一種用于篩選抗枯萎病香蕉品種的基因標記物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于篩選抗枯萎病香蕉品種的基因標記物，包含標記基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一種或多種，MaDAHPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，MaEPSPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，MaICS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，MaCAD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本發明采用水楊酸代謝途徑關鍵基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一種或多種作為基因標記物，可以用于香蕉抗枯萎病早期篩選，為育種的早期鑒定提供了技術保障。
【專利說明】一種用于篩選抗枯萎病香蕉品種的基因標記物

【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，尤其涉及一種用于篩選抗枯萎病香蕉品種的基因 標記物。

【背景技術】
[0002]香蕉枯萎病，又稱巴拿馬病、黃葉病，是在世界范圍內限制香蕉產量的主要原因 (Getha and Vikineswary，2002 ;0, Donnell et al，1998 ;Ploetz and Pegg，2000)。該病 是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense，Foc)引起的毀滅性土傳 維管束病害，廣泛分布于世界各大香蕉主產區（高喬婉，1996)。香蕉枯萎病菌是兼性寄生 菌，其腐生能力很強，在土壤中可以存活S-10年。病原菌進入寄主以后，采用死體營養方 式，先降解寄主組織，殺死寄主細胞，再吸收營養（王振中，2006)。香蕉枯萎病是一種典型 的維管束病害，發病時在整株外表可見明顯的萎焉和下部老葉變黃，在病害嚴重時期，受感 染的植株大多數的葉片變黃或干枯，假莖可以直立1-2個月，之后整株倒地腐爛。在受感染 的植株內部，根系和球莖的木質部組織中呈現出紅褐色至栗色的變化。在球莖的橫切面，有 紅掠色或黑色的斑點，這是被病原囷侵染后壞死的維管束（P6r ez_Vicente, 2004)。Foe也 侵染香蕉周圍萌發的吸牙（P6rez-Vicente，2004)。同時枯萎病擴散的途徑還包括帶病的種 苗（Su et al，1986)和帶有病原菌的農耕工具及種植者（Hwang et al，2004)等。
[0003]目前依據病菌在香蕉不同品系及不同屬種的致病程度，將其劃分為4個生理小種 (Koenig et al，1997)。其中，1號小種（Racel)呈世界性分布，侵染粉蕉、香蕉的栽培品種 大蠻舍（Gros Michel, AAA)及龍牙焦（Musa, AAB)，不侵染矮香蕉（Dwarf Cavendish, AAA); 香蕉栽培史上第一次枯萎病爆發就是1號生理小種造成的。2號小種（Race2)僅侵染三 倍體雜種棱香蕉（Bl Ugg〇e，AAB)，不侵染大蜜舍，對香蕉栽培品種的危害較小。3號小種 (Race 3)主要侵染野生揭尾蕉屬（Heliconia spp·)，對香蕉栽培品種基本不造成危害。4號 小種（Race4)幾乎危害所有的香蕉和大蕉品種（Persley et al, 1987 ;Koenig et al，1997 ; Ploetz et al，2000)，如大蜜舍、矮香蕉、野蕉、棱指蕉。該小種分熱帶型（tropical)和亞 熱帶型（subtropical)兩種（Visser et al，2〇10)，在香蕉整個生長時期均造成危害，當土 壤中病原菌的濃度達到1 X l〇3CFU/g時，就能使香蕉表現出病害癥狀（何欣等，2010)。4號 生理小種在4個生理小種中破壞性最大（Persley et al，1987 ;王振中，2006)，目前占世界 栽培香蕉種植面積的80%的品種受它侵染，這其中包括商品化種植程度很高的卡文迪什亞 種（Cavendish subgroups)(Kungn and Jeffries, 2001 ;Ploetz，2005)。
