一種以綠豆為原料制備甘露三糖和甘露四糖的方法
【專利摘要】本發明公開一種以綠豆為原料制備甘露三糖(manninotriose)和甘露四糖(manninotetraose)的方法。包括如下步驟：選取綠豆種子，用粉碎機粉碎，過篩，按一定料液比加入乙醇水溶液提取，將提取液離心，收集上清液，重復上述步驟兩次，并合并上清液。以綠豆水溶性糖為底物，加入轉化酶進行酶解反應，上中壓層析柱，用一系列線性濃度梯度的乙醇水溶液洗脫。對洗脫液進行HPLC分析，合并收集相應組分，得到甘露三糖和甘露四糖粗品。將得到的粗品分別經Biogel P-2凝膠過濾層析柱，得到甘露三糖和甘露四糖純品。本方法為一種快速制備甘露三糖和甘露四糖的方法，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種以綠豆為原料制備甘露三糖和甘露四糖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種以轉化酶進行酶解反應，利用中壓柱層析、B1gel P-2凝膠過濾層析柱，以綠豆為原料制備甘露三糖和甘露四糖的方法。
【背景技術】
[0002]功能性低聚糖是益生元的一種，通常由2-10個單糖分子以糖苷鍵連接而成的低度聚合糖，它的分子量在200-2000之間。益生元的定義為“通過選擇性的增殖一種或少數種菌落中的細菌的生長與活性而對寄主產生有益的影響從而改善寄主健康的不可被消化的食品成分”。因人體腸道內不具備相應的分解消化的酶系統，所以低聚糖本身不能被機體消化吸收，而是直接進入到大腸被大腸菌群利用，具有低熱量、抗齲齒、防治糖尿病、提高免疫力、改善腸道菌落結構等生理作用。主要的功能性低聚糖包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖等。
[0003]棉子糖家族低聚糖(RFOs)是α -低聚半乳糖的重要組成之一，其結構是在蔗糖的葡萄糖殘基一側以α-(1 —6)糖苷鍵連接一個或多個半乳糖分子構成的低聚糖，如三糖的棉籽糖、四糖的水蘇糖、五糖的毛蕊花糖、六糖的筋骨草糖等。甘露三糖(Gala (1 — 6)Gal α (I — 6)Glc)和甘露四糖(Gal α (I — 6) Gal α (I — 6) Gal α (I — 6) Glc)結構與 RFOs的水蘇糖和毛蕊花糖結構相似，分別是在葡萄糖一側以α -(I — 6)糖苷鍵分別連接兩個和三個半乳糖分子。目前關于甘露三糖和甘露四糖的研究較少，也很少在天然產物中發現此類低聚糖。然而研究表明在許多天然植物中含有棉子糖家族低聚糖，尤其是在豆類植物中棉子糖家族低聚糖的含量很高。同時已經發現綠豆中水蘇糖和毛蕊花糖的含量高于其他豆類植物，因此如果能以綠豆為原料酶解棉子糖家族低聚糖上的果糖獲得甘露聚糖，獲得快速大量制備甘露三糖和甘露四糖的方法，將具有廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是以綠豆為原料，通過轉化酶進行快速酶解反應，利用中壓柱層析，B1gelP-2凝膠過濾層析柱，制備得到甘露三糖和甘露四糖純品。包括如下工藝步驟:
[0005](I)選取籽粒飽滿、無蟲害、無缺失的綠豆種子，用粉碎機粉碎，過篩，得到綠豆粉用于磨粉提取。
[0006](2)稱取適量步驟(I)中豆粉于容器中，按一定料液加入乙醇水溶液，恒溫條件下振蕩提取。將提取液離心，收集上清液，下層豆粉重復上述步驟兩次，收集上清液，并將上清液合并。
