一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法
【專利摘要】本發明公開了一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法，包括樹脂切片的制作、切片的染色、圖像的采集、圖像的前處理和細胞的形態學分析等步驟；圖像的前處理利用Photoshop軟件的鋼筆工具對種子細胞的輪廓進行精確的勾勒和描邊。本發明不僅可以用來分析胚乳細胞的形態學特征，還可以進一步分析胚乳細胞內容物(淀粉和蛋白)的特性。通過Photoshop和Image-Pro Plus軟件在原位對胚乳細胞進行精確地處理和分析，極大地減少了誤差，并可以實現大批量、全自動的分析。本發明克服了常規方法會造成細胞損失、分析結果不準確等缺點，為谷物的育種、加工和利用提供理論依據，對提高種子的品質和產量具有重要的意義。
【專利說明】一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及植物種子檢測【技術領域】，特別是涉及一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法。

【背景技術】
[0002]水稻、小麥、玉米等谷類作物的種子是人類糧食、牲畜飼料和工業原料的主要來源。胚乳細胞是谷物種子的重要組成部分，它的發育和充實狀況決定著種子的重量(粒重)與品質。谷物種子的粒重與胚乳細胞的數目具有顯著的相關性，胚乳細胞數目的增加導致粒重的增加。谷物種子的粒形(粒長、粒寬、粒厚)受胚乳細胞的數目、長度、寬度等形態學特征的影響。因此，對胚乳細胞的形態學特征進行分析，能夠從細胞學角度研究谷物種子的發育和充實，進而闡明導致種子品質發生差異的細胞學原因，為谷物的育種、加工和利用提供理論依據，對提高種子的品質和產量具有重要的意義。
[0003]目前，對谷物種子胚乳細胞的研究主要采用以下2種方法進行:①利用纖維素酶分解胚乳細胞壁，將胚乳細胞分離開再進行分析；②利用切片技術將胚乳細胞切開，再通過染色技術顯示出胚乳細胞的輪廓以及內容物后分析。其中，方法①存在較大的弊端:a)纖維素酶分解胚乳細胞壁的操作較復雜，對酶濃度以及酶解時間的要求非常嚴格，濃度過高、時間過長將導致細胞壁被破壞，而濃度過低、時間過短將導致胚乳細胞分離不充分，最終導致胚乳細胞的分析不準確山)纖維素酶分解胚乳細胞的過程容易造成細胞的損失，最終導致胚乳細胞數目的統計不準確；c)分離的胚乳細胞是混合物，無法準確定位胚乳不同部位胚乳細胞的形態學特征；d)無法分析胚乳細胞內容物(淀粉和蛋白)的特性。而方法②很好地解決了方法①的諸多弊端，但仍存在缺陷:a)染色后細胞的輪廓不夠清晰，造成分析的困難；b)分析的手段單一、過程復雜，耗費大量時間，且精確度較低；c)無法大批量分析，且分析的形態學特征太少。
[0004]目前，已有不少生命科學領域的學者利用各種專業軟件對顯微物體的形態學特征進行了分析，如:①用Smileview對淀粉體和蛋白體進行手動測量；②用Image J軟件分析水稻淀粉粒的幾何特性、測量肝臟體積；③用PractiStat軟件分析小麥大、小淀粉粒的軸長；④用Photoshop和Image-Pro Plus軟件分析小麥胚乳淀粉粒的幾何特性等。其中前三種方法操作復雜，隨意性較大，導致誤差很大；而第④種方法先采用了 Photoshop軟件的“魔棒”和“橡皮擦”工具對淀粉粒進行摳圖和著色，再利用Image-P1 Plus軟件的“count/size”工具對所有上色淀粉粒進行精確的分析，相比前三種方法，極大地簡化了操作步驟，并能批量化分析目標的形態學特征，操作簡便，結果精確。但第④種方法依舊存在以下缺陷:a)Photoshop軟件的“魔棒”工具只適用于如淀粉粒、蛋白體等單一、均質的目標，不適用于內含許多異質內容物的目標，比如內含大量蛋白體、淀粉粒的谷物胚乳細胞；b)Photoshop軟件的“魔棒”工具和“橡皮擦”工具只適用于數量較少且較分散的目標，因為當目標數量很多并且分布很緊湊時，“魔棒”工具就無法快速的將每個目標區分開，需要借助其他工具(如“套索”工具)區分目標，同時該工具選中的區域為選區，無法進行保存，必須一次性處理完所有目標；c)著色過程太復雜，必須借助“橡皮擦”工具對每一個目標的邊緣進行精確地處理，工作量依舊很大?，F有的技術方法已不能滿足分析谷物種子胚乳細胞的形態學特征，因為:①谷物種子的胚乳細胞相互間緊挨著，且內含大量蛋白體和淀粉粒，“魔棒”工具無法準確勾勒細胞的輪廓若采用“套索”工具進行勾勒，則需要對每個細胞進行描邊和著色，谷物種子的胚乳細胞數量眾多，工作量巨大；③著色操作需要借助“橡皮擦”工具對每一個目標的邊緣進行精確地處理，操作較繁瑣。因此，需要亟需對現有的胚乳細胞形態學分析方法進行改良和優化，發明一種谷物種子細胞的形態學分析方法。
