一種批量提取水稻胚乳dna的方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，公開了一種批量提取水稻胚乳DNA的方法。該方法包括如下步驟：S1.從水稻種子中切取胚乳；S2.將胚乳投入PCR板（T1板）孔中；S3.T1板每孔加入堿液，放入PCR儀中進行加熱；S4.取出T1板，每孔投入鎢合金珠及1×DNA抽提液；S5.將T1板重新置于PCR儀中進行加熱；S6.取出T1板，振動；S7.將T1板放入離心機進行離心；S8.取出T1板，將上清液轉移至另一PCR板（T3板）中，T3板每孔中預先加入雙蒸水；S9.將T3板置于冰箱中保存。該方法快速、操作簡單，可實現水稻胚乳DNA的批量提取。
【專利說明】一種批量提取水稻胚乳DNA的方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地，涉及一種批量提取水稻胚乳DNA的方法。
【背景技術】
[0003]水稻是我國重要的糧食作物，高產、優質、多抗水稻新品種的培育是提升我國糧食安全的重要環節。隨著分子標記的出現，利用分子標記輔助選擇提高新品種培育效率已得到了廣泛應用。
[0004]水稻DNA的制備是進行分子標記輔助選擇的前提，在提取時應根據不同研究需要，保證其結構的相對完整性；盡量排除其他大分子成分如蛋白質、多糖等的污染。以水稻葉片為材料，利用CTAB進行DNA提取，是目前廣泛應用的方法，該方法DNA提取量較多、純度也較高，可滿足大部分分子生物學研究要求。但該方法有機試劑處理次數過多、耗時長、 成本高。前人已經研究了部分DNA提取的簡化方法，如簡化的CTAB法、TritonX-1OO法、 NaOH提取法等，但這些方法都存在各種缺點(如效率低、有毒試劑使用等)，無法滿足大批量群體的DNA抽提工作。此外，一般的DNA抽提以葉片為材料，必然受到水稻生長季節的限制， 特別是在需篩選目的基因型單株移栽時，其時間的要求更加緊迫。如能利用水稻胚乳提取 DNA，可將基因型鑒定工作提早一個世代，對于育種工作的安排更加有利。
[0005]目前，利用水稻籽粒提取DNA的研究已有報道，但已有的研究操作步驟繁瑣、不能進行批量化提取；此外，現有的籽粒提取DNA是破壞性的方法，籽粒被完全破壞，無法繼續種植。因此，有必要探討一種批量化的水稻胚乳DNA提取方法，使其更好的應用于水稻育種。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的 技術問題是，為了克服現有技術中水稻DNA提取技術的上述不足，提供一種批量提取水稻胚乳DNA的方法。
[0007]本發明所要解決的上述技術問題，通過以下技術方案予以解決:
一種批量提取水稻胚乳DNA的方法，包括如下步驟:
51.從水稻種子中切取胚乳；
52.將胚乳投入PCR板孔中，所述的PCR板命名為Tl板；
53.Tl板每孔加入50?150 u L堿液，放入PCR儀中進行加熱；
54.取出Tl板，每孔投入鎢合金珠及150-250 u L I XDNA抽提液；
55.將Tl板重新置于PCR儀中進行加熱；
56.取出Tl板，振動3?4min ；
57.將Tl板放入離心機進行離心；
58.取出Tl板，將上清液轉移至另一PCR板中，PCR板命名為T3板，T3板每孔中預先加入5(Tl50 u L雙蒸水；
S9.將T3板置于冰箱中保存；
S4中IXDNA抽提液的組成為pH9.5的Tris、EDTA, KCl，它們的摩爾比為 5?15:0.5?1.5:50?150。
[0008]該方法提取快速、不使用有毒的提取試劑，而且利用水稻胚乳提取DNA，可將基因型鑒定工作提早一個世代，對于育種工作的安排更加有利。
[0009]作為一種優選方案，SI中所述從水稻種子中切取胚乳是指從每粒水稻種子切取 1/3的胚乳。
[0010]作為一種優選方案，S2中每個PCR板孔中投入5?8mg胚乳。
[0011]作為一種優選方案，S2中所述的堿液為I mol/ L NaOH溶液；加入量為100 u L。
[0012]作為一種優選方案，S3中的PCR條件為99 V 15 min。
[0013]作為一種優選方案，S4中I XDNA抽提液的每孔用量為180yL ;Tris、EDTA和KCl 的摩爾比為10:1:100 ;鎢合金珠每孔加入I粒。
[0014]作為一種優選方案，S5中的PCR條件為99 °C，3 min。
[0015]作為一種優選方案，S7中以5000 rpm離心I min。
[0016]作為一種優選方案，所述的Tl板和T3板為96孔板。
[0017]作為一種優選方案，S8中使用96針復制器轉移上清液。
[0018]作為一種優選方案，S9中`所述的保存是指置于_20°C冰箱中保存。
