一種植物內生菌的分離方法
【專利摘要】本發明涉及微生物【技術領域】，公開了一種植物內生菌的分離方法，包括以下步驟：(1)植物組織預處理；(2)植物組織培養；(3)內生菌的分離。本發明公開的植物內生菌的分離方法，可以有效除去表面細菌、真菌、放線菌以及其他微生物，避免混入雜菌影響內生菌分離效果。經過組織培養后，植物組織內的內生菌恢復生長，且在分離內生菌的操作中，無需再進行消毒處理，從而大大減少了消毒劑對植物組織和內生菌的傷害作用，增加了內生菌的生存概率，能夠顯著提高分離得到的內生菌的數目。
【專利說明】一種植物內生菌的分離方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物【技術領域】，特別是指一種植物內生菌的分離方法。

【背景技術】
[0002] 目前，植物內生菌分離的方法大多是將植物組織直接消毒后通過物理、化學等途 徑破碎，然后提取其滲出液，并將液體作為菌源進行內生菌的培養和分離。內生菌分離的關 鍵是消除植物體表面微生物的污染，為了確保所分離到的微生物為植物內生菌，常采用非 常嚴格的消毒措施。目前，在植物內生菌分離中使用的消毒方法大多數采用植物體表面消 毒法去除非內生菌的污染。如中國發明專利CN103122331A，公開了一種植物內生菌的分離 方法，包括采樣、表面滅菌、組織研磨、分離及純化等步驟。由于消毒劑（如次氯酸鈉、過氧 化氫、乙醇、升汞等）不僅對植物體有傷害，而且也會對內生菌造成不良影響。原因在于：消 毒劑對植物的傷害會導致植物體內產生活性氧，活性氧對植物本身及其內生菌的生存都不 利，嚴重時產生超敏反應，導致植物和內生菌一起死亡。在植物內生菌分離過程中，如果能 減少使用消毒劑或者不使用消毒劑，無疑將增加內生菌的生存概率，有利于分離到更多、更 全面的內生菌。而現有的內生菌分離方法，如果減少或不使用消毒劑，將導致對植物表面消 毒不徹底，在內生菌分離中容易引人雜菌，影響內生菌的分離效果。


【發明內容】

[0003] 本發明提出了 一種植物內生菌的分離方法，減少了消毒劑對植物組織和內生菌的 傷害作用，增加了內生菌的生存概率，有助于分離到更多的內生菌。
[0004] 本發明的技術方案是這樣實現的：
[0005] -種植物內生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0006] (1)植物組織預處理
[0007] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌，晾干表面水分，將其切段，長度 0. 5-2. 0cm，然后把切好的材料置于體積濃度為70-75 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗，再 用體積濃度為〇.1-〇.3%升汞浸泡1-311^11或者質量濃度為4-6%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗，瞭干表面水分后備用；
[0008] (2)植物組織培養
[0009] 將消毒后的植物組織置于培養基上，進行無菌培養，直至植物組織恢復生長； [0010] ⑶內生菌的分離
[0011] 組織培養后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋1-5倍，分別取100-200uL稀釋液涂布于內生細菌培養基、內生真菌培養 基、內生放線菌培養基上進行培養、純化，即得內生菌單菌落。
[0012] 進一步，步驟（2)所用培養基為MS培養基。
[0013] 進一步，步驟（2)培養條件為溫度15-30°C，濕度20-70%。
[0014] 進一步，培養植物莖、葉、花、果實時，控制光照強度1000-6000LUX，光照時間 8-14h/d ;培養植物根時，光照強度0-800Lux。
[0015] 進一步，步驟（3)內生細菌培養基為牛肉蛋白胨培養基，內生真菌培養基為PDA培 養基，內生放線菌培養基為高氏一號培養基。
[0016] 進一步，步驟（3)所述純化內生菌的方法為劃線培養法。
[0017] 本發明的有益效果：
[0018] 本發明所述的內生菌分離方法先通過對消毒后的植物組織進行培養，待植物體恢 復生長后，直接對植物組織進行物理、化學等途徑破碎，然后利用從組織中滲出的汁液進行 內生菌的培養和分離。對植物組織的預處理，可以有效除去表面細菌、真菌、放線菌以及其 他微生物，從而避免混入雜菌影響內生菌分離效果。經過培養后，植物組織可以在較短時間 內恢復正常生長，植物組織內的內生菌也可恢復生長，減少了消毒劑對內生菌的損傷。經過 組織培養的植物組織，其表面的微生物已經除去了，因此在下一步分離內生菌的操作中，無 需再進行消毒處理，從而大大減少了消毒劑對植物組織和內生菌的傷害作用，增加了內生 菌的生存概率，能夠顯著提高分離得到的內生菌的數目。

