專利名稱：改進胚從人造種子萌發的方法
改進胚從人造種子萌發的方法
背景技術：
現代造 林經常需要種植大量所選擇的具有有利性質的遺傳上一致的植株。通過有 性繁殖產生植物種子來生產新植株，通常是不可行的。對于某些物種來說，通過培養體細 胞胚或合子胚的無性繁殖，已被顯示產生大量遺傳一致的胚，每個胚都具有發育成正常植 株的能力。但是，通過體外培養產生的植物胚缺少天然植物種子的天然保護性和營養性部 件。已經進行了嘗試，通過使用人造種子向實驗室中培養的植物胚提供在天然植物種子中 發現的保護性和營養性結構。人造種子被描述在例如美國專利Nos. 5，564，224,5, 687，504、 5，701，699和6，119，395中。人造種子的問題仍然存在。從人造種子產生的成功萌發率和 萌發物質量二者都低于從天然植物種子獲得的萌發率和質量。因此，對于改進從人造種子 獲得的萌發率和萌發物質量，存在著需求。本發明致力于這些以及其他需求。發明簡述一方面，本發明提供了人造種子，所述人造種子包含(a)種皮；(b)含有吸附性材 料的營養性培養基，其中吸附性材料以約30g/L到約100g/L的濃度存在于培養基中；以及 (c)苗限制器，其中苗限制器包含空腔。在一個實施方案中，人造種子還包含放置在苗限制 器空腔內的植物胚。在一個實施方案中，營養性培養基中的吸附性材料是炭。在一個實施 方案中，營養性培養基中的吸附性材料是營養物處理過的炭。在一個實施方案中，苗限制器還包含空腔內的吸附性材料。在一個實施方案中，空 腔中的吸附性材料是炭。在一個實施方案中，空腔內的吸附性材料是營養物處理過的炭。另一方面，本發明提供了用于改進植物胚從人造種子萌發的方法。在一個實施 方案中，方法包括下列步驟(a)組裝包含種皮和苗限制器的人造種子，其中苗限制器包含 空腔；(b)向種皮加入包含吸附性材料的營養性培養基，其中吸附性材料以約30g/L到約 100g/L的濃度存在于培養基中；(c)將植物胚置于苗限制器的空腔內；以及(d)在適合于 植物胚萌發的條件下培養人造種子。在一個實施方案中，方法包括下列步驟(a)組裝包含種皮和限制器的人造種子， 其中限制器包含空腔；(b)向種皮加入包含吸附性材料的營養性培養基，其中吸附性材料 以約30g/L到約100g/L的濃度存在于培養基中；(c)將植物胚置于限制器的空腔內；(d)向 空腔加入吸附性材料；以及(e)在適合于植物胚萌發的條件下培養人造種子。應該理解，可以改變方法中步驟的次序而不背離本發明的范圍。例如，可以在將胚 置于限制器內之前，將吸附性材料置于限制器的空腔內。


通過參考下面的詳細描述并結合隨附的圖，本發明的上述方面以及許多伴隨的優 點將變得更容易理解，在這些圖中圖1是在本發明的方法中使用的含有胚的示例性人造種子的截面側視圖；圖2是圖，顯示了置于在營養性培養基中具有增加量炭的人造種子中的胚的萌發 率。觀察在播種后19天做出；
圖3是圖，顯示了置于在營養性培養基中具有增加量炭的人造種子中的胚的萌發 率。觀察在播種后26天做出；圖4是圖，顯示了置于在營養性培養基中具有增加量炭的人造種子中的胚的器官 長度。觀察在播種后35天做出；以及圖5是圖，顯示了置于在營養性培養基中具有增加量炭的人造種子中的胚的發生 率。觀察在播種后35天做出。詳細描述 除非在本文中專門定義，否則所有本文中使用的術語都具有與本發明本領域技術 人員所理解的相同的意義。除非另有陳述，否則所有用百分率表示的濃度值都是單位體積的重量百分率。一方面，本發明提供了人造種子，所述人造種子包含(a)種皮；(b)含有吸附性材 料的營養性培養基，其中吸附性材料以約30g/L到約100g/L (例如從約50g/L到約100g/L、 從約60g/L到約100g/L或從約75g/L到約100g/L)的濃度存在于培養基中；以及(c)苗限 制器，其中苗限制器包含空腔。在一個實施方案中，人造種子還包含植物胚。圖1是含有置于其中的植物胚42的示例性人造種子20的截面側視圖。如圖1中 所示，胚42置于空腔34中，與營養性培養基26功能性接觸，并通過活端封43適合地密封。 應該理解，圖1提供了人造種子20的代表性實施方案；但是，本發明的方法不限于圖1中 顯示的人造種子的具體實施方案。在圖1所示的示例性實施方案中，人造種子20包含種皮 24、營養性培養基26、死端封28和任選的苗限制器22。本文中使用的“種皮”是指與天然種皮類似的結構，其保護植物胚和人造種子的 其他內部結構抵抗機械損傷、干旱，免于被微生物、真菌、昆蟲、線蟲、鳥類和其他病原體、食 草動物和害蟲攻擊，以及其他功能。