[0007](3)凍干步驟(2)所得提取物加適量水復溶，加入一定量的轉化酶，55°C下恒溫進行酶解反應。
[0008](4)對步驟(3)中反應前和反應后的水溶性糖組成分別進行HPLC分析，收集反應后的組分過活性炭-硅藻土中壓層析柱進行分離。
[0009](5)步驟(4)所得甘露三糖和甘露四糖粗品過B1gel P_2凝膠過濾層析柱，收集只含有單一組分的部分，真空濃縮，冷凍干燥，分別得到甘露三糖和甘露四糖純品。
[0010](6)步驟(5)所得甘露三糖和甘露四糖的結構鑒定方法為:分離純化得到的甘露三糖和甘露四糖樣品進行ES1-TOF-MS，1H-NMR和13C-NMR和分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為綠豆水溶性糖的HPLC圖
[0012]圖2為酶解反應后溶液的HPLC圖
[0013]圖3為甘露三糖的MS圖譜
[0014]圖4為甘露三糖的1H-NMR圖譜
[0015]圖5為甘露三糖的13C-NMR圖譜
[0016]圖6為甘露四糖的MS圖譜
[0017]圖7為甘露四糖的1H-NMR圖譜
[0018]圖8為甘露四糖的13C-NMR圖譜
【具體實施方式】
[0019]下面通過實施例，對本發明作進一步描述。
[0020]實施例1:
[0021]選取籽粒飽滿的綠豆，用粉碎機粉碎，過60目篩。稱取適量綠豆粉，按料液比I: 10加入80%的乙醇水溶液，于70°C恒溫振蕩器中振蕩提取lh，然后5000轉離心lOmin，收集上清液，下層豆粉按以上條件再次提取，離心收集上清液。將兩次的上清液合并、濃縮和凍干，得到綠豆水溶性糖粗提物。稱取一定量綠豆粗提物溶解于適量的去離子水中，配制成濃度為50mg/ml的糖溶液。以3U/mg綠豆水溶性糖稱取一定量的轉化酶，用pH4.5的醋酸緩沖液溶解。迅速將配制好的轉化酶溶液加入綠豆水溶性糖溶液中，置于55°C水浴中恒溫反應Ih后沸水浴1min滅酶活。將反應后的混合溶液經濾膜過濾，濾液上活性炭-硅藻土(I: D中壓層析柱。層析柱用一系列線性梯度的乙醇溶液(0%?50%)進行洗脫，收集洗脫液，利用HPLC法分析洗脫液的糖組成，合并合適的組分，并經真空濃縮與冷凍干燥，分別制備得到甘露三糖和甘露四糖粗品。將甘露三糖和甘露四糖粗品分別配制為100mg/2ml溶液，分別上B1gel P-2凝膠過濾層析柱。層析柱用超純水進行洗脫，利用HPLC法分析洗脫液的糖含量與組成。選取只含單一組分的收集液進行真空濃縮和冷凍干燥，分別制備得到甘露三糖和甘露四糖純品。
[0022]實施例2:
[0023]選取籽粒飽滿的綠豆，用粉碎機粉碎，過60目篩。稱取適量綠豆粉，按料液比I: 10加入50%的乙醇水溶液，于50°C恒溫振蕩器中振蕩提取lh，然后5000轉離心lOmin，收集上清液，下層豆粉按以上條件再次提取，離心收集上清液。將兩次的上清液合并、濃縮和凍干，得到綠豆水溶性糖粗提物。稱取一定量綠豆粗提物溶解于適量的去離子水中，配制成濃度為100mg/ml的溶液。以3U/mg綠豆水溶性糖稱取一定量的轉化酶，用pH4.5的醋酸緩沖液溶解。迅速將配制好的轉化酶溶液加入綠豆水溶性糖溶液中，置于50°C水浴中恒溫反應Ih后沸水浴1min滅酶活。將反應后的混合溶液經濾膜過濾，濾液上活性炭-硅藻土(I: D中壓層析柱。層析柱用一系列線性梯度的乙醇溶液(0%?40%)進行洗脫，收集洗脫液，利用HPLC法分析洗脫液的糖組成，合并合適的組分，并經真空濃縮與冷凍干燥，分別制備得到甘露三糖和甘露四糖粗品。將甘露三糖和甘露四糖粗品分別配制為100mg/2ml溶液，分別上B1gelP-2凝膠過濾層析柱。層析柱用超純水進行洗脫，利用HPLC法分析洗脫液的糖含量與組成。選取只含單一組分的收集液進行真空濃縮和冷凍干燥，分別制備得到甘露三糖和甘露四糖純品。
