一種新型共固定化白腐菌凝膠顆粒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于染色廢水處理領域，具體涉及一種新型共固定化白腐菌凝膠顆粒。本發明利用硫酸銨和戊二醛使粗酶液中的胞外酶聚集交聯，形成交聯酶聚集體，再與白腐菌游離菌絲共分散固定，制得新型共固定化白腐菌凝膠顆粒。本發明白腐菌胞外酶以酶聚集體形態存在，提高了其對蛋白水解酶的抵抗能力，從而保護交聯酶聚集體不被凝膠顆粒內白腐菌B所分解，保證白腐菌A分泌的胞外酶長期維持一定的酶活，啟動時間更短，對染色廢水環境的適應性更強，可直接用于廢水處理的流化床反應器，用于所有染色廢水的處理。
【專利說明】一種新型共固定化白腐菌凝膠顆粒

【技術領域】
[0001]本發明屬于染色廢水處理【技術領域】，具體涉及一種新型共固定化白腐菌凝膠顆粒。

【背景技術】
[0002]合成染料是一類穩定的芳香族大分子化合物，具有高生物毒性、難降解和高色度等特點，對水生生物系統會產生嚴重危害，間接或直接影響人類身體健康，是工業廢水中需治理的重要污染物。考慮到處理成本、產生二次污染等因素，生物處理依然是染色廢水主要的治理手段。目前較成熟的生物處理染料技術是利用厭氧菌群對偶氮染料進行非專一性偶氮還原脫色，但該工藝難以降解三苯基甲烷類和蒽醌類等其它結構類型染料，對染料的脫毒效用也較差，有時還會產生生物毒性更高的胺酚化合物。
[0003]目前已知的生物系統中，白腐菌能在好氧條件下非專一性降解染料，并對其有顯著的脫毒作用。白腐菌是一類以擔子菌綱為主，能使木材白腐病變的真菌，其對染料的降解主要依靠在次生代謝階段分泌的木素降解胞外酶系統。該胞外酶系統主要由木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶三類同工酶系組成，它們可以分別利用不同的電子中間遞體氧化異生物質，由于這些胞外酶不需要與降解物直接接觸，因此對染料的生物毒性具有一定的抵抗能力。
[0004]白腐菌是一類絲狀真菌，降解反應器中機械力太大會破壞其絲狀結構，從而破壞菌絲分泌木素降解胞外酶系，機械力太小又影響印染廢水水體氧氣的傳質作用，從而降低白腐菌的降解能力，同時其降解反應苛刻的溫度、PH條件，也極大增加了工業實際操作難度。白腐菌固定化技術能有效改善白腐菌工業應用的上述缺點，白腐菌的包埋小球也使其便于在廢水處理的流動床設備中應用。但單純固定化白腐菌細胞無法解決白腐菌工業處理染色廢水的所有技術問題。
[0005]白腐菌分泌合成木素降解胞外酶系統穩定性極差，即使在最適培養條件下，水體中的該胞外酶系的酶活也處于劇烈波動狀態，難以穩定，這導致了廢水水體停留時間的延長。同時，木素降解酶系的分泌合成處于白腐菌的次生代謝階段，意味著工業實際應用中需要人為往廢水水體中添加額外碳源，調節碳氮比。這不但帶來了處理成本的增加，也極大提高了反應系統的控制難度。研究還證明部分有機污染物會抑制木素降解酶系的合成，而水體中重金屬的存在則多會抑制木素降解酶系的酶活，尤其是對錳過氧化物酶的酶活影響顯著，這些物質在廢水水體中的存在限制了傳統白腐菌反應器的應用。
[0006]在工業上單純利用固定化木素降解酶系統雖然能一定程度解決上述問題，但又引入了新的問題，木素過氧化物酶和錳過氧化物酶是以過氧化氫為最終電子受體，直接使用固定酶處理廢水需要向水體添加過氧化氫或酶促反應產生過氧化氫的物質。而由于自然環境進化的需要，對特定印染廢水木素降解酶系氧化能力較大的同時，菌絲生長能力也較強的白腐菌菌種在自然環境中的菌種尋找難度較大，這也成為有待解決的問題。