種皮24可以由各種不同材料制成，包括但不限于纖維 質材料、玻璃、塑料、可模制塑料、熟化的聚合樹脂、石蠟、蠟、清漆及其組合例如用蠟浸漬的 紙。用于制造種皮的材料一般是無毒的，并提供一定程度的剛性。種皮可以是可生物降解 的，盡管典型情況下種皮保持完整和對植物病原體穿透的抗性直到萌發的胚出現之后。種 皮可以由一段管狀材料形成。種皮可以是切成段的纖維材料管例如紙管。成段的管可以用 適合的涂層材料例如蠟預處理。或者，種皮可以由可生物降解的塑料材料的管狀段形成。一 種這樣的材料是聚乳酸(“PLA”)，并由加利福尼亞洛杉磯的NAT-UR公司銷售。另一種適 合的材料是聚己酸內酯(“PCL”)混合物例如CAPA 6800 (PerstorpPolyols Inc. ,Toledo, Oklahoma 43612)，其中含有或不含 1 % TegomerH SI6440 增塑劑(Degussa Goldschmidt Chemical Corp,914EastRandolph Road, Hopewell, Virginia 23860)。這種可生物降解的 塑料管可以需要也可以不需要蠟質涂層，因為這種管已經對環境要素具有抗性。添加劑例 如抗生素和植物生長調節劑可以通過例如摻入到形成種皮的一個或多個層的材料中，或通 過使用常規手段用添加劑進行涂層或用其處理(一個或多個)層，添加到種皮中。在本發明的人造種子和方法中，營養性培養基26與置于人造種子20內的植物胚 功能性接觸。本文中使用的“營養性培養基”是指營養物源，例如維生素、礦物質、碳源和能 源以及胚在萌發過程中所使用的其他有益化合物。因此，營養性培養基26類似于天然種子 的配子體。本發明的營養性培養基26可以包含使培養基在正常環境條件下成為半固體或 具有凝固稠度的物質。典型情況下，營養性培養基26為水合凝膠的形式。“凝膠”是被制備成膠體溶液并將或能夠導致形成半固體材料的物質。這種液體凝膠溶液向半固體材料的轉 變，在本文中被稱為凝膠的“固化”或“凝固”。“水合凝膠”是指含水的凝膠。這種凝膠的 制備是通過首先在水中(其中水用作溶劑或“連續相”)溶解親水性聚合物質(用作溶質或 “分散相”)，所述親水性聚合物質在固化后，與連續相組合形成了半固體材料。因此，水變得 與溶質分子均勻締合，連續相與分散性不發生任何實質性分離。但是，例如通過蒸發或經萌 發胚的滲吸，能夠將水分子從固化的水合凝膠中自由移出。當固化時，這些凝膠具有順應性 固體的特征，類似一團明膠，其中當凝膠中水的相對量減少時，順應性變得越來越低，凝膠 觸摸起來變得更“堅固”。除了為水溶性之外，適合的凝膠溶質既無細胞毒性也無顯著植物毒性。在本文中 使用時，“無顯著植物毒性”的物質是不顯著干擾正常的植物發育、例如殺死顯著量的植物 細胞、顯著改變細胞分化或成熟、引起突變、破壞顯著量的細胞膜或顯著破壞細胞代謝、或 顯著破壞其他過程的物質。候選的凝膠溶質包括但不限于下列藻酸鈉，瓊脂，瓊脂糖，直鏈淀粉，果膠，葡聚 糖，明膠，淀粉，支鏈淀粉，改性纖維素例如甲基纖維素和羥乙基纖維素，以及聚丙烯酰胺。 其他親水性凝膠溶質也可以使用，只要它們具有類似的水合和膠凝性質并缺乏毒性即可。凝膠典型地通過將通常為細小顆粒形式的凝膠溶質溶解在水中形成凝膠溶液來 制備。取決于具體的凝膠溶質，在凝膠溶質溶解之前通常需要加熱，有時加熱到沸騰。隨后 的冷卻將引起許多凝膠溶質可逆地“凝固”或“固化”(變得膠化)。實例包括明膠、瓊脂和 瓊脂糖。這樣的凝膠溶質被稱為“可逆的”，是因為重新加熱固化的凝膠將重新形成凝膠溶 液。其他凝膠溶質的溶液需要“絡合”劑，所述絡合劑通過交聯凝膠溶質分子將凝膠化學固 化。例如，藻酸鈉通過向凝膠溶液加入硝酸鈣(Ca(NO3)2)或其他二價離子包括但不限于鈣、 鋇、鉛、銅、鍶、鎘、鋅、鎳、鈷、鎂和鐵的鹽，來進行固化。許多需要絡合劑的凝膠溶質不可逆 固化，其中重新加熱將不會重新建立起凝膠溶液。凝膠溶質的濃度根據具體的凝膠溶質而變。例如，可用的藻酸鈉濃度在約0. 5% w/v到約2. 5 % w/v、優選為約0. 9 % w/v到1. 5 % w/v的范圍內。可用的瓊脂濃度在約0. 8 % w/v到約2. 5% w/v的范圍內，優選為約1. 8% w/v。一般來說，通過絡合固化的凝膠比“可 逆性”凝膠需要較少的凝膠溶質就能形成令人滿意的凝膠。 營養性培養基26典型地包含一種或多種碳源、吸附性材料、維生素和礦物質。適 合的碳源包括但不限于單糖、二糖和/或淀粉。適合的吸附性材料包括但不限于炭、聚乙烯 聚吡咯烷酮和硅膠。