經過長時間的摸索，我們利用Photoshop軟件的“鋼筆工具”對胚乳細胞的顯微圖片進行簡便、快捷、精確的前處理，生成細胞輪廓清晰、反差明顯的圖片，再運用Image-Ρ-- Plus軟件對細胞進行精確的分析，形成了一套行之有效的分析方法，很好的彌補了現有方法的缺陷。


【發明內容】

[0005]為了克服現有胚乳細胞形態學分析方法的不足，本發明提供了一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法。
[0006]本發明所采用的技術方案如下:
[0007]—種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法，包括以下步驟:
(I)樹脂切片的制作:
[0008]①取材和固定:采集谷物的種子，小心取出完整穎果，浸泡在4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中24h ；
[0009]②漂洗和脫水:用0.1M磷酸緩沖液充分漂洗固定后的穎果，再用30% -50% -70% -90% -100% -100%乙醇對穎果逐級脫水，每級15min ；
[0010]③樹脂滲透、包埋和聚合:用25% -50% -75% -100% -100%倫敦白膠樹脂對穎果逐級滲透，每級12h，再將滲透完的穎果放于包埋模具內，注入純樹脂，將包埋模具放在烘箱內，60°C聚合1-2天，使樹脂硬化；
[0011]④修塊和半薄切片:對包埋塊進行手工修塊，削去穎果周圍多余樹脂，用超薄切片機切厚度為2微米的切片，將切片轉移到載玻片上的水滴上，將載玻片放在45°C加熱板上干燥，使切片展平；
[0012](2)切片的染色:用碘液、番紅-甲基紫染液或熒光增白劑染液對展平的切片染色,通過對細胞內容物的染色反襯出細胞輪廓或直接對細胞壁進行染色顯示細胞輪廓；
[0013](3)圖像的采集:在光學顯微鏡下拍攝切片上胚乳細胞的形態結構，保存圖片:
[0014]①當使用碘液或番紅-甲基紫染液進行染色時，采用正常光模式進行拍攝；
[0015]②當使用熒光增白劑染液進行染色時，采用熒光模式進行拍攝；
[0016](4)圖像的前處理:用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，利用鋼筆工具對種子細胞的輪廓進行精確的勾勒，再用畫筆工具對路徑進行描邊，保存圖片；
[0017](5)細胞的形態學分析:用Image-Pro Plus軟件打開前處理的圖片,利用“Count/Size”工具對胚乳細胞進行形態學分析，導出分析的形態學特征。
本發明的步驟(4)中，所述圖像的前處理具體操作如下:
①用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，用“矩形選框工具”選出待分析的區域，點選菜單欄的“編輯”-“拷貝”，再點選“文件”-“新建”，彈出的對話框中將分辨率改為“300”，背景內容改為“背景色”，點擊“確定”新建一個像素與待分析的區域相同的畫布(背景為黑色)；
②點選菜單欄的“編輯“粘貼”，將待分析的區域復制到新畫布上；
③選擇“鋼筆工具”，逐一對細胞壁進行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒；
④打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標”，輸入路徑名稱，點擊“確定”保存路徑；
⑤選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“4”像素，“硬度”改為“100%”；
⑥選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，待分析區域清晰地顯示出胚乳細胞的輪廓；
⑦在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復制圖層”，點擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，顯示出背景為黑色，細胞輪廓為白色的圖像；
