專利名稱：報告基因小鼠t細胞體外培養分化模型及藥物篩選方法的建立的制作方法
報告基因小鼠T細胞體外培養分化模型及藥物篩選方法的
建立技術領域：
本發明涉及免疫學中T細胞培養分化和藥物篩選技術領域，更具體 地，本發明涉及熒光報告基因小鼠T細胞體外培養分化模型及其藥物篩選平臺的建立方 法，以及利用該方法篩選治療哮喘病的藥物。背景技術：
初始CD4+T細胞在不同的因子誘導下，分化成為功能及表型不同 的效應性Th細胞和調節性T細胞(Treg)，并表達特定的細胞因子執行其功能在IL-12 和anti-IL4作用下向Thl分化，產生IFN-Y等，誘導細胞介導的免疫反應；在IL-4和 anti-IFN-y作用下向Th2分化，產生IL-4等，誘導細胞介導的免疫反應；在IL-6和TGF-旦 作用下向Thl7分化，產生IL-17等，誘導炎癥反應；在TGF-0作用下向Treg分化，產生 IL-10等，實行免疫抑制。T細胞亞群含量和比例及其產生的細胞因子與各種疾病的發生密 切相關，過高或過低都有可能導致疾病的發生。報告細胞因子的熒光報告基因小鼠是轉基因技術的應用，是在T細胞分化后產生 的特定細胞因子(例如Th2分化中IL-4)基因下游連接熒光蛋白編碼序列，使細胞因子的 產生可以被熒光蛋白報告，并能被熒光探測系統檢測到的一種技術。傳統T細胞體外培養分化途徑如下(1)脾細胞的分離與計數；(2)細胞的激活培養；(3)再刺激與抑制蛋白分泌；(4)表面染色與胞內染色檢測分化；T細胞體外培養分化的形態學特征如附圖1所示。傳統T細胞培養分化一般需要4-5天，經激活培養、再刺激、抑制蛋白分泌、胞內染 色(此時產生的大量細胞因子)等步驟檢測是否分化為Th細胞或調節性T細胞(Treg)，其 中再刺激、抑制蛋白分泌、胞內染色等技術是鑒定初始CD4+T細胞是否分化以及分化成為何 種Th或Treg細胞的必要手段。要用到包被好Anti-mouse_CD3和Anti-mouse_CD28的培 養板，以及Golgi-plug、甲醛、Saponin來對細胞行固定打孔，還要使用熒光標記的胞內細 胞因子抗體進行胞內染色。而此過程不僅使篩選藥物變得繁瑣耗時、增加成本費用，也無法 實現高通量篩選。基本步驟如下1、超凈臺內取哺乳動物脾臟、淋巴結，用注射器針芯碾碎過200目金屬濾網，溶解 紅細胞后制成單細胞懸液；2、96 孑L 包被板 Anti-mouse-CD3 (10 u g/ml)禾口 / 或 Anti-mouse_CD28 (1 u g/ml) 中，以2X106個細胞/mL密度、200iU每孔培養于RPMI培養基內，并加入抗體與細胞因子 刺激初始CD4+T細胞分化；3. 48h換液，視細胞密度轉孔，加入新鮮的IL-2 (2ng/mL)刺激1天；4. 72h轉到另外包被好的96孔板再刺激。37°C，2_4h ；5.加 Golgi-plug，37°C 2h ；6.收細胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-mouse-CD4或PE-Anti-mouse-CD4，200倍稀釋(即終濃度1 P g/ml)表面染色，遮光冰浴15min ；7. PBS洗去未結合的抗體，離心、棄上清；8.每管加2%甲醛(in PBS溶液)2mL，室溫固定30min ；9. PBS洗去甲醛，離心、棄上清；10.加入2mL配制好的0. 5% Saponin溶液，輕輕混勻，遮光室溫打孔30min ；11.離心、棄上清，加Saponin buffer 100 y L，胞內染色遮光冰浴30min ；12. Saponin buffer 洗 2 遍，PBS 洗 1 遍；13.每管樣品重懸在0.5mL PBS中，流式細胞儀檢測(表達某種細胞因子的 Tcell)/CD4+T cell 百分率。該種T細胞體外培養分化方法存在的缺點是步驟繁瑣，耗費時間長，難以應用 于藥物高通量篩選。需要的成本較高，Anti-mouse-CD3, Anti-mouse_CD28，Golgi-plug, Saponin—般實驗室難以獲得、且價格昂貴，并非所有實驗室都有這個條件，繁瑣的步驟使 得每組數據的平行性很難控制，并且容易受制于胞內染色技術不成熟，常常得不到好的結^ o