[0019]本發明與現有技術相比具有以下優點:
I)本方法以水稻籽粒1/3胚乳為DNA抽提材料，而通常的DNA抽提以葉片為材料，本方法在時間安排上更加靈活。
[0020]2)本方法以水稻籽粒1/3胚乳，剩余的籽粒部分(胚乳和胚)仍然保留可以繼續種植，而通常的水稻籽粒DNA抽提以整個籽粒為材料，提取DNA后無法種植。
[0021]3)本方法 I XDNA 抽提液配方如下:IOmM Tris (pH9.5), ImM EDTA，100 mM KCl ； 不含有毒的酚-氯仿等試劑，對于操作人員更加安全。
[0022]4)本方法利用用96針復制器實現DNA的批量轉移，一次可以轉移96個樣品，每樣品約0.5 y L，耗時3飛秒；而通常的DNA轉移利用多道移液器進行，需多次更換移液吸頭， 轉移96個樣品所需時間較長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為水稻籽粒胚乳切取位置。
[0024]圖2為利用本方法提取的5個水稻樣本胚乳DNA電泳圖；圖2中:M為DNA ladder; I為R173; 2為日本晴；3為秈小占；4為航恢7號；5為粵晶絲苗2號。
[0025]圖3為利用CTAB提取的5個水稻樣本胚乳DNA電泳圖；圖3中:M為DNA ladder; I為R173; 2為日本晴；3為秈小占；4為航恢7號；5為粵晶絲苗2號。
【具體實施方式】
[0026]以下結合具體實施例來進一步解釋本發明，但實施例對本發明不做任何形式的限定。[0027]實施例1利用本方法提取水稻品種為R173、日本晴、秈小占、航恢7號、粵晶絲苗 2 號 DNA0
[0028]具體方法為:
S1.取帶稃殼水稻種子96粒，剝去稃殼，用刀片切取1/3胚乳(約5-8mg) ；S2.所切取的胚乳投入96孔PCR板(Tl板)孔中，對應的剩余籽粒部分(胚
乳和胚)投入另一 96孔PCR板(T2板)孔中，Tl與T2板所投樣片的孔編號一一對應；
53.用多通道移液器在Tl板每孔加入100UL I mol/ L NaOH溶液，放入PCR儀，99 V 15 min，T2板放入4°C冰箱備用；
54.Tl板取出，每孔投入I粒鎢合金珠，并用多通道移液器吸取180 ii L I XDNA抽提液置入每孔，蓋好硅膠蓋；
55.將Tl板重新置于PCR儀中，99V，3 min ；
56.取出Tl板，接觸渦旋器振動3-4min，直至所有孔的組織較徹底地被破碎；S7.T1板放入離心機，用吊籃轉子5000 rpm離心I min ；
58.取出Tl板，用96針復制器沾取上清液(含DNA)至另一96孔PCR板(T3板)中，T3 板每孔中預先加入100 u L雙蒸水；
59.取出T3板，置于_20°C冰箱中保存。
[0029]對比例I利用CTAB法提取水稻品種為R173、日本晴、秈小占、航恢7號、粵晶絲苗 2 號 DNA0
[0030]具體方法:
S1.取少量水稻插秧后一月幼葉置于液氮冷凍的2.0 mL滅菌離心管中攪拌至粉末狀， 加1000 u L2XCTAB-DNA提取液(質量分數W/V 2%的CTAB，pH8.0 ;質量分數W/V 1%的PVP ； 100 mmol/L Tris-HCl, pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl ;20 mmol/L EDTA，pH8.0 ;體積分數 V/V
0.2%的巰基乙醇)； S2.置于65 °C恒溫水浴鍋中每隔10 min搖動一次，30?45 min 后取出；
53.冷卻2min后加1000 U L氯仿-異戊醇(體積比24:1)，上下劇烈充分搖動，使兩者混合均勻；
54.10000 rpm離心10 min,輕取上清至1.5 ml滅菌新離心管中，加入600 UL預冷異丙醇上下輕搖均勻；
55._20°C放置 30 min 使 DNA 沉淀；
56.10000 rpm離心6 min,立即倒掉上清倒立離心管于紙巾上；
57.1 min后直立離心管，加入800 u L 70%乙醇和3 M NaAc (體積比9:1)，輕搖使DNA 懸浮放置30 min ；
58.10000 rpm離心6 min,立即倒掉上清加入800 u L 70%乙醇將DNA再次漂洗30
min ；
59.10000 rpm離心3 min,通風樹內烘干；
S10.加入 100-200 u LlXTB Buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0；lmM EDTA, pH8.0)溶
解，4 °C保存備用。
[0031]實施例2實施例1與對比例I兩種方法提取的DNA濃度及純度測定。