[0004] 香蕉枯萎病的發生和發展機理十分復雜，在該研究領域一直存在長期的爭論，其 研究涉及到病理學、解剖學、生理學、生物化學和分子生物學等多個學科。有研究顯示枯萎 病的發生是由于病原菌通過根系侵入植株輸導組織，病原體在木質部的導管中大量繁殖， 這些繁殖體可以在蒸騰壓力的作用下隨導管運輸（在梯狀導管的基部收集到病原體）， 隨著病原體的大量增殖，增殖的病原菌體可由一個導管運輸到另一個導管，大量繁殖的 病原菌在導管內形成凝膠體，受感染的宿主分泌酚類化合物使堵塞的導管木質化而死亡 (Ploetz and Pegg，2000)。同樣利用GFP標記的Foe TR4觀察到在接種1天后病源菌便附 著于根系表皮細胞，沿細胞間層生長，之后可在維管束中大量繁殖從而導致根系死亡（殷 曉敏等，2011)。
[0005] 用香蕉枯萎病菌細胞壁的激發子處理香蕉根系會誘發根系細胞壁的木質化，而且 耐病品種中這些酶活均高于感病品種（cv. Williams)，表明木質素引起細胞壁加厚是起到 防衛尖孢鐮刀菌4號生理小種的重要途徑（Ana et al, 2000)。研究發現利用激發子處理香 蕉植株后，與對照相比較，水楊酸的水平提高21倍，防御酶活性也顯著提高，同時多酚含量 也提高，說明激發子能夠誘導產生系統獲得性抗性（Patel et al，2004)，同樣在抗病品種 中的酚酸類物質上升高于感病品種（VandenBerg et al，20〇7)，這些研究結果表明香蕉對 枯萎病菌存在可誘導的抗病性，而且酚類物質代謝參與香蕉抗枯萎病的過程。
[0006] 在基因水平，VandenBerg等（2007)利用SSH和微陣列技術研究耐病和感病品種的 香焦根系中發現細胞壁加固相關基因可能參與到香蕉抵抗枯病病菌的侵染，這與之前的生 化研究結果相吻合。伴隨著新~代測序技術的發展，RNA-seq(RNA-sequencing)和數字基 因表達譜（Digital gene expression profiles, DGE)廣泛應用到非模式植物尤其是農作物 的轉綠組和基因表達譜的研究（Varshney et al，2009 ;梁燁等，2011)。最近Li等（2012) 利用這些技術研究香蕉與枯萎病互作的抗性機理，研究發現病原菌侵染香蕉激活了香蕉的 病原菌相關分子模式觸發的免疫反應（PTI)，效應因子觸發的免疫反應（ETI)，離子流和茉 莉酸的生物合成參與到香蕉抗枯萎病的過程，水楊酸不參與香蕉抗Foe TR4的過程，上述結 果從轉綠組角度闡釋了香蕉抗枯萎病的分子機理。
[0007] 由于香焦是二倍體，不廣生種子，常規育種很難進行（Robinson, 1996)。在香蕉 品種中，野生種的香蕉對枯萎病具有很好的抗性，這些材料是很好的抗病基因庫（Pl〇etz and Pegg，2〇00)。但對這些基因功能的研究還只處在初始階段。而利用基因工程手段將 抗病相關基因導入感病香焦品種僅有少數成功的報道（Mahdavi et al,2012)，但在香蕉 中可罪有效的is傳轉化方法還需要進一步的探索與研究（Becker et al, 2000 ;Khanna et al，2004)。
[0008] DNA分子標記是DNA水平遺傳變異的直接反映，而且具有標記量豐富、穩定、操作 簡便等優點。目前，DNA分子標記已廣泛地應用于種質資源研究、遺傳圖譜構建、目的基因 定位和分子標記輔助選擇等各方面（葛頌等，1994)。
[0009]香蕉品種創制是對香蕉品種經濟性狀的設計、重組、選擇和固定。傳統的育種方法 主要是依靠香蕉的形態標記進行選擇，同時香蕉的高度不育和多態性不但耗費大量的人力 和物力，而且需要很長的時間。近年來，隨著生物技術的發展，香蕉育種的方式有了很大的 變化，各種遺傳標記廣泛應用于香蕉育種，尤其是DNA分子標記技術的應用，極大地縮短了 育種的周期。
[0010]大量的DNA分子標記被運用于香蕉親緣關系分析及分類的研究。Uma等采用rapd 標記技術分析印第安I6個品種的野生蕉遺傳多樣性和種間相關性，將16個品種分為4類。 我國士者對3 3個品種香蕉（Musa nana Lour,為M. acuminata與M. balbisian的自交及雜 交后代）的遺傳變異進行了研究，將這些品種劃歸4個群。Noyer等利用SSR和AFLP標記 對30個香蕉品種遺傳背景分析，發現遺傳基礎較為狹小，而用m SAp標記研究在CCGG位點 胞核嘧啶甲基化程度，獲得較高的遺傳多樣性數據。Nair等采用建立在香蕉的 LTR序列基 礎之上的IRAP標記對％個香蕉品種基因組分類，結果表明，iraP標記在鑒定B基因存在 較為適用。Creste等利用微衛星標記技術對巴西的58個香蕉品種的基因型（49個二倍體 和9個三倍體品種）進行分類，為種質資源的鑒定和評價奠定了基礎。
[0011]近年來隨著分子生物學研究手段的不斷更新，基因組學和轉錄組學研究獲得快速 f展，建立在這些技術基礎上的數量眾多的基因表達信息被獲得。因此，借助于這些信息分 離用于鑒定某一性狀的標記基因成為可能，為育種的早期鑒定提供了技術保障。


【發明內容】