發明內容本發明目的是克服現有技術存在的上述不足，通過熒光報告基因小 鼠T細胞體外培養分化模型及篩選平臺的建立，提供一種省時高效、高通量完成與機體免 疫系統各種細胞因子相關的藥物的篩選方法。本發明提供的T細胞體外培養分化模型及藥物篩選方法，包括如下步驟第一、超凈臺內取熒光報告基因哺乳動物脾臟、淋巴結，浸于1640培養液中，用注 射器針芯碾碎過200目金屬濾網，溶解紅細胞后制成單細胞懸液；第二、96孔板中，以1 X 106—107個細胞/mL密度、200iU每孔培養于RPMI培養基 內；第三、將第二步的96孔板分成實驗組和對照組，并與第四步同時刻或早于第四步 向實驗組加入待篩選藥物，向對照組加入待篩選藥物中使用的溶劑DMS0或H20 ；第四、向第二步的96孔板中加入抗體與細胞因子刺激初始CD4+T細胞分化；第五、48h收取96孔板中細胞，行CD4表面染色后，用流式細胞儀檢測熒光報告基 因EGFP T cell/⑶4+T cell百分率，即分化出的T細胞占總體⑶4+T細胞的比例；第六、與對照組相比，能夠使EGFP T cell/⑶4+T cell百分率有顯著增高或者降 低的藥物為候選藥物，并用藥物劑量效應關系進一步驗證。第一步所述的哺乳動物可以是熒光報告基因小鼠或大鼠。第二步所述的細胞接種密度為2X 106/mL。第三步所述的加入藥物時刻為_lh或Oh。第四步所述的抗體為包被或可溶的Anti-mouse-⑶3 (5 u g/ml)和/或 Anti-mouse-CD28(1u g/ml)。第四步所述的抗體還可以為刀豆蛋白ConA(2. 5ng/ml)。第四步所述的細胞因子為IL-2(2ng/ml)，以及根據要求T細胞分化的方向需要 加入的細胞因子，包括，向Thl分化加入IL-12(5ng/ml)和/或Anti-IL-4 (10ug/ml)；向 Th2 分化加入 IL-4(20ng/ml)和 / 或 Anti-mouse-IFN-Y (10 u g/ml)；向 Treg 分化加入 TGF-beta(5ng/ml)；向 Thl7 分化加入 TGF-beta(5ng/ml)、IL-6 (20ng/ml)、IL-21 (50ng/
4ml)、IL-23(10ng/ml)或 IL-27(20ng/ml)。第五步所述的EGFP T cell為任一熒光標示的Tcell，例如RFP、cy5標示的T cell寸。此外，第一步所述的單細胞懸液系全脾與淋巴結細胞混合，在得到候選藥物后可 以將全脾與淋巴結單細胞懸液行CD44、CD62L表面染色，分選出純度高的初始CD4+T細胞 (⑶44L°wCD62LHight)繼續第二步至第六步驗證。此方法可以通過熒光報告基因檢測熒光蛋白標記細胞因子的產生，篩選影響初始 T細胞分化和細胞因子分泌的小分子藥物。本發明提供的4get小鼠(EGFP可報告Th2分化中IL-4的產生)T細胞體外培養 分化模型及藥物篩選方法的具體步驟如下(1)超凈臺內取4get小鼠脾臟、淋巴結浸于RPMI1640培養液中，以注射器針芯碾 碎過200目金屬濾網，溶解紅細胞后制成單細胞懸液；(2)96孔板中(無需包被)，以2X 106個細胞/mL密度、200 yl每孔培養 于 RPMI 培養基內，并加入 conA(2. 5ii g/ml)、IL-2 (2ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和或 Anti-mouse-IFN- y (10 u g/ml)刺激初始 CD4+T 細胞向 Th2 分化；(3)同時刻，96孔板各孔中加入藥物(即0小時加藥)實驗組加入待篩選藥物， 設立對照組加入待篩選藥物溶解過程使用的溶劑DMS0或H20 ；(4) 48h收每孔細胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-mouse-CD4(0. 2mg/ml)表面染 色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未結合的抗體，離心、棄上清；(6)每管樣品重懸在0. 