⑧點選菜單欄的“文件“存儲為”，保存為TIF格式的無損圖片。
[0018]與現有胚乳細胞形態學分析方法相比，本發明的優勢在于:
[0019](I)建立了適用于多種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法。
[0020](2)聯合運用樹脂切片、染色、顯微拍照、軟件處理和分析技術，對谷物種子胚乳細胞進行原位的形態學分析，直觀簡便，定位準確，結果可靠，不僅可以比較不同品種谷物種子胚乳細胞的形態學差異，還可以比較同一品種谷物種子不同部位胚乳細胞的形態學特征。
[0021](3)不僅可以用來分析胚乳細胞的形態學特征，還可以進一步分析胚乳細胞內容物(淀粉、蛋白)的特性。
[0022](4)通過Photoshop軟件的鋼筆工具在原位對細胞輪廓進行精確地勾勒和描邊，克服了“魔棒”、“套索”、“橡皮擦”工具的缺陷，極大地減少了誤差，簡化了操作，節省了大量分析時間。
[0023](5)通過Image-Pro Plus軟件的“count/size”工具可以大批量、全自動的分析大量胚乳細胞的形態學特征，操作簡便，結果精準，可信度高，應用前景寬廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為碘染色水稻種子切片的顯微照片；
[0025]圖2為用Photoshop軟件處理圖1后生成的圖片，顯示清晰的細胞壁輪廓；
[0026]圖3為用Photoshop軟件處理圖2后生成的圖片，背景為黑色，細胞壁輪廓為白色；
[0027]圖4為用Image-Pro Plus軟件分析圖3后生成的圖片，顯示了參與計算的細胞編號;
[0028]圖5為Image-Pro Plus軟件分析圖3后獲得的形態學特征結果圖。
[0029]圖6為熒光增白劑染色小麥種子切片的顯微照片；
[0030]圖7為用Photoshop軟件處理圖6后生成的圖片，顯示清晰的細胞壁輪廓；
[0031]圖8為用Photoshop軟件處理圖7后生成的圖片，背景為黑色,細胞壁輪廓為白色；
[0032]圖9為用Image-Pro Plus軟件分析圖8后生成的圖片，顯示了參與計算的細胞編號;
[0033]圖10為Image-Pro Plus軟件分析圖8后獲得的形態學特征結果圖。
[0034]圖11為番紅-甲基紫染色玉米種子切片的顯微照片；
[0035]圖12為用Photoshop軟件處理圖11后生成的圖片，顯示清晰的細胞壁輪廓；
[0036]圖13為用Photoshop軟件處理圖12后生成的圖片，背景為黑色，細胞壁輪廓為白色；
[0037]圖14為用Image-Pro Plus軟件分析圖13后生成的圖片，顯示了參與計算的細胞編號;
[0038]圖15為Image-Pro Plus軟件分析圖13后獲得的形態學特征結果圖。

【具體實施方式】
[0039]下面結合實施例對本發明作詳細說明。
[0040]實施例一:水稻種子胚乳細胞的形態學分析
[0041]1.樹脂切片的制作:
[0042](I)取材和固定:
[0043]①配制0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4):
[0044]a)母液A (0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液):稱取71.64g Na2HPO4.12 H2O,用蒸餾水定容至100mL ；
[0045]b)母液B (0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液):稱取31.21g NaH2PO4.2 H2O,用蒸餾水定容至100mL ；
[0046]c)按照A液:B液=81:19的比例混合，用A液或B液調節pH至7.4。
[0047]②配制10%多聚甲醛水溶液:
[0048]a)稱取20g多聚甲醒于250mL三角錐形瓶中，加入200mL蒸懼水,放入25*9mm規格的磁力攪拌子；
[0049]c)配制0.lmol/L氫氧化鈉水溶液:稱取40mg氫氧化鈉于1mL離心管中，加入1mL蒸餾水，混合均勻；配制0.lmol/L鹽酸水溶液:量取4.2mL質量分數為36.5%的濃鹽酸，用蒸懼水定容至500mL ；
[0050]d)向錐形瓶中逐滴滴加0.lmol/L氫氧化鈉水溶液至多聚甲醛水溶液恰好澄清；
[0051]e)冷卻至室溫,調節pH至7.4。