[0032]具體方法:1) UV-240紫外分光光度計開機預熱IOmin ；2)用重蒸水洗滌比色皿，吸水紙吸干，加入TE緩沖液后，放入樣品室的S池架上，關上蓋板；3)設定狹縫后校零；4)將標準樣品和待測樣品適當稀釋(DNA5 μ I或RNA4y I用TE緩沖液稀釋至1000 μ I)后，記錄編號和稀釋度；5)把裝有標準樣品或待測樣品的比色皿放進樣品室的S架上，關閉蓋板；6)設定紫外光波長，分別測定230nm、260nm、280nm波長時的OD值；7)計算待測樣品的濃度與純度，DNA樣品的濃度(μ g/μ I):0D260X稀釋倍數X 50/1000，RNA樣品的濃度(μ g/μ I):0D260X 稀釋倍數 X40/1000。
[0033]實施例3利用凝膠電泳檢測實施例1和對比例I所提取的DNA 具體方法:制備1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，觀察結果并照相保存。
[0034]對比兩種方法提取的DNA濃度及純度。本方法提取的DNA可以達到CTAB法DNA量的一半左右，CTAB法提取的DNA濃度在74(Tll00ng/ μ L之間，本方法提取的DNA濃度在30(T480ng/ μ L。CTAB法提取的DNA的0D260/0D280在1.8?2.0之間，說明質量完好；本方法提取DNA法提取的DNA的0D260/0D280在1.8?2.0之間。電泳結果表明兩種方法提取的DNA均可應用于下一步研究。在耗時方面，以提取水稻96個樣為例，本方法需要30分鐘，而CTAB法需要3個小時左右。說明本方法可大大提聞DNA抽提效率,并可滿足下一步研究需求。`
【權利要求】
1.一種批量提取水稻胚乳DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟:S1.從水稻種子中切取胚乳；S2.將胚乳投入PCR板孔中，所述的PCR板命名為Tl板；S3.Tl板每孔加入50-150 u L堿液，放入PCR儀中進行加熱；S4.取出Tl板，每孔投入鎢合金珠及150 250 u L I XDNA抽提液；S5.將Tl板重新置于PCR儀中進行加熱；S6.取出Tl板，振動3-4min ；S7.將Tl板放入離心機進行離心；S8.取出Tl板，將上清液轉移至另一PCR板中，PCR板命名為T3板，T3 板每孔中預先加入5(Tl50 V- L雙蒸水；S9.將T3板置于冰箱中保存；S4中IXDNA抽提液的組成為pH9.5的Tris、EDTA, KCl，它們的摩爾比為 5-15:0.5-1.5:50-150。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，SI中所述從水稻種子中切取胚乳是指從每粒水稻種子切取1/3的胚乳。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S2中每個PCR板孔中投入 5-8mg胚乳。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述的堿液為Imol/ L NaOH溶液；加入量為100 u L0
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S3中的PCR條件為99V 15 min。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S4中IXDNA抽提液的每孔用量為180 u L5Tris、EDTA和KCl的摩爾比為10:1:100 ;鎢合金珠每孔加入I粒。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S5中的PCR條件為99V，3 min。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S7中以5000rpm離心I min。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Tl板和T3板為96 孔板。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S8中使用96針復制器轉移上清液。
【文檔編號】C12N15/10GK103436524SQ201310238655
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月17日 優先權日:2013年6月17日
【發明者】郭濤, 羅文龍, 陳志強, 王慧, 陳海英, 劉永柱, 張建國 申請人:華南農業大學