5mL PBS中，流式細胞儀檢測EGFP T cell/CD4+T cell百 分率。此方法可以通過檢測EGFP標記的IL-4，篩選影響初始T細胞向Th2分化和調節 IL-4分泌的小分子藥物，由于該模型產生的IL-4是介導哮喘疾病發生的主要細胞因子，與 人類的哮喘病發病機理相似，故可應用于篩選治療哮喘病藥物。本發明的優點和積極效果本發明與傳統T細胞體外培養分化的方法比較具有如下優點1、極大地節省了時間、工作量。48h既能完成上百種藥物的篩選，縮短了時間；該 方法應用簡單，并且不需要復雜的包板再刺激與胞內染色，大大節省了勞動量。2、降低成本。由于應用熒光報告基因小鼠及可溶性抗體(無需包板)，省略了包 板、再刺激、胞內染色等繁瑣步驟，節省了昂貴的包板抗體與胞內熒光染色抗體。3、確保高通量篩選平臺的建立。由于應用了可溶性抗體(ConA)以及不需要人工 的包板、轉孔、換液等步驟，可以達到計算機控制的自動化水平，現有的多種類熒光報告基 因小鼠可以確保高通量藥物篩選平臺的建立。4、結果準確。采用熒光報告基因小鼠，化合物的藥效結果可以通過光學強度的改 變表現出來，避免了因胞內染色技術不成熟導致的實驗結果不穩定或失敗，是國際前沿的 高通量篩選體系。5、應用廣泛。機體免疫功能的改變直接與體系的熒光強度相連，這些重要的免疫 過程與很多重大疾病相關，包括各種癌癥，糖尿病，病毒感染，自身免疫疾病紅斑狼瘡，類風
5濕性關節炎等。我們的篩選模型可以用于廣泛疾病的新藥篩選。
圖1是初始T細胞培養向Th2分化示意圖，圖1 (a) Oh初始T細胞培養，細胞相對 圓而小；圖l(b)24h T細胞培養及向Th2分化情況，細胞出現變形；圖l(c)48h T細胞培養 及向Th2分化情況，更多細胞發生變形，并有明顯集落形成；放大倍數40X10 ；黑色箭頭 激活的T細胞形成的集落。圖l(d)T細胞體外培養48h向Th2分化流式散點圖，經流式細 胞儀檢測對照組(不加藥物)EGFP T細胞/CD4+T細胞百分率為59%。圖2、圖3、圖4是實施例1示意圖，從1-8號藥物中初步篩選出4號藥物可抑制 初始T細胞向Th2分化。圖2 1-8號藥物結構式；圖3 初篩(a)加入藥物溶劑DMS0對照 組，(b)-(i)加入1-8號藥物組；(j)結果統計，流式細胞儀檢測加入4號藥物組EGFP T細 胞/CD4+T細胞百分率為22% ；圖4-1藥物劑量效應關系(a)-(l)0h施加不同濃度4號藥 物，48h后初始T細胞向Th2分化情況；每排為一個濃度梯度的三次重復，濃度如圖中標出； 圖4-2(m)結果統計，誤差線為三次獨立重復實驗的標準差；與DMSO control比較，g/ml 濃度下4號藥物具有顯著的抑制Th2分化作用，EGFP T細胞/⑶4+T細胞百分率為22. 37% (以 control 為 100% )p < 0. 01 ；圖5、圖6是實施例2示意圖，從1-81種天然提取物中初步篩選出27、29號小分子 化合物可抑制初始T細胞向Th2分化過程中IL-4細胞因子的產生。圖5 初篩(a)Rl畫門 在淋巴細胞；(b)R2畫門在CD4+T細胞；(c)加入藥物溶劑DMS0對照組，(d)-(g)加入26-29 號藥物組(散點圖顯示為R1&R2門)；(h)結果統計，流式細胞儀檢測加入27，29號藥物組 EGFP T細胞/CD4+T細胞百分率分別為38%、13% (以control為100% )；圖6_1藥物劑 量效應關系(a)-(n)號，圖6-2藥物劑量效應關系(o)-(w)號及結果統計(X)，其中，(a)Rl 畫門在淋巴細胞；(b)R2畫門在CD4+T細胞；(c)-(e)加入藥物溶劑DMS0對照組，(f)-(w)0h 施加不同濃度27、29號藥物，48h后初始T細胞向Th2分化情況；每排為一個濃度梯度的三 次重復，藥物及濃度如圖左所示；圖(x)結果統計，誤差線為三次獨立重復實驗的標準差； 與DMSO control比較，10nmol/ml濃度下29號藥物具有顯著的抑制Th2分化作用，EGFP T 細胞 /CD4+T 細胞百分率為 21. 64% (以 control 為 100% ), p < 0. 01 ；。