[0052]③配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:100mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH7.4) +80mL 10%多聚甲醛水溶液+20mL 25%戊二醛水溶液(國藥集團，FEM進口分裝)充分混勻，用氫氧化鈉或鹽酸水溶液調節pH至7.4。
[0053]④從稻穗上取下水稻種子，用解剖針小心剝去穎殼，取出完整穎果，挑選粒形正常的穎果放于青霉素瓶中，迅速往青霉素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，使穎果浸泡在固定液中，放于4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0054]⑤用鑷子取出穎果，用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部1_厚的組織塊，再次浸泡于青霉素瓶中的固定液中，放于4°C冰箱中固定48h，使組織和細胞充分固定。
[0055](2)漂洗和脫水:
[0056]①配制0.lmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4): 10mL 0.2mol/L磷酸緩沖液+10mL蒸懼水，充分混勻。
[0057]②用干凈的吸管小心吸去固定液，不要碰到穎果斷面，再用0.lmol/L磷酸緩沖液漂洗固定后的穎果，共漂洗5次,每次30min,充分洗去固定液。
[0058]③配制濃度為30 %,50 %,70 %和90 %的乙醇水溶液，按照30% -50% -70% -90% -100% -100%的梯度對穎果逐級脫水:每級 1mLjj^K 15min。
[0059](3)樹脂滲透、包埋和聚合:
[0060]①配制倫敦白膠(LR White)樹脂:量取40mL樹脂于50mL離心管中，稱取0.8g催化劑(Benzoyl Peroxide)倒入離心管中,磁力攪拌20min使充分溶解,放于4°C冰箱24h后使用；
[0061]②配制濃度為25%、50%和75%的樹脂乙醇溶液:樹脂和無水乙醇按照1:3、1:1和3:1的比例混配而成；
[0062]③按照25% -50% -75% -100% -100 %的梯度對穎果逐級滲透:每級5mL，放于4°C冰箱，滲透12h。
[0063]④用鑷子輕輕夾住穎果側面，將橫斷面朝下放于包埋模具內，用200mL移液槍緩慢注入純樹脂浸沒穎果，避免出現氣泡。
[0064]⑤將包埋模具放在烘箱內，60°C聚合1-2天(時間必須控制在2天之內，防止引起樹脂皺縮，導致切片困難)，使樹脂硬化。
[0065](4)修塊和半薄切片:
[0066]①先用銼刀將樣品表面包埋劑磨去，露出穎果；
[0067]②然后將包埋塊夾在切片機的樣品夾上，頂端露出2_，在體視顯微鏡下用鋒利的刀片在穎果的四周以和水平面成45°的角削去包埋劑，其側面修成錐形體，樣品的正面修成上下邊平行的六邊形；
[0068]③安裝玻璃刀，放在刀夾中夾緊；
[0069]④調整好包埋塊和玻璃刀的位置，在體視鏡下對刀，使刀鋒和樣品面對齊:
[0070]a)打開底部的背光燈，關閉其他照明燈，進刀使樣品面與刀鋒靠近，可以看見樣品面上出現一個亮條，利用這個亮條判斷樣品與刀是否對齊；
[0071]b)先調整樣品面上下兩條邊與刀鋒平行:觀察亮條的上下兩條邊是否平行，若不平行，則調整樣品夾旋轉旋鈕，使其平行；
[0072]c)再調整樣品面的左右與刀鋒平行:觀察亮條的左右兩條邊是否等長，若不等長，則調整刀鋒旋轉旋鈕，使其相等；
[0073]d)最后調整樣品面的上下與刀鋒平行:上下移動樣品面，觀察亮條左右兩條邊的長度是否變化，若有變化，則調整樣品面旋轉旋鈕，使其長度不變；
[0074]⑤對刀完成后，進刀使刀鋒與樣品接近，樣品面下緣與刀鋒等高，轉動樣品臂升降鈕使樣品臂上下運動，使刀鋒剛好切到組織為止；
[0075]⑥切片厚度設為2微米，進行手動切片:右手緩慢轉動樣品臂升降鈕開始切片，在切片的整個過程中，包埋塊的正面勻速、緩慢地下移，玻璃刀鋒逐漸切下切片，左手拿睫毛筆輕輕放在切片前端邊緣的正上方，防止其卷曲，此過程要始終保持穩定，防止睫毛碰到刀鋒或戳破切片；
[0076]⑦取干凈的載玻片，滴加蒸餾水，用鑷子小心夾住切片邊緣，將切片以和水平面成45 °角輕輕放在水滴上,45 V加熱板上干燥,使切片展平。
