Fish制片再次雜交的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種FISH制片再次雜交的方法。該方法主要包括以下步驟：制片在首次熒光原位雜交后，浸泡于2×SSC中以洗掉蓋片，然后在2×SSC中浸泡3×5min；隨后把制片放入90℃的2×SSC中10min，期間不斷搖動(dòng)；再放入78℃的70％去離子甲酰胺中4min，期間不斷搖動(dòng)；隨后迅速放入-20℃的70％酒精中。該過(guò)程可把雜交信號(hào)洗脫掉，隨后觀測(cè)制片，檢測(cè)不到雜交信號(hào)。處理后的制片再次用相同的探針進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，在染色體的相同位置可再次檢測(cè)到雜交信號(hào)。本發(fā)明所述的方法使得原位雜交后的制片可重復(fù)多次使用，有效得節(jié)約了資源，降低了成本，減少了對(duì)環(huán)境的污染。
【專利說(shuō)明】FISH制片再次雜交的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉FISH制片再次雜交的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]熒光原位雜交技術(shù)始于20世紀(jì)60年代末，是利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在染色體、間期細(xì)胞核和DNA纖維上進(jìn)行DNA序列定位的一種有效手段。熒光原位雜交最初使用的探針為DNA重復(fù)序列和多拷貝基因家族，后來(lái)隨著該技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，逐漸開(kāi)始使用單低拷貝序列作為探針，使其檢測(cè)的分辨率和靈敏性都得到了大幅的提高。目前，熒光原位雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用在基因物理定位、染色體識(shí)別、物理圖譜的構(gòu)建、親緣關(guān)系研究和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等方面，在現(xiàn)代分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域有著舉足輕重的作用。
[0003]熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)中，制片的質(zhì)量往往是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵要素。可熒光原位雜交的制片往往不易獲得，需要消耗大量的實(shí)驗(yàn)材料。而在通常情況下，由于制片在首次雜交后雜交信號(hào)很難洗掉，以及不知如何正確處理制片在觀察后表面留有的試劑而又不影響制片上染色體的完整等因素，制片往往使用一次便被丟棄，這造成了資源的巨大浪費(fèi)，并且很容易污染環(huán)境。尤其對(duì)于一些珍貴的相對(duì)稀少的材料，制片更顯得尤為寶貴。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種FISH制片再次雜交的方法。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，所述的方法包括以下步驟:
[0006]I)熒光原位雜交后的制片，在2XSSC浸泡下洗掉蓋片，然后2XSSC浸泡制片3X5min,以洗掉蓋片及制片上殘留的試劑。
[0007]2)隨后把制片放入90°C的2 X SSC下lOmin，期間不斷搖動(dòng)，把制片上的試劑徹底洗滌干凈，初步變性制片上的染色體。
[0008]3)再放入78°C的70%去離子甲酰胺中4min，期間不斷搖動(dòng)，變性制片上的染色體，使其雙鏈打開(kāi)，輕微搖動(dòng)，把首次雜交中的探針序列從靶序列上洗滌掉。溫度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短則染色體變性不徹底，導(dǎo)致首次雜交中的雜交信號(hào)洗滌不徹底，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使染色體形態(tài)變得蓬松，影響觀察。
[0009]4)隨后迅速放入-20°C的70%酒精中。
[0010]5)用DAPI在暗室染色1min。
[0011]6)熒光顯微鏡觀察，觀測(cè)信號(hào)的洗脫情況。
[0012]7)再次利用該制片進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。
[0013]熒光原位雜交技術(shù)如今在染色體鑒定、物理圖譜構(gòu)建、基因組比較研究等方面起著重要的作用，利用本發(fā)明提供的FISH制片再次雜交的方法，可徹底洗脫掉熒光原位雜交中的雜交信號(hào)，從而可使制片得到多次使用。這對(duì)于研究較珍貴的材料有很大的幫助，同時(shí)減少了環(huán)境污染，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1以雷蒙德氏棉I號(hào)染色體特異BAC克隆(Wang K，2007)為探針，熒光原位雜交雷蒙德氏棉的有絲分裂中期染色體的雜交圖像。染色體顯示為藍(lán)色，特異BAC克隆為紅色信號(hào)。Bar = 5ym0 A:首次雜交的圖像。B:洗脫制片后的圖像。C:再次雜交后的圖像。
[0015]圖2以雷蒙德氏棉I號(hào)染色體特異BAC克隆(Wang K, 2007)為探針，熒光原位雜交雷蒙德氏棉的有絲分裂間期染色體的雜交圖像。染色體顯示為藍(lán)色，特異BAC克隆為紅色信號(hào)。Bar = 5ym0 A:首次雜交的圖像。B:洗脫制片后的圖像。C:再次雜交后的圖像。
[0016]圖3以陸地棉中棉所12號(hào)的中期染色體為靶DNA的雜交圖像。A:初次熒光原位雜交時(shí)中期染色體形態(tài)。B:洗脫制片后的中期染色體形態(tài)。

【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1以雷蒙德氏棉I號(hào)染色體特異BAC克隆為探針，雷蒙德氏棉(D5)有絲分裂中期染色體為靶染色體，進(jìn)行FISH制片再次雜交實(shí)驗(yàn)。
[0018]I材料和方法
[0019]1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0020]實(shí)驗(yàn)材料是雷蒙德氏棉，來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。所用的BAC為雷蒙德氏棉I號(hào)染色體特異BAC克隆(Wang K, 2007)。實(shí)驗(yàn)試劑:纖維素酶Onazuka R-1O和果膠酶Pectolyase Y-23購(gòu)自Solarb1公司，地高辛探針標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche公司，其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> [0021]1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0022]I)取材及預(yù)處理:取雷蒙德氏棉的種子在溫水中浸泡12h左右，然后在光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，待根長(zhǎng)至I?2cm時(shí)，截取根尖用(25ppm)放線菌酮25°C下處理2h，然后用蒸餾水沖洗I次，用95%乙醇:冰乙酸(3:1)固定液固定4h以上；
