDIIMLSAL IICCLLVVl'VL CFNLiQFVML CSLEWNTKU 300 TOLNVWKW ASI,FQ\TK/\R ILWRSVFDLS SISSAnA'lT WMMYIP 360 ° DVKKKKKSVV HCLVI.SQi.SY ΙΛΜΙ?II.IC! THGKSLKHDP LKPKVI;K!TL HVISAYGNVG 420 FSTCYSCAHQ \!KAI)AMCKI)S WVGI:$(；HWSS KGKI'IUS.VVI ΙΨΟΚ?ΜΙΚΜ K(X；KAWNI,S 179 SEQUENCE LISTING 〈110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 〈120> -種大豆GmHKT蛋白及其編碼基因與應(yīng)用 <130> 0 <160> 4 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1440 <212> DNA 〈213> 大豆屬大豆[Glycine max (L.) <220> 〈221> GmHKT2 基因 〈222> (1).. (1440) <223> <400> 1 atgcatttcc accctttctt tattcaactt ggttatttcg tgatcctttc tctggtaggt 60 tacttgggtc tcaaggtctc aaagccaagg acccccgtta tactaaatga cttgaacctc 120 ttttacacct ctgtttctgc ttccactgtt tctagcatgg ttgcccttga aatggagctt 180 ttctccaatt cccaactcat tctcctcacc cttctcatgt ttctcggcgg ggaagttttc 240 acttccatgc tcgaccttct atttgcttcc tacaaattcc aaaacagatc agttatcagc 300 accaatcaaa tagaacttgg tttagtttct atccctgact caaaatcaga aaattaccac 360 aaaccgagtg atgatagtaa tattaacgac gacagtgata gacttaagta taactgtctt 420 agttatctga cttttgtagt tttaggttac ctagtggtgg ttcaatttgt tggctttagt 480 ttcgtgtctt tgtacataac tttggtaccg agtgcaagac aagtactgaa aaacaaaggc 540 attaagattg taacgttttc tttgtttacc atagtttcca cgtttgctag ttgtggtttt 600 gtccccacca acgagaacat gatggttttc aagaagaatt cgggacttct tctccttgtc 660 ctcccacaca tccttctagg taacaccctt tatccaccat gtttgaggct tctgataatg 720 gttttgaaaa aggttacaaa aaaagaggaa ttctcgtact tgctgaagaa tttcaaagac 780 gtgggttatg atcatatgct ctctgctctt cattgttgcc tcctggttgt tactgtcttg 840 ggtttcaatc ttatacaatt tgtgatgctt tgctctttgg agtggaacac caaaatcatg 900 gagggtttga atgtgtatga gaaagtggtg gcgtctttat ttcaagtaac aaatgcgaga 960 cacgctggtg aatctgtttt tgatctctca tccatctctt cagccatatt agtactcttc 1020 gttgttatga tgtacctccc accatacact acatttatac cagtaagaga gcacgaaaat 1080 gatgtcaaga gaaacaaaaa aagcgtagtg gagtgtcttg tattatctca actctcttac 1140 ttggtcattt tcattattct gatttgcatc actgagggta agagcttaaa agaggatccc 1200 ctcaacttta atgtgtttaa catcacctta gaagtcatca gtgcttatgg gaacgtaggg 1260 ttctcaacgg gatacagctg cgctaggcaa atgaaagccg atgccatgtg caaagattca 1320 tgggttggat tctcgggtag gtggagtagc aaaggcaagt tcatccttat cttggtcatg 1380 ttctttggga ggctcaagaa actcaacatg aaaggtggca aagcctggaa cctctcctaa 1440 〈210〉 2 〈211〉 479 〈212〉 PRT 〈213〉大豆屬大豆[Glycine max (L.) 〈220〉 〈221〉大豆GmHKT2蛋白 〈222〉 (1).. (479) 〈223〉 〈400〉 2 Met His Phe His Pro Phe Phe lie Gin Leu Gly Tyr Phe Val lie Leu 15 10 15 Ser Leu Val Gly Tyr Leu Gly Leu Lys Val Ser Lys Pro Arg Thr Pro 20 25 30 Val lie Leu Asn Asp Leu Asn Leu Phe Tyr Thr Ser Val Ser Ala Ser 35 40 45 Thr Val Ser Ser Met Val Ala Leu Glu Met Glu Leu Phe Ser Asn Ser 50 55 60 Gin Leu lie Leu Leu Thr Leu Leu Met Phe Leu Gly Gly Glu Val Phe 65 70 75 80 Thr Ser Met Leu Asp Leu Leu Phe Ala Ser Tyr Lys Phe Gin Asn Arg 85 90 95 Ser Val lie Ser Thr Asn Gin lie Glu Leu Gly Leu Val Ser lie Pro 100 105 110 Asp Ser Lys Ser Glu Asn Tyr His Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn lie 115 120 125 Asn Asp Asp Ser Asp Arg Leu Lys Tyr Asn Cys Leu Ser Tyr Leu Thr 130 135 140 Phe Val Val Leu Gly Tyr Leu Val Val Val Gin Phe Val Gly Phe Ser 145 150 155 160 Phe Val Ser Leu Tyr lie Thr Leu Val Pro Ser Ala Arg Gin Val Leu 165 170 175 Lys Asn Lys Gly lie Lys lie Val Thr Phe Ser Leu Phe Thr lie Val 180 185 190 Ser Thr Phe Ala Ser Cys Gly Phe Val Pro Thr Asn Glu Asn Met Met 195 200 205 Val Phe Lys Lys Asn Ser Gly Leu Leu Leu Leu Val Leu Pro His lie 210 215 220 Leu Leu Gly Asn Thr Leu Tyr Pro Pro Cys Leu Arg Leu Leu lie Met 225 230 235 240 Val Leu Lys Lys Val Thr Lys Lys Glu Glu Phe Ser Tyr Leu Leu Lys 245 250 255 Asn Phe Lys Asp Val Gly Tyr Asp His Met Leu Ser Ala Leu His Cys 260 265 270 Cys Leu Leu Val Val Thr Val Leu Gly Phe Asn Leu lie Gin Phe Val 275 280 285 Met Leu Cys Ser Leu Glu Trp Asn Thr Lys lie Met Glu Gly Leu Asn 290 295 300 Val Tyr Glu Lys Val Val Ala Ser Leu Phe Gin Val Thr Asn Ala Arg 305 310 315 320 His Ala Gly Glu Ser Val Phe Asp Leu Ser Ser lie Ser Ser Ala lie 325 330 335 Leu Val Leu Phe Val Val Met Met Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr Thr Phe 340 345 350 lie Pro Val Arg Glu His Glu Asn Asp Val Lys Arg Asn Lys Lys Ser 355 360 365 Val Val Glu Cys Leu Val Leu Ser Gin Leu Ser Tyr Leu Val lie Phe 370 375 380 lie lie Leu lie Cys lie Thr Glu Gly Lys Ser Leu Lys Glu Asp Pro 385 390 395 400 Leu Asn Phe Asn Val Phe Asn lie Thr Leu Glu Val lie Ser Ala Tyr 405 410 415 Gly Asn Val Gly Phe Ser Thr Gly Tyr Ser Cys Ala Arg Gin Met Lys 420 425 430 Ala Asp Ala Met Cys Lys Asp Ser Trp Val Gly Phe Ser Gly Arg Trp 435 440 445 Ser Ser Lys Gly Lys Phe lie Leu lie Leu Val Met Phe Phe Gly Arg 450 455 460 Leu Lys Lys Leu Asn Met Lys Gly Gly Lys Ala Trp Asn Leu Ser 465 470 475 〈210〉 3 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉人工 〈220〉 〈221〉GmHKT2 ORF 正向引物 〈222〉 （1)..(19) <223> 〈400> 3 atgggtttag tttttctcc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA 〈213> 人工 <220> 〈221> GmHKT2 ORF 反向引物 〈222> (1)..(20) <223> <400> 4 ttaggagagg ttccaggctt 20
【權(quán)利要求】
1. 一種大? GmHKT蛋白，是具有序列表中的SEQ ID Ns :2所述氣基酸殘基序列的蛋白 質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的大豆GmHKT蛋白的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于：所述大豆GmHKT蛋白的cDNA基因，具有 下述核苷酸序列之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns : 1的DNA序列； 2) 編碼序列表中SEQ ID Ns :2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體。
5. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的宿主菌。
6. 擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的引物。
7. 權(quán)利要求1所述的大豆GmHKT蛋白在培育耐鹽性植物中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求2或3所述基因在培育耐鹽性植物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104098665SQ201410368246
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】陳華濤, 陳新, 張紅梅, 袁星星, 崔曉艷, 劉曉慶 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院