專利名稱：一種防治香蕉枯萎病的白刺鏈霉菌株bwl15-4及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種防治香蕉枯萎病的菌株及其應用，具體涉及一種防治香蕉枯萎病的白刺鏈霉菌株BWL15-4及其應用。

背景技術：
香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一種香蕉生產上的毀滅性土傳病害。該病原菌有4個生理小種，在我國分布的是1 號和4號兩個生理小種，對我國香蕉產業危害最大的是4號生理小種，目前已在海南、廣東、 云南、福建大部分香蕉種植區大面積發生，發病面積已超過50萬畝。廣東和海南香蕉枯萎病發病嚴重的地方已不能再規模化種植香蕉，不得不改種其它作物。香蕉枯萎病菌是土壤習居菌，它從香蕉的根部侵入，沿維管束往上擴散蔓延，堵塞導管，產生毒素，破壞維管束的水分和養分的輸送功能，從而使香蕉植株的地上部分得不到水分和養分而發黃枯萎。病原菌的厚垣孢子可在土壤中存活10多年，是一種積年流行的病害。由于香蕉枯萎病病原菌在維管束內擴展侵染，至今尚無十分有效的化學藥劑防治和高抗枯萎病品種。因此，生物防治受到廣泛關注。已報道或申請專利的香蕉枯萎病生物防治措施，大部分是采用芽孢桿菌作為生防菌株，這類菌株作為生防菌有許多優點，但也存在一個嚴重不足，即菌株本身對病原菌的拮抗能力不強，從而有可能影響其生防效果。

發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種防治香蕉枯萎病的白刺鏈霉菌株BWL15-4，由于該菌株本身分離自植物根際土壤，是土壤習居菌，根際定殖能力強，生防效果良好，尤其對香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力強。本發明的第二個目的在于提供上述白刺鏈霉菌株BWL15-4在防治香蕉枯萎病中的應用。本發明的第三個目的在于提供一種含有上述白刺鏈霉菌株BWL15-4的制劑。本發明的第四個目的在于提供上述制劑的制備方法，該制備方法工藝簡單，發酵培養基無需貴重原料，成本低，容易推廣。本發明的最后一個目的在于提供上述制劑在防治香蕉枯萎病中的應用。本發明的第一個目的是通過如下技術手段來實現的一種防治香蕉枯萎病的白刺鏈霉菌株BWL 15-4，該菌株BWL 15_4的分類命名為白刺鏈霉菌(Sti^ptomyces albospinus)，于2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC No. 4836。該菌株的16S rDNA部分基因序列(1491bp)已提交美國國家生物技術信息中心 (NCBI)的Genebank基因序列數據庫，登錄號為JN038327 ；該菌株BWL15-4的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
本發明的第二個技術方案是通過如下技術方案來實現的上述白刺鏈霉菌株 BWL15-4在防治香蕉枯萎病中的應用。本發明的第三個技術方案是通過如下技術方案來實現的一種防治香蕉枯萎病的制劑，含有上述白刺鏈霉菌株BWL15-4的液體菌劑或固體菌劑。本發明的第四個技術方案是通過如下技術方案來實現的上述制劑的制備方法， 將上述白刺鏈霉菌株BWL15-4經菌種活化、液體或固體發酵工序制備獲得液體菌劑或固體菌劑。 其中在上述制劑的制備方法中，還可以含有種子培養工序，即將上述白刺鏈霉菌株BWL15-4經菌種活化、種子培養、液體或固體發酵工序制備獲得液體菌劑或固體菌劑。具體來說，本發明中的液體菌劑可以通過以下工藝流程獲得菌種BWL15-4活化 (即一級種子培養)一菌種培養(即二級種子培養，可選)一液體發酵(發酵罐，無菌空氣， 培養液)一液體菌劑。其中液體培養基可以為葡萄糖1_3%、黃豆餅粉1_4%、可溶性淀粉1-4%、酵母 0.2%,NaCl 0.4%、CaC030. 25%、消泡劑0. 1-0.3%，按質量百分含量計。以下僅為優選的培養基，實際上本發明對培養條件和液體培養基并沒有特別嚴格的限制，只要該條件和液體培養基適合菌株的生長即可。