[0077]⑧將切片放于烘箱中，60°C烘12h，防止染色過程中脫片。
[0078]2.切片的染色:
[0079](I)碘液配制:5g碘+1g碘化鉀+85mL蒸餾水，完全溶解后用50%甘油稀釋80倍作為染液。
[0080](2)碘染色:滴加碘液后避光靜置lOmin，用蓋玻片封片后顯微鏡下觀察；
[0081]3.圖像的采集:用Olympus BX53顯微鏡的正常光模式觀察胚乳細胞的顯微結構，用附帶的CCD進行拍照，獲得顯微圖片I。
[0082]4.圖像的前處理:
[0083](I)用Photoshop軟件打開拍攝的圖片1，用“矩形選框工具”選出待分析的區域，點選菜單欄的“編輯“拷貝”，再點選“文件“新建”，彈出的對話框中將分辨率改為“300”，背景內容改為“背景色”，點擊“確定”新建一個像素與待分析的區域相同的畫布(背景為黑色)；
[0084](2)點選菜單欄的“編輯“粘貼”，將待分析的區域復制到新畫布上；
[0085](3)選擇“鋼筆工具”，逐一對細胞壁進行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒；
[0086](4)打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標”，輸入路徑名稱，點擊“確定”保存路徑；
[0087](5)選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“4”像素，“硬度”改為“100%，，；
[0088](6)選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，待分析區域清晰地顯示出胚乳細胞的輪廓，如圖2 ；
[0089](7)在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復制圖層”，點擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，顯示出背景為黑色，細胞輪廓為白色的圖像，如圖3 ；
[0090](8)點選菜單欄的“文件“存儲為”，保存為TIF格式的無損圖片。
[0091]5.細胞的形態學分析:
[0092](I)標尺的設定:
[0093]①用Image-Pro Plus軟件打開Cl型測微尺圖片，點選菜單欄的“Measure”-“Calibrat1n” - “Spatial ”,在彈出的窗口中點選“New”新建標尺,在上方的“Name” 一欄下的“spatial cal O”處點一下，輸入標尺名“ 10X” ;
[0094]②“Unit”一欄選擇“ μ m” 作為單位，勾選 “convert when change unit”；
[0095]③點選“Units/pixel” 一欄中的“Image”,彈出“scaling”對話框，同時在標尺圖片左上角顯出一個標尺，將鼠標移到這個標尺的橫杠上，點一下左鍵，光標就立即變成了小手，就用這個小手把標尺拖下來，再將小手依次移到移到橫杠的左右兩端，利用“放大鏡”工具，用左鍵拖這兩個端點到圖片兩邊的標尺該線處，在“scaling”對話框中填上標尺長度，點擊“0K”關閉對話框。
[0096](2)定義標尺:點選菜單欄的 “Measure” - “Calibrat1n”- “Select Spatial”，在彈出的窗口中點選新建的“ 10X”標尺。
[0097](3)形態學分析:
[0098]①點選菜單欄的“Measure” - “count/size”,彈出 “count/size” 對話框；
[0099]②點選對話框菜單欄的“Measure” - “Select Measurements”，彈出“Select Measurements"對話框，點選所需測量的參數，這里我們選擇“Area(面積)”、“Roundness (圓度)” “Size (length)(長軸長度)”和 “Size (width)(短軸長度)”，點擊“0K” 返回 “count/size” 對話框；
[0100]③點選“AutomaticDark 0bjects”，勾上“Measure 0bjects”、“Apply FilterRanges”和“Display 0bjects”復選框，點擊“Count”按鈕完成參數的計算，圖片上將顯示參與計算的每個細胞標號，如圖4 ；