具體實施方式實施例1 應用4get小鼠從1-8號藥物中初步篩選出4號藥物可抑制初始T細胞向Th2分 化過程中IL-4細胞因子的產生(1)超凈臺內取4get小鼠脾臟、淋巴結浸于1640培養液中，以注射器針芯碾碎過 200目金屬濾網，溶解紅細胞后制成單細胞懸液；(2)96孔板中(無需包被)，以2\106個細胞/1^密度、200111每孔培養于1 ^1 培養基內，并加入 conA(2. 5ii g/ml)與 IL-2 (2ng/ml)、IL-4 (20ng/ml)刺激初始 CD4+T 細胞 向Th2分化；(3)同時刻，96孔板各孔中加入藥物(即0小時加藥)實驗組加入待篩選1-8號 藥物結構式見圖2 (1-8)，終濃度1 y g/ml，對照組加入待篩選藥物溶劑DMS0 ；(4)48h收每孔細胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-m0uSe-CD4(終濃度1 y g/ml)表面染色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未結合的抗體，離心、棄上清；(6)每管樣品重懸在0. 5mL PBS中，流式細胞儀檢測EGFP T cell/⑶4+T cell百分 率。結果如圖3(a)-(i)，4號藥物可顯著降低EGFP T cell/⑶4+T cell百分率如圖3 (j)。(7)為進一步驗證4號藥物的抑制作用，于T細胞體外培養分化0小時加入不同濃 度的4號藥物實驗組加入4號藥物濃度分別為0. 1 u g/mlUu g/ml、5ii g/ml，每濃度設三 個重復，對照組加入待篩選藥物溶劑DMS0 ；48h檢測EGFP T cell/⑶4+Tcell百分率，4號藥 物濃度在5 u g/ml時可顯著抑制IL-4產生見圖4(m)。實施例2應用4get小鼠從1-81種天然提取物中初步篩選出27、29號小分子化合物可抑制 初始T細胞向Th2分化過程中IL-4細胞因子的產生(1)超凈臺內取4get小鼠脾臟、淋巴結浸于1640培養液中，以注射器針芯碾碎過 200目金屬濾網，溶解紅細胞后制成單細胞懸液；(2)96孔板中(無需包被)，以2\106個細胞/1^密度、200111每孔培養于1 ^1 培養基內，并加入 conA(2. 5ii g/ml)與 IL-2 (2ng/ml)、IL-4 (20ng/ml)刺激初始 CD4+T 細胞 向Th2分化；(3)同時刻，96孔板各孔中加入藥物(即0小時加藥)實驗組加入待篩選1-81種 天然提取物(終濃度lOnmol/ml)，對照組加入待篩選藥物溶劑DMS0或H20 ；(4)48h收每孔細胞于流式管，熒光抗體APC-Anti-m0uSe-CD4(終濃度1 y g/ml)表 面染色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未結合的抗體，離心、棄上清；(6)每管樣品重懸在0. 5mL PBS中，流式細胞儀檢測EGFP T cell/CD4+T cell百 分率。其中加入27、29號小分子化合物組EGFP T cell/CD4+T cell百分率分別為38%、 13% (以control為100% )見圖5(h)，僅附1_81種天然提取物中四種化合物的檢測結果。(7)藥物劑量效應關系為進一步驗證初篩結果(即27、29號小分子化合物的抑 制作用)，于T細胞體外培養分化Oh加入不同濃度的27、29號小分子化合物三個濃度梯 度分別為0. lnmol/ml、lnmol/ml、lOnmol/ml，每濃度設三個重復，對照組加入待篩選藥物溶 劑DMS0 ;48h檢測EGFP T cell/CD4+T cell百分率，29號小分子化合物濃度在lOnmol/ml 時可顯著抑制IL-4產生見圖6 (x)。
權利要求