[0012] 本發明的目的在于現有技術的不足，提供一種基因標記物，可用于抗枯萎病香蕉 品種的早期篩選。
[0013] 本發明的第一個方面是提供一種于篩選抗枯萎病香蕉品種的基因標記物，述基 因標記物包含標記基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、Males、MaCADl和MaC4H2中的一種或多種， MaDAHPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，MaEPSPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，MalCS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，MaCADl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示， MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0014] 優選地，，所述基因標記物包含標記基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、Males、MaCADl和 MaC4H2。
[0015] 本發明的第二個發明是提供一種篩選抗枯萎病香蕉品種的方法，包括以下步驟： 將香蕉幼苗接種鐮刀菌，然后確定本發明第一個方面所述的基因標記物的表達水平，篩選 基因標記物的表達水平提高的香蕉幼苗。
[0016] 優選地，在接種鐮刀菌之前，先確定本發明第一個方面所述的基因標記物的表達 水平。
[0017] 本發明的第三個方面是提供一種本發明第一個方面所述的基因標記物在篩選抗 枯萎病香蕉品種中的應用。
[0018] 本發明的第四個方面是提供一種試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測本發明第一個 方面1所述的基因標記物的表達的探針。
[0019] 本發明采用水楊酸代謝途徑關鍵基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、MalCS、MaCADl和 MaC4H2中的一種或多種作為基因標記物，可以用于香蕉抗枯萎病早期篩選，為育種的早期 鑒定提供了技術保障。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為感病品種和抗病品種接種FocTR4后游離態水楊酸（SA)的含量檢測結果；
[0021] 圖2為感病品種和抗病品種接種FocTR4后結合態SA的含量檢測結果；
[0022] 圖3為感病品種和抗病品種中MaDAHPSl表達檢測結果；
[0023] 圖4為感病品種和抗病品種中MaEPSPSl表達檢測結果；
[0024] 圖5為感病品種和抗病品種中MalCS表達檢測結果；
[0025] 圖6為感病品種和抗病品種中MaCADl表達檢測結果；
[0026] 圖7為感病品種和抗病品種中MaC4H2表達檢測結果；
[0027] 圖8為不同濃度水楊酸處理對Foe TR4生長的影響的檢測結果，其中，水楊酸處理 濃度：1 :OuM ;2 :50uM ;3 :100uM ;4 :200uM ;5 :300uM ;6 :400uM ;7 :500uM ;8 :600uM ;
[0028]圖9不同濃度的水楊酸對香蕉幼苗根系的影響結果圖，其中b*a的局部放大圖；
[0029]圖1〇為水楊酸處理對誘導香蕉抗病性的效果圖，其中，a為外部癥狀，b為內部癥 狀；
[0030t圖η為SA預處理后接種Foc TR4后香蕉根系SA含量影響的檢測結果，其中，a為 對游離態SA含量的影響，b為對結合態SA含量的影響；
[0031 ]圖12為SA預處理后接種Foc TR4后對誘導水楊酸代謝途徑關建酶基因的表達的 影響。

【具體實施方式】
[0032]下面參照附圖，結合具體的實施例對本發明作進一步的描述，以更好地理解本發 明。
[0033] 1·水楊酸代謝途徑關鍵基因的獲得（克隆）
[0034]以鐮刀菌侵染后2天、4天和6天的香蕉根系提取總RNA,構建文庫進行轉錄組 分析，犾得涉及水楊酸代謝途徑差異表達cDNA片段14個，并用RACE技術在香蕉果實中 克隆到了 5個重要基因的全長序列，分別命名為3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸_7_磷 酸合酶基因（ 3_dexy-D-arabin〇-heptulosonate-7-phosphate synthase, MaDAHPSl)、 5細醇丙麗醜莽草酸_3-憐酸合成酶基因（S-enoipyruvyishikimateS-phosphate synthase, MaEPSPSl)、異分支合酶基因（isoch〇rismate synthase, MalCS)、肉桂醇脫氧 酶基因 （Cinnamyl alcohol dehydrogenase, MaCADl)、肉桂酸 4-羥基裂解酶基因 （Cinnama te-4-hydroxylase, MaC4H2)〇