[0101]④點選對話框菜單欄的“View”- “Measurement Data”,獲得胚乳細胞形態學特征的統計數據，如圖5。其中面積單位為μ m2，圓度單位為μ m2/μ m2，長度單位為μπι。
[0102]⑤各參數的含義:
[0103]a) “Area”:表示測量對象的面積；
[0104]b) “Roundness”:表示對象的圓度,計算公式=(周長2)/(4* π *面積);圓物體的圓度為1，其它形狀圓度大于I ;
[0105]c) iiSize(Iength) ”:表示對象沿主軸(長軸)方向的對象投影輪廓兩邊界平行線間的距離直徑；
[0106]d) "Size(width) ”:表示對象沿副軸(短軸)方向的對象投影輪廓兩邊界平行線間的距離直徑。
[0107]實施例二:小麥種子胚乳細胞的形態學分析
[0108]1.樹脂切片的制作:
[0109](I)取材和固定:
[0110]①配制0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4):方法同實施例一。
[0111]②配制10%多聚甲醛水溶液:方法同實施例一。
[0112]③配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:方法同實施例一。
[0113]④從麥穗上取下小麥種子，用解剖針小心剝去穎殼，取出完整穎果，挑選粒形正常的穎果放于青霉素瓶中，迅速往青霉素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，使穎果浸泡在固定液中，放于4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0114]⑤用鑷子取出穎果，用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部1_厚的組織塊，再次浸泡于青霉素瓶中的固定液中，放于4°C冰箱中固定48h，使組織和細胞充分固定。
[0115](2)漂洗和脫水:方法同實施例一。
[0116](3)樹脂滲透、包埋和聚合:方法同實施例一。
[0117](4)修塊和半薄切片:方法同實施例一。
[0118]2.切片的染色:
[0119](I)熒光增白劑染液配制:1mg熒光增白劑+ImL 7jC，充分混勻溶解后稀釋10倍作為染液。
[0120](2)熒光增白劑染色:
[0121]①切片放于加熱板上加熱至55°C ;
[0122]②滴加熒光增白劑染液染色1min ;
[0123]③水洗lOmin，加熱板上烘干后顯微鏡下觀察。
[0124]3.圖像的采集:用Olympus BX51顯微鏡的突光模式觀察胚乳細胞的顯微結構,用附帶的CCD進行拍照，獲得細胞的顯微圖片6。
[0125]4.圖像的前處理:方法同實施例一，獲得圖片7和8。
[0126]5.細胞的形態學分析:方法同實施例一,獲得圖片9和10。
[0127]實施例三:玉米種子胚乳細胞的形態學分析
[0128]1.樹脂切片的制作:
[0129](I)取材和固定:
[0130]①配制0.2mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4):方法同實施例一。
[0131]②配制10%多聚甲醛水溶液:方法同實施例一。
[0132]③配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:方法同實施例一。
[0133]④從玉米棒上取下玉米種子，挑選粒形正常的穎果放于青霉素瓶中，迅速往青霉素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，使穎果浸泡在固定液中，放于4°C冰箱中固定12h，使穎果軟化和初步固定；
[0134]⑤用鑷子取出穎果，用鋒利的刀片將軟化的穎果從中部橫斷開，切取穎果中部Imm厚的組織塊，再次浸泡于青霉素瓶中的固定液中，放于4°C冰箱中固定48h，使組織和細胞充分固定。
[0135](2)漂洗和脫水:方法同實施例一。
[0136](3)樹脂滲透、包埋和聚合:方法同實施例一。
[0137](4)修塊和半薄切片:方法同實施例一。
[0138]2.切片的染色:
[0139](I)番紅-甲基紫染液配制:
[0140]①番紅染液:Ig番紅+1mL 95%乙醇溶解，再定容至10mL ；
[0141]②甲基紫染液:0.5g甲基紫+10mL蒸餾水。
[0142](2)番紅-甲基紫染色:
[0143]①切片放于加熱板上加熱至55°C ;