[0024]實施例3:
[0025]選取籽粒飽滿的綠豆，用粉碎機粉碎，過60目篩。稱取適量綠豆粉，按料液比I: 12加入50%的乙醇水溶液，于70°C恒溫振蕩器中振蕩提取lh，然后4000轉離心15min，收集上清液，下層豆粉按以上條件再次提取，離心收集上清液。將兩次的上清液合并、濃縮和凍干，得到綠豆水溶性糖粗提物。稱取一定量綠豆粗提物溶解于適量的去離子水中，配制成濃度為200mg/ml的溶液。以3U/mg綠豆水溶性糖稱取一定量的轉化酶，用pH5.5的醋酸緩沖液溶解。迅速將配制好的轉化酶溶液加入綠豆水溶性糖溶液中，置于50°C水浴中恒溫反應Ih后沸水浴1min滅酶活。將反應后的混合溶液經濾膜過濾，濾液上活性炭-硅藻土(I: D中壓層析柱。層析柱用一系列線性梯度的乙醇溶液(0%?50%)進行洗脫，收集洗脫液，利用HPLC法分析洗脫液的糖組成，合并合適的組分，并經真空濃縮與冷凍干燥，分別制備得到甘露三糖和甘露四糖粗品。將甘露三糖和甘露四糖粗品分別配制為150mg/2ml溶液，分別上B1gel P-2凝膠過濾層析柱。層析柱用超純水進行洗脫，利用HPLC法分析洗脫液的糖含量與組成。選取只含單一組分的收集液進行真空濃縮和冷凍干燥，分別制備得到甘露三糖和甘露四糖純品。
[0026]綜上所述僅為本發明的較佳施例而已，并非用來限定本發明的實施范圍。即凡依本發明申請專利范圍的內容所做的等效變化與修飾都應為本發明的技術范疇。
【權利要求】
1.一種以綠豆為原料制備甘露三糖和甘露四糖的方法，其特征在于包括以下操作步驟: (1)選取籽粒飽滿、無蟲害、無缺失的綠豆種子，用粉碎機粉碎，過篩，得到綠豆粉用于水溶性糖的提取。 (2)稱取適量步驟(I)中豆粉于容器中，按一定料液加入乙醇水溶液，恒溫條件下振蕩提取。將提取液離心，收集上清液，下層豆粉重復上述步驟兩次，收集上清液，并將上清液合并。 (3)凍干步驟(2)所得提取物加適量水復溶，加入一定量的轉化酶，55°C下恒溫進行酶解反應。 (4)對步驟(3)中反應前和反應后的水溶性糖組成分別進行HPLC分析，收集反應后的組分過活性炭-硅藻土中壓層析柱進行分離。 (5)步驟(4)所得甘露三糖和甘露四糖粗品過B1gelP-2凝膠過濾層析柱，收集只含有單一組分的部分，真空濃縮，冷凍干燥，分別得到甘露三糖和甘露四糖純品。
2.根據權利要求1所述的制備甘露三糖和甘露四糖的方法，其特征在于步驟(2)中乙醇水溶液濃度為80%，綠豆水溶性糖提取的料液比為1: 10，在70°C下水浴浸提lh。
3.根據權利要求1所述的制備甘露三糖和甘露四糖的方法，其特征在于步驟(3)中轉化酶以PH4.5的醋酸緩沖液配制，濃度為3U/mg綠豆水溶性糖。于55°C水浴反應lh。
【文檔編號】C12P19/00GK104450824SQ201410608110
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】曾曉雄, 戴竹青 申請人:南京農業大學