具體來說，本發明中的固體菌劑可以通過如下工藝流程獲得菌種BWL15-4活化 (即一級種子培養)一菌種培養(即二級種子培養，可選)一固體發酵(固體培養基質)一發酵餅一干燥粉碎，與吸附載體按1 1或者其它比例混合，混勻后適當干燥，制成固體菌齊U。其中吸附載體可為非耕作層土、高嶺土等多種載體。其中固體發酵時采用的固體培養基優選為包括大米60-70 %，黃豆粉5-15 %，麥皮10-20%，沙土 5%，按質量百分含量計。以上僅為本發明優選的培養基，實際上本發明對培養條件以及固體培養基的選擇其實并沒有特別嚴格的限制，只要該條件和固體培養基適合菌株的生長即可。本發明的最后一個目的是通過如下技術手段來實現的上述制劑在防治香蕉枯萎病中的應用。本發明中的制劑在防治香蕉枯萎病時，可以將液體菌劑或固體菌劑與普通有機肥按2 100的比例混合拌勻后作為底肥施用，每個定植穴施2. 5公斤，在香蕉種植前施用； 在香蕉種植后的生長期，可將液體菌劑或者固體菌劑以稀釋5-10倍的比例加入到溶解的常規肥料中，對香蕉植株進行澆灌施肥。或者本發明中的液體菌劑防治香蕉枯萎病可以通過將液體菌劑稀釋成2倍或根據需要進行稀釋后液灌根或澆施于植株基部，或于香蕉苗移栽前浸根。與現有技術相比，本發明具有如下優點(1)本發明以白刺鏈霉菌BWL15-4作為拮抗菌株，對香蕉枯萎病菌抑制作用強，對香蕉枯萎病具有良好的防治效果；(2)本發明的制劑對香蕉具有促生長作用；(3)本發明白刺鏈霉菌菌株BWL15-4培養條件簡單，容易保存，易于工業化生產， 有著良好的開發應用前景；(4)本發明制防治香蕉枯萎病的劑制備方法工藝簡單，發酵培養基無需貴重原料，成本低，容易推廣。


圖1是實施例1中篩選得到的白刺鏈霉菌BWL15-4菌株孢子及孢子鏈的掃描電鏡照片，孢子表面有細刺；

圖2是實施例1中制備的白刺鏈霉菌BWL15-4菌株與香蕉枯萎病菌4號生理小種的室內平板對峙培養的抑菌效果，其中，1為白刺鏈霉菌BWL15-4菌株，2為香蕉枯萎病菌4 號生理小種；圖3是實施例1中制備的白刺鏈霉菌BWL15-4菌株與香蕉枯萎病菌4號生理小種的室內平板對峙培養的抑菌效果，其中，1為白刺鏈霉菌BWL15-4菌株，2為香蕉枯萎病菌4 號生理小種。實施例1菌株的分離和鑒定本實施例中的生防菌BWL15-4是從海南島霸王嶺原始森林土壤中篩選分離到的一株鏈霉菌，該菌株對香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)具有強烈的抑制作用，2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC,保藏號為CGMCC No. 4836，經鑒定命名為白刺鏈霉菌BWL 15-4菌株(Sti^ptomyces albospinus BffL 15-4)。菌株BWL15-4的分離篩選過程如下將在海南島霸王嶺原始森林中采集植物根際土壤樣品進行風干，用無菌水稀釋適當倍數后涂布于篩選培養基上，篩選培養基是添加重鉻酸鉀、萘啶酸和放線菌酮的PDA固體培養基，28°C培養5天以上，待篩選平板上長出放線菌菌落后，再于平板上適當位置接入1個或多個指示菌香蕉枯萎病菌菌餅，當某個放線菌落具有拮抗作用時，指示菌便不能越過此放線菌生長，呈現明顯的拮抗帶，挑取具有拮抗作用的放線菌，劃線純化三次，進行平板對峙實驗，選擇拮抗帶較寬的放線菌作為候選菌株， 將候選菌株進行液體發酵，取發酵液IOmL過濾除菌，用牛津杯進行平板對峙實驗檢驗發酵液中抗菌活性物質的產生情況，產生抗菌物質的發酵液再于香蕉枯萎病病圃中進行田間防效篩選，由此篩選出田間防治效果良好的拮抗菌株BWL15-4。菌株BWL15-4的鑒定過程如下首先對其進行16S rDNA序列分析，將本菌株的16S rDNA 序列在線提交至Ij gene bank(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)中進 亍 Blast 比對，發現其與白刺鏈霉菌(Str印tomyces albospinus)處于同一個進化分支，同源性達 99%以上，本菌株的16S rDNA序列部分基因序列(1493bp)，已提交美國國家生物技術信息中心(NCBI)的Genebank基因序列數據庫，登錄號為JN038327，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。