[0144]②滴加番紅染液染色12min ；
[0145]③水洗5min，加熱板上烘干；
[0146]④滴加甲基紫染液染色5min ；
[0147]⑤水洗5min，加熱板上烘干后顯微鏡下觀察。
[0148]3.圖像的采集:方法同實施例一，獲得細胞的顯微圖片11。
[0149]4.圖像的前處理:方法同實施例一，獲得圖片12和13。
[0150]5.細胞的形態學分析:方法同實施例一，獲得圖片14和15。
【權利要求】
1.一種谷物種子胚乳細胞的形態學分析方法，包括以下步驟:(1)樹脂切片的制作；(2)切片的染色；(3)圖像的采集；(4)圖像的前處理；(5)細胞的形態學分析，其特征在于，步驟(4)圖像的前處理利用Photoshop軟件的鋼筆工具對種子細胞的輪廓進行精確的勾勒和描邊。
2.根據權利要求1所述的形態學分析方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)樹脂切片的制作 ①取材和固定:采集谷物的種子，小心取出完整穎果，浸泡在4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中24h ； ②漂洗和脫水:用0.1M磷酸緩沖液充分漂洗固定后的穎果，再用30% -50% -70% -90% -100% -100%乙醇對穎果逐級脫水，每級15min ； ③樹脂滲透、包埋和聚合:用25%-50% -75% -100% -100%倫敦白膠樹脂對穎果逐級滲透，每級12h，再將滲透完的穎果放于包埋模具內，注入純樹脂，將包埋模具放在烘箱內，60°C聚合1-2天，使樹脂硬化； ④修塊和半薄切片:對包埋塊進行手工修塊，削去穎果周圍多余樹脂，用超薄切片機切厚度為2微米的切片，將切片轉移到載玻片上的水滴上，將載玻片放在45°C加熱板上干燥，使切片展平； (2)切片的染色:用碘液、番紅-甲基紫染液或熒光增白劑染液對展平的切片染色，通過對細胞內容物的染色反襯出細胞輪廓或直接對細胞壁進行染色顯示細胞輪廓； (3)圖像的采集:在光學顯微鏡下拍攝切片上胚乳細胞的形態結構，保存圖片； (4)圖像的前處理:用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，利用鋼筆工具對種子細胞的輪廓進行精確的勾勒，再用畫筆工具對路徑進行描邊，保存圖片； (5)細胞的形態學分析:用Image-ProPlus軟件打開前處理的圖片，利用“Count/Size，，工具對胚乳細胞進行形態學分析。
3.根據權利要求1或2所述的形態學分析方法，其特征在于，步驟(3)中，圖像的采集過程在光學顯微鏡下進行: ①當使用碘液或番紅-甲基紫染液進行染色時，采用正常光模式進行拍攝； ②當使用熒光增白劑染液進行染色時，采用熒光模式進行拍攝。
4.根據權利要求1或2所述的形態學分析方法，其特征在于，步驟(4)中，所述圖像的前處理具體操作如下: ①用Photoshop軟件打開拍攝的圖片，用“矩形選框工具”選出待分析的區域，點選菜單欄的“編輯”-“拷貝”，再點選“文件”-“新建”，彈出的對話框中將分辨率改為“300”，背景內容改為“背景色”，點擊“確定”新建一個像素與待分析的區域相同的畫布(背景為黑色)； ②點選菜單欄的“編輯“粘貼”，將待分析的區域復制到新畫布上； ③選擇“鋼筆工具”，逐一對細胞壁進行精確勾勒，按“ESC”鍵完成勾勒； ④打開“路徑面板”，雙擊“路徑圖標”，輸入路徑名稱，點擊“確定”保存路徑； ⑤選擇“畫筆工具”，在“畫筆工具欄”中將“大小”改為“4”像素，“硬度”改為“100%”； ⑥選擇“鋼筆工具”，右擊畫好的“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，待分析區域清晰地顯示出胚乳細胞的輪廓； ⑦在“圖層面板”中右擊“背景圖層”，在彈出菜單中選擇“復制圖層”，點擊“確定”生成名稱為“背景副本”的圖層，拖動該圖層至最頂端，右擊“路徑”，在彈出菜單中選擇“描邊路徑”，對話框中選擇“畫筆工具”，點擊“確定”，顯示出背景為黑色，細胞輪廓為白色的圖像； ⑧點選菜單欄的“文件“存儲為”，保存為TIF格式的無損圖片。
【文檔編號】C12Q1/02GK104450859SQ201410811254
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月23日 優先權日:2014年12月23日
【發明者】韋存虛, 蔡燦輝, 趙凌霄 申請人:揚州大學