【具體實施方式】
[0019] 下面將結合本發明實施例，對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然， 所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施 例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于 本發明保護的范圍。
[0020] 實施例1
[0021] 一種植物內生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0022] (1)植物組織預處理
[0023] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌2-3次，晾干表面水分，將其切割 成0. 5cm的小段，然后把切好的材料置于體積濃度為70 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗2-3 次，再用體積濃度為〇.1%升汞浸泡1-311^11或者質量濃度為4%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗3-5次，瞭干表面水分后備用；
[0024] (2)植物組織培養
[0025] 將消毒后的植物組織置于MS培養基上，進行無菌培養1-2周，直至植物組織恢復 生長；培養條件為溫度15°C，濕度20%，光照強度lOOOLux，光照時間8-10h/d ; (3)內生菌 的分離
[0026] 組織培養后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋1倍，分別取l〇〇uL稀釋液涂布于牛肉蛋白胨培養基、PDA培養基、高氏一 號培養基上進行培養分離出內生細菌、內生真菌、內生放線菌，通過劃線培養進行純化，即 得內生菌單菌落。
[0027] 實施例2
[0028] -種植物內生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0029] (1)植物組織預處理
[0030] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌2-3次，晾干表面水分，將其切割 成1. 3cm的小段，然后把切好的材料置于體積濃度為73 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗2-3 次，再用體積濃度為〇.2%升汞浸泡1-311^11或者質量濃度為5%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗3-5次，瞭干表面水分后備用；
[0031] (2)植物組織培養
[0032] 將消毒后的植物組織置于MS培養基上，進行無菌培養1-2周，直至植物組織恢復 生長；培養條件為溫度25°C，濕度50%，光照強度3000LUX，光照時間10-12h/d ;
[0033] (3)內生菌的分離
[0034] 組織培養后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋3倍，各取150uL稀釋液分別涂布于牛肉蛋白胨培養基、PDA培養基、高氏 一號培養基上進行培養分離出內生細菌、內生真菌、內生放線菌，通過劃線培養進行純化， 即得內生菌單菌落。
[0035] 實施例3
[0036] 一種植物內生菌的分離方法，包括以下步驟：
[0037] (1)植物組織預處理
[0038] 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌2-3次，晾干表面水分，將其切割 成2. 0cm的小段，然后把切好的材料置于體積濃度為75 %乙醇消毒3-5min，無菌水清洗2-3 次，再用體積濃度為〇.3%升汞浸泡1-311^11或者質量濃度為6%次氯酸鈉浸泡5-1〇1]^11，接 著用無菌水沖洗3-5次，瞭干表面水分后備用；
[0039] (2)植物組織培養
[0040] 將消毒后的植物組織置于MS培養基上，進行無菌培養1-2周，直至植物組織恢復 生長；培養條件為溫度30°C，濕度70%，光照強度6000LUX，光照時間12-14h/d ;
[0041] (3)內生菌的分離
[0042] 組織培養后的植物組織，在無菌條件下粉碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲出 液用無菌水稀釋5倍，分別取200uL稀釋液涂布于牛肉蛋白胨培養基、PDA培養基、高氏一 號培養基上進行培養分離出內生細菌、內生真菌、內生放線菌，通過劃線培養進行純化，即 得內生菌單菌落。
[0043] 實施例4
[0044] 一種植物內生菌的分離方法，步驟（2)組織培養過程中不進行光照，其他操作同 實施例1。
[0045] 實施例5
[0046] -種植物內生菌的分離方法，步驟（2)組織培養過程中光照強度為400LUX，其他 操作同實施例2。
[0047] 實施例6
[0048] 一種植物內生菌的分離方法，步驟（2)組織培養過程中光照強度為SOOLux，其他 操作同實施例3。
[0049] 本發明所述的內生菌分離方法對不同植物內生菌的分離效果
[0050] 對橡膠樹幼嫩枝條內生菌的分離效果
[0051] 實驗組取橡膠樹幼嫩枝條，采用實施例2的方法，在MS培養基上培養1-2周后，采 用劃線培養的方法純化，分離其內生菌。根據菌落形態、顏色、邊緣狀態、透明度、表面干濕 度等特征判斷分離出的菌落種類并計數。對照組以常規方法分離橡膠樹幼嫩枝條內生菌。 實驗組和對照組均設置3個重復。從橡膠樹幼嫩枝條中分離的各種內生菌的統計結果如表 1所示。
[0052] 表1橡膠幼嫩枝條中分離內生菌的統計結果
[0053]

【權利要求】
1. 一種植物內生菌的分離方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 植物組織預處理 植物組織用自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌，晾干表面水分后將其切段，長度 0. 5-2. Ocm，然后把切好的材料置于體積濃度70-75%乙醇消毒3-5min，無菌水清洗，再用 體積濃度〇. 1-0. 3 %升汞浸泡l-3min或者質量濃度4-6 %次氯酸鈉浸泡5-10min，接著用無 菌水沖洗，晾干表面水分后備用； (2) 植物組織培養 將消毒后的植物組織置于培養基上，進行無菌培養，直至植物組織恢復生長； (3) 內生菌的分離 組織培養后的植物組織，在無菌條件下切碎或剪碎，而后在消毒過的研缽中研磨，將滲 出液用無菌水稀釋1-5倍，分別取100-200UL稀釋液涂布于不同微生物培養基上進行培養、 純化，即得內生菌單菌落。
2. 根據權利要求1所述的一種植物內生菌的分離方法，其特征在于：步驟（2)所用培 養基為MS培養基。
3. 根據權利要求1所述的一種植物內生菌的分離方法，其特征在于：步驟（2)培養條 件為溫度15_30°C，濕度20-70%。
4. 根據權利要求3所述的一種植物內生菌的分離方法，其特征在于：培養植物莖、葉、 花、果實時，控制光照強度1000-6000Lu X，光照時間8-14h/d ;培養植物根時，控制光照強度 0-800Lux〇
5. 根據權利要求1所述的一種植物內生菌的分離方法，其特征在于：步驟（3)內生菌 培養基為內生細菌培養基、內生真菌培養基、內生放線菌培養基。
6. 根據權利要求5所述的一種植物內生菌的分離方法，其特征在于：步驟（3)內生細 菌培養基為牛肉蛋白胨培養基，內生真菌培養基為PDA培養基，內生放線菌培養基為高氏 一號培養基。
7. 根據權利要求1所述的一種植物內生菌的分離方法，其特征在于：步驟（3)所述純 化內生菌的方法為劃線培養法。
【文檔編號】C12N1/00GK104250616SQ201410444348
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】馮仁軍, 盧利方, 云天艷, 張銀東 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所