然后對BWL15-4菌株進行形態學特征、培養特征和生理生化特性分析鑒定，經分析其形態特征是在掃描電鏡下孢子絲呈2-3圈螺旋形，孢子呈卵圓形，表面帶細刺(見圖 1)；其培養特征是在營養瓊脂平板上有豐富的氣生菌絲和基內菌絲，氣絲灰白色，基絲欖黃色，無可溶性色素；其生理生化特性是能液化明膠，淀粉水解弱，還原硝酸鹽，不產硫化氫和黑色素，利用尿素，能利用果糖、木糖、甘油、乳糖、水楊苷、菊糖、葡萄糖、肌醇、甘露醇、 半乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉、山梨糖，不利用阿拉伯糖、蔗糖、衛矛醇，在棉子糖、甘露糖為唯一碳源的培養基質上生長差。結果表明本菌株的形態學特征和培養特征和白刺鏈霉菌完全相同，生理生化特性絕大部分和白刺鏈霉菌相同。因此，綜合16S rDNA序列的比對結果和形態特征、培養特征和生理生化特性分析的結果，將BWL15-4菌株鑒定為白刺鏈霉菌，命名為白刺鏈霉菌 BWL15-4 菌株(Streptomyces albospinus BWL15-4)。該菌株抑菌作用強，在室內平板對峙培養實驗中抑菌圈直徑平均為18mm，被抑制的指示菌香蕉枯萎病菌4號生理小種菌絲尖端膨大，變黑，細胞質液外泄(見圖2和圖3)， 說明該菌株的代謝產物對病原菌菌絲具殺死作用和很強的抑制作用。實施例2
液體菌劑及其制備方法本實施例提供的含有上述白刺鏈霉菌株BWL15-4的液體菌劑通過如下方法制備
獲得(1)菌種活化，將白刺鏈霉菌株BWL15-4接種到固體培養基上，培養基為營養瓊脂
培養基；(2)種子培養，將活化菌種接種到液體培養基，配方為葡萄糖1 %，黃豆餅粉1 %， 酵母膏0.2%，NaCl 0. 3%, CaCO3O. 1%, K2HPO4O. 05% ；按質量百分含量計，其余為水；pH值 7.0-7.2;在281下三角瓶16011)111搖瓶發酵培養72小時，如果步驟(1)中經菌種活化即一級種子培養后，菌種數量足夠多則可以直接進行液體發酵，而不需再經種子培養即二級種子培養工序；(3)液體發酵，將種子液按6% (V/V)添加到液體培養基中，配方為葡萄糖2%、 黃豆餅粉2%、可溶性淀粉2%、酵母膏0.2%、NaCl 0.4%, CaCO3O. 25%、消泡劑0. 1%，按質量百分含量計，其余為水，本實施例中采用的為較佳的培養基，其它培養基也可以，并無特別的限制，PH值7. 2，罐溫28°C，罐壓0. 07Mpa，攪拌速度200rpm，通氧量> 60%，發酵時間約7天，獲得液體發酵制劑，供田間防治病害用。實施例3固體菌劑及其制備方法本實施例提供的含有上述白刺鏈霉菌株BWL15-4的固體菌劑通過如下方法制備
獲得(1)菌種活化將白刺鏈霉菌株BWL15-4接種到固體培養基上，培養基為營養瓊脂
培養基；(2)種子培養將活化菌種接種到液體培養基，配方為葡萄糖1 %，黃豆餅粉1 %， 酵母膏0.2%，NaCl 0. 3%, CaCO3 0.1%, K2HPO4 0. 05%，按質量百分含量計，其余為水；pH 值7. 0-7. 2 ；在28°C下三角瓶160轉/分鐘搖瓶發酵培養72小時，如果步驟(1)中經菌種活化即一級種子培養后，菌種數量足夠多則可以直接進行固體發酵，而不需再經種子培養即二級種子培養工序；(3)固體培養將種子培養液與固體培養基混合，固體培養基配方為大米65%， 黃豆粉15%，麥皮15%，沙土 5%，以上按質量百分含量計，本實施例中采用的為較佳的培養基，其它培養基也可以，并無特別的限制；28°C -30°C培養時間14天左右，此時固體培養基應充分生長且大量產孢；(4)菌劑制備將已充分發酵的固體培養物與非耕作層或高嶺土按1 1或者其它比例混合后干燥粉碎，即制成固體菌劑。
實施例4液體菌劑和固體菌劑對香蕉枯萎病田間防治效果試驗用菌劑實施例2中制備的白刺鏈霉菌BWL15-4液體菌劑，實施例3中制備的白刺鏈霉菌BWL15-4固體菌劑，清水對照。試驗地點中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所海口香蕉枯萎病病圃。