一種報告基因小鼠T細胞體外培養分化模型及藥物篩選的方法，其特征在于該方法包括如下步驟第一、超凈臺內取熒光報告基因哺乳動物脾臟、淋巴結，浸入1640培養基，用注射器針芯碾碎過200目金屬濾網，溶解紅細胞后制成單細胞懸液；第二、96孔板中，以1×106--107個細胞/mL密度、200μl每孔培養于RPMI培養基內；第三、將第二步的96孔板分成實驗組和對照組，并與第四步同時刻或早于第四步向實驗組加入待篩選藥物，向對照組加入待篩選藥物中使用的溶劑DMSO或H2O；第四、向第二步的96孔板中加入抗體與細胞因子刺激初始CD4+T細胞分化；第五、48h收取96孔板中細胞，行CD4表面染色后，用流式細胞儀檢測分化出的T細胞占總體CD4+T細胞的比例，即EGFPT cell/CD4+T cell百分率；第六、與對照組相比，能夠使EGFP T cell/CD4+T cell百分率有顯著增高或者降低的藥物為候選藥物，并用藥物劑量效應關系進一步驗證。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的哺乳動物是熒光報告基因小鼠 或大鼠。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于第二步所述的細胞接種密度為2X106/mL。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于第三步所述的加入藥物時刻為-Ih或Oh。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗體為包被或可溶的濃度為 5 μ g/ml 的 Anti-mouse-CD3 禾口 / 或濃度為 1 μ g/ml 的 Anti-mouse_CD28。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗體為刀豆蛋白濃度為2.5ng/ ml 的 ConA0
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的細胞因子為2ng/mlIL-2， 以及根據要求T細胞分化的方向需要加入的細胞因子，包括，向Thl分化加入5ng/ ml IL-12 禾口 / 或 10ug/ml Anti-IL-4 ；向 Th2 分化力口 入 20ng/ml IL-4 禾口 / 或 10 μ g/ ml Anti-mouse-IFN-y ；向 Treg 分化力口入 5ng/ml TGF—beta ；向 Thl7 分化力口入 5ng/ml TGF-beta、20ng/ml IL_6、50ng/ml IL-21、10ng/ml IL-23 或 20ng/ml IL-27。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFPT cell為任一熒光標示 的 T cell。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFPT cell為RFP或cy5標 示的T cell。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的單細胞懸液含有全脾與淋巴 結細胞混合，在得到候選藥物后可以將全脾與淋巴結單細胞懸液行CD44、CD62L表面染色， 分選出純度高的⑶初始⑶4+T細胞繼續第二步至第六步驗證。
全文摘要
一種熒光報告基因小鼠T細胞體外培養分化模型及藥物篩選方法，以及利用4get(IL-4/GFP-enhanced transcript)小鼠篩選治療哮喘病藥物的具體方法，包括T細胞體外培養分化、同時刻藥物高通量篩選及流式細胞儀檢測。本發明中的T細胞體外培養分化與藥物篩選分別涉及免疫學與化學生物學領域，應用特有的熒光報告基因小鼠在T細胞分化過程中可指示特定細胞因子的產生，具備高通量篩選小分子藥物及天然產物提取物的能力。基于該模型的藥物篩選平臺可用于篩選新藥，以及開發一批對機體免疫反應和對T細胞分化、重要細胞因子分泌具有調控作用的藥物。
文檔編號C12Q1/02GK101851657SQ20101013884
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月6日 優先權日2010年4月6日 公開號201010138847.8
發明者劉蘭珍, 尹芝南, 張寶童, 溫倜, 王璞玥, 趙立青, 陳曦 申請人:南開大學