[0023]2)酶解:取出固定好的根尖，用蒸餾水沖洗I次，在37°C下用4%纖維素酶+2%果膠酶混合液處理根尖45min ；
[0024]3)制片:酶解好的根尖用60%乙酸進(jìn)行壓片，保留下好的制片在_80°C下保存4h以上，然后在_80°C下揭掉蓋片，迅速置于80°C烤干，在60°C烘箱中烘干10h，最后放在4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0025]4)標(biāo)記探針:探針的標(biāo)記采用Dig-Nick Translat1n Mix系統(tǒng)標(biāo)記。首先提取特異BAC克隆(299N22)的質(zhì)粒，然后參考Roche公司的說(shuō)明，先取I μ L相應(yīng)濃度的質(zhì)粒溶解于 ddH20 中，配成 16yL,#WA4yL Dig-Nick Translat1n Mix 混合,短暫離心,然后15°C保溫90min，最后是65°C溫浴lOmin，以滅活體系中的酶活性，最后放在_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026]5)熒光原位雜交流程，參照王春英等(2001)介紹的方法。地高辛標(biāo)記的探針在熒光顯微鏡下觀察顯示為紅色。染色體用DAPI襯染在熒光顯微鏡下觀察顯示藍(lán)色。
[0027]6)熒光顯微鏡觀察，用Zeiss熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)，用Zeiss-1sis成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行熒光原位雜交圖像的獲取、采集、加工。采用Photoshop作圖軟件處理圖片。
[0028]7)雜交后的制片在觀察后，在2X SSC浸泡下洗掉蓋片，然后2X SSC浸泡制片3X5min。
[0029]8)隨后把制片放入90°C的2XSSC下lOmin，期間不斷搖動(dòng)。
[0030]9)再放入78°C的70%去離子甲酰胺中4min，期間不斷搖動(dòng)。
[0031]10)隨后迅速放入_20°C的70%酒精中。
[0032]11)用 DAPI 在暗室染色 1min。
[0033]12)熒光顯微鏡觀察，用Zeiss熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)。
[0034]13)隨后的再次熒光原位雜交洗脫后的制片，同樣以雷蒙德氏棉I號(hào)染色體特異BAC克隆為探針,采用Dig-Nick Translat1n Mix系統(tǒng)標(biāo)記,突光原位雜交具體流程依舊參照王春英等(2001)介紹的方法。
[0035]14)熒光顯微鏡觀察，用Zeiss熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)。
[0036]2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0037]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)，首次熒光原位雜交后，用熒光顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)清晰的雜交信號(hào)。經(jīng)過(guò)洗脫處理制片后，雜交信號(hào)被洗脫干凈，而當(dāng)再次用同樣的探針熒光原位雜交后，雜交信號(hào)再次出現(xiàn)在染色體相同的位置。
[0038]照片上可明顯看出，首次雜交后，在染色體上有明顯紅色雜交信號(hào)；經(jīng)過(guò)對(duì)制片洗脫處理后，雜交信號(hào)被洗脫干凈；當(dāng)再一次用同樣的探針做熒光原位雜交時(shí)，雜交信號(hào)再次在染色體的相同位置被觀測(cè)到。
[0039]實(shí)施例2以陸地棉中棉所12的有絲分裂中期染色體為靶染色體，進(jìn)行FISH制片再次雜交實(shí)驗(yàn)。
[0040]I材料和方法
[0041]1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0042]實(shí)驗(yàn)材料是陸地棉中棉所12號(hào)，來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。實(shí)驗(yàn)試劑:纖維素酶Onazuka R-1O和果膠酶Pectolyase Y-23購(gòu)自Solarb1公司，地高辛探針標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche公司，其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> [0043]1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0044]在第9步時(shí)，延長(zhǎng)在78 °C的70 %去離子甲酰胺中的時(shí)間至5分鐘。其他步驟同上。
[0045]2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0046]實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)延長(zhǎng)第9步中的處理時(shí)間時(shí)，染色體形態(tài)明顯出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象(圖3)。時(shí)間越長(zhǎng)，膨脹程度越嚴(yán)重，會(huì)嚴(yán)重影響對(duì)雜交信號(hào)的觀測(cè)。而時(shí)間偏少，則會(huì)導(dǎo)致雜交信號(hào)洗滌不徹底。
【權(quán)利要求】
1.^18?制片再次雜交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)熒光原位雜交后的制片，在2X3%浸泡下洗掉蓋片，然后2X3%浸泡制片3X501！！，以洗掉蓋片及制片上殘留的試劑； 2)隨后把制片放入901的2X3%下10-！！，期間不斷搖動(dòng)，把制片上的試劑徹底洗滌干凈，初步變性制片上的染色體。； 3)再放入781的70%去離子甲酰胺中細(xì)化，期間不斷搖動(dòng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313138SQ201410534116
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】崔興雷, 劉玉玲, 劉方, 王星星, 蔡小彥, 彭仁海, 周忠麗, 王春英, 王玉紅, 王坤波 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所