供試香蕉品種感枯萎病品種巴西蕉。施藥方法定植穴預處理用上述含白刺鏈霉菌BWL15-4菌株的液體菌劑2倍稀釋液IL澆淋定植穴，然后覆蓋薄土；固體菌劑與有機肥按1 1混合后，每個定植穴放用2. 5公斤，與穴內土壤充分拌勻。香蕉苗預施菌劑處理移栽前一天，將香蕉苗用含有白刺鏈霉菌BWL15-4菌株液體菌劑的2倍稀釋液浸根；固體菌劑稀釋5倍后用于香蕉苗浸根。移栽將浸根后的香蕉苗移栽于處理過的定植穴中。管理定期施肥，液體菌劑處理每月用液體菌劑的5倍稀釋液2L灌根一次，固體菌劑處理每月用固體菌劑的5倍稀釋液灌根一次，6個月后記錄植株病情指數、發病率，并計算防治效果。發病率％=發病株(葉)數X 100/調查總株(葉)數病情指數％ = Σ (各級病株(葉)數X該病級值)/調查總株(葉)數X最高級值防治效果％ =(對照病情指數-處理病情指數)X 100/對照病情指數香蕉枯萎病病情調查分級標準0級外觀無可見癥狀，解剖假莖維管束組織未見變褐，1級外觀無可見癥狀，解剖假莖維管束組織變褐，2級葉片黃化或倒垂，3級假莖基部開裂，但病株尚未枯死，4級病株枯死。試驗結果對照區在香蕉苗定植后40天開始出現香蕉枯萎病癥狀，經白刺鏈霉菌BWL15-4菌株液體制劑或固體菌劑處理的香蕉在處理150天后才有個別植株基部葉表現輕度黃葉癥狀，液體菌劑處理的試驗6個月后的防治效果為84% (詳見表1)，固體菌劑處理的6個月后的防治效果為80% (詳見表2)，表明對香蕉枯萎病具有良好的防治效果。表1白刺鏈霉菌BWL15-4液體菌劑對香蕉枯萎病的防治效果
~lm發病率(％)病情指數防治效果(％)
CK9062 5~
液體菌齊IJ 201084 表2白刺鏈霉菌BWL15-4固體菌劑對香蕉枯萎病的防治效果
權利要求
1.一種防治香蕉枯萎病的白刺鏈霉菌株BWL15-4，其特征是該菌株BWL 15_4的分類命名為白刺鏈霉菌(Sti^ptomyces albospinus)，于2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4836。
2.權利要求1所述的白刺鏈霉菌株BWL15-4在防治香蕉枯萎病中的應用。
3.一種防治香蕉枯萎病的制劑，其特征是含有權利要求1所述的白刺鏈霉菌株 BWL15-4的液體菌劑或固體菌劑。
4.權利要求3所述制劑的制備方法，其特征是將白刺鏈霉菌株BWL15-4經含菌種活化、液體或固體發酵工序制備獲得液體菌劑或固體菌劑。
5.根據權利要求4所述制劑的制備方法，其特征是還包括種子培養工序。
6.根據權利要求5所述制劑的制備方法，其特征是液體發酵時采用的培養基包括葡萄糖1-3%、黃豆餅粉1_4%、可溶性淀粉1-4%、酵母膏0. 2%, NaClO. 4%, CaCO3 0. 25%, 消泡劑0. 1-0.3%，按質量百分含量計。
7.根據權利要求5所述制劑的制備方法，其特征是固體發酵時采用的固體培養基包括大米60-70 %，黃豆粉5-15 %，麥皮10-20 %，沙土 5_10 %，按質量百分含量計。
8.權利要求3所述制劑在防治香蕉枯萎病中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種防治香蕉枯萎病的白刺鏈霉菌株BWL15-4，該菌株BWL15-4的分類命名為白刺鏈霉菌(Streptomyces albospinus)，于2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4836。該菌株對香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力強，可用于防治香蕉枯萎病；還公開了含有該菌株的菌劑及其制備方法和應用，該菌劑不僅能抑制香蕉枯萎病，還對植株有一定的促生長作用。
文檔編號C12R1/465GK102329756SQ20111029609
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者彭明, 曾會才, 曾濤, 莫坤聯, 陳漢清 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所