營養性培養基26也可以包含氨基酸和煙懸物(smoke suspension) 0 適合的氨基酸可以包括通常發現的摻入到蛋白質中的氨基酸以及不常被發現摻入到蛋白 質中的氨基酸，例如精氨琥珀酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、鳥氨酸和D-立體異構體。適合的煙懸 物含有通過燃燒有機物質例如木材或其他纖維質材料的過程產生的一種或多種化合物。含 有這些燃燒有機物質的副產物的溶液可以通過燃燒有機物質，用水洗滌燒焦材料并收集水 來產生。溶液也可以通過加熱有機物質并凝聚和稀釋從這種加熱釋放的揮發性物質來獲 得。某些類型的煙懸物可以從商業化供應商購買，例如Wright' s濃縮山胡桃陳化液體煙 (Wrightr s Concentrated HickorySeasoning Liquid Smoke)(B&G Foods,Inc. Roseland, NewJersey 07068)。煙懸物可以各種不同形式摻入到營養性培養基26中。例如，煙懸物可 以作為氣溶膠、粉末或作為活性粘土摻入。示例性的Wright' s濃縮山胡桃陳化液體煙液體煙懸物的濃度，如果存在 的話，在每升培養基0. OOOlml到Iml煙懸物之間。營養性培養 基26也可以包含一種或多種參與氮代謝的化合物，例如尿素或多胺。營養性培養基26可以包含攜帶氧氣的物質，以同時增加氧氣的吸收和氧氣被 營養性培養基26的持留，從而使培養基將氧氣濃度維持在高于僅僅從大氣吸收氧氣 時培養基中存在的氧氣濃度。示例性的攜帶氧氣的物質包括全氟化碳例如FC-77(3M Corporation, St. Paul, Minnesota)，其用表面活性劑例如 Pluronic F-68 乳化，所述 Pluronic F-68可以從新澤西Parsippany的BASF Corp.公司獲得。示例性攜帶氧氣的物 質描述在美國專利No. 5，564，224中(例如第9欄第44行到第11欄第67行)，在此引為參 考。營養性培養基26也可以含有激素。適合的激素包括但不限于脫落酸、細胞分裂 素、植物生長素和赤霉素。脫落酸是倍半萜類植物激素，所述倍半萜類植物激素參與多 種植物生理過程(參見例如 MiIborrow，J. Exp. Botany 52:1145-1164(2001) ；Leung & Giraudat Ann. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol. 49 199-123 (1998)) 植物生長素是 促進細胞分裂和生長的植物生長激素。在萌發培養基中使用的示例性植物生長素包括但不 限于2，4_ 二氯苯氧基乙酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3- 丁酸、萘乙酸和氯原酸。細胞分裂素 是影響分裂細胞的組織化的植物生長激素。在萌發培養基中使用的示例性細胞分裂素包 括但不限于例如6-苯甲基氨基嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、二氫玉米素、玉米素、激動素和玉米 素核苷。赤霉素是一類二萜類植物激素(參見例如Krishnamoorthy，《赤霉素和植物生長》 (Gibberellins and Plant Growth), John ffiley&Sons, (1975))。可以在本發明的實施中 使用的赤霉素的代表性實例包括赤霉酸、赤霉素3、赤霉素4和赤霉素7。有用的赤霉素混 合物的實例是赤霉素4和赤霉素7的混合物(稱為赤霉素4/7)，例如由伊利諾伊州芝加哥 的 Abbott Laboratories 銷售的赤霉素 4/7。營養性培養基26也可以包括抗微生物劑。適合的抗微生物劑可以從密蘇里州圣 路易斯的Sigma-Aldrich公司獲得，以產品號#A5955銷售。抗微生物劑可以例如lml/L的 濃度使用。當營養性培養基26中存在脫落酸時，它典型地以約lmg/L到約200mg/L的濃度范 圍使用。當存在于營養性培養基26中時，赤霉素的濃度典型地在約0. lmg/L到約500mg/L 之間。植物生長素可以例如從0. lmg/L到200mg/L的濃度使用。細胞分裂素可以從0. Img/ L到100mg/L的濃度使用。示例性營養性培養基描述在美國專利No. 5，687，504(例如第8欄第63行到第9 欄第41行)和美國專利
發明者威廉·C·卡爾松, 杰弗里·E·哈特爾 申請人:韋爾豪澤Nr公司