[0035] 1· 1 MaDAHPSl 克隆
[0036]提取香蕉（Musa acuminate L_ AAA group cv. Brazilian,中國熱帶農業科學院熱 帶生物技術研究所澄邁香蕉種植園）根系的總RNA，反轉錄得到cDNA,按照如下體系進行 PCR擴增：
[0037]以反轉錄cDNA為模板，以D1-3'以及D2-3'作為5，RACE反應的3,端弓丨物和5,端 接頭引物ptr5 '進行半嵌套PCR擴增，經過2輪PCR擴增獲得883bp長PCR產物。以D3-5， 和3'端接頭引物ptr3'進行PCR擴增基因3'端序列，獲得424bp長PCR產物。對轉錄組 序列、5'端序列和3'端序列分析獲得該基因的全長序列，以此全長序列設計引物DAH5,和 DAH3'，以反轉錄cDNA為模板，按下列PCR反應體系和條件進行PCR擴增得產物。
[0038] PCR 引物：
[0039] D1-3' ：5' -CTGTTCGCTGTGCTCAGTGAAATCG-3,；
[0040] D2-3' ：5' -TGGCAGTATGCCCGGATCATTTCTCTG-3' ；
[0041 ] D3-5 ' ： 5，-ATTGCCAATCCTCTTGGGATCAAG-3，。
[0042] cDNA接頭引物：
[0043] ptr5, ：5, -CTCCGAGATCTGGACGAGC-3,；
[0044] ptr3, ：5, -TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3，。
[0045] 基因全長引物：
[0046] DAH-5,引物：5' -ATGGCCCTCGCCAGCGGCTC-3,；
[0047] DAH-3 ' 引物：5 ' -TCATAAGTGGAAAAGGCATAG-3 '。
[0048] PCR反應體系：
[0049] 在0. 2mL離心管中依次加入：
[0050]

【權利要求】
1. 一種基因標記物，其特征在于，所述基因標記物包含標記基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、 MalCS、MaCADl和MaC4H2中的一種或多種，MaDAHPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， MaEPSPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，MalCS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示， MaCADl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2. 根據權利要求1所述的基因標記物，其特征在于，所述基因標記物包含標記基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、MalCS、MaCADl 和 MaC4H2。
3. -種篩選抗枯萎病香蕉品種的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將香蕉幼苗接種鐮刀菌，然后確定權利要求1所述的基因標記物的表達水平，篩選基 因標記物的表達水平提商的香焦幼苗。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在接種鐮刀菌之前，先確定香蕉幼苗中權 利要求1所述的基因標記物的表達水平。
5. 權利要求1所述的基因標記物在篩選抗枯萎病香蕉品種中的應用。
6. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含用于檢測權利要求1所述的基因標記物 的表達的探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232759SQ201410405969
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】金志強, 王卓, 徐碧玉, 劉菊華, 張建斌, 賈彩紅, 苗紅霞 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所