【發明內容】

[0007]本發明的目的在于克服現有技術存在的問題，提供了一種用于染色廢水的高效處理，適應條件廣泛的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒。
[0008]上述目的通過以下技術方案實現的:
一種新型共固定化白腐菌凝膠顆粒是通過以下步驟制備得到:
O白腐菌A胞外酶交聯聚集體的制備:白腐菌A在培養液中培養6-20天后，收集培養液，透析去除無機離子，濃縮，制得粗酶液，粗酶液中加入硫酸銨，攪拌，制得反應液；向反應液中滴加濃度為25%的戊二醛，在恒溫震蕩條件下交聯數小時，離心，蒸餾水多次洗滌沉淀，制備酶交聯聚集體，加入蒸餾水制得酶聚集體懸浮液；
步驟I)中將白腐菌A的胞外酶制成交聯酶聚集體，增加胞外酶對蛋白質水解酶的抵抗力，以使其可在凝膠顆粒中長期維持酶活性。
[0009]2)白腐菌B細胞勻漿的制備:白腐菌B在培養液中培養3-10天，濾布收集菌絲，置于蒸餾水中，玻璃珠打散菌絲，制得白腐菌B的細胞勻漿。
[0010]3)共固定化凝膠顆粒的制備:將步驟I)制得的酶聚集體懸浮液和步驟2)制得的白腐菌B的細胞勻漿混合加入海藻酸鈉，制得均勻混合物，將均勻混合物滴入2%的0&(:12溶液中，室溫靜置固定，將所得顆粒物用蒸餾水洗滌，制得新型共固定化白腐菌凝膠顆粒。
[0011]步驟3)中，將白腐菌A的胞外酶交聯聚集體與白腐菌B的菌絲細胞共固定化，消除了兩種白腐菌的競爭抑制作用。
[0012]所述的，培養液的組分:2g/LKH2P04、0.25g/LMgS04、0.lg/LCaCl2、5mg/LMnS04、5mg/LVB K 0.2g/L酒石酸銨、20g/L葡萄糖和150ml/L的微量元素儲備液。
[0013]所述的，微量元素儲備液的組*:NaC11.0g/L、MgS04*7H203.0g/L、FeS04*7H20100mg/L、CoS04*7H20100mg/L、CaCl2100mg/L、ZnS04.7H201 OOmg/L、CuS04.5H2010mg/L、KAl (SO4) 2100mg/L、H3BO31mg/!和 NaMo0410mg/L。
[0014]所述的，步驟I)中硫酸銨的加入量為粗酶液質量的60%_90%，攪拌10_60min。
[0015]所述的，步驟I)中戊二醛在反應液中的質量濃度為0.2-0.4%，交聯溫度為20-30°C，交聯的震蕩頻率為lOOrpm，交聯時間為20_30h，離心速度為14000r/min，離心時間為1min。
[0016]所述的，步驟3)中均勻混合物的木素降解胞外酶系總酶活大于50U/ml，其包含的菌絲細胞干重大于5mg/ml。
[0017]所述的，步驟3)中海藻酸鈉在混合物中的質量濃度為2%，固定時間為l_3h。
[0018]粗酶液包含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶中的一種或多種。
[0019]本發明的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒，其制備工藝路線見圖1。
[0020]在上述共固定化白腐菌凝膠顆粒中，白腐菌A和白腐菌B可是任何相同或相異的白腐菌菌種。根據適用廢水環境條件，選擇對異生質降解能力較強的菌種為白腐菌A，制備交聯酶聚集體，生長速率較快的菌種為白腐菌B，制備細胞勻漿，可制得適應能力更強、生長較快、處理效能更高的凝膠顆粒。
[0021]本發明的有益效果:
1.本發明在包埋白腐菌胞外酶前，使用交聯劑戊二醛將白腐菌A胞外酶形成交聯酶聚集體。與游離酶相比，酶聚集體靜電力和酶分子間的疏水作用增大，有利于防止酶分子發生去折疊或解離，從而增強了蛋白質對熱和其它變性劑的穩定性。同時，交聯酶聚集體相對有序的三維結構，提高了對蛋白水解酶的抵抗能力，從而保護交聯酶聚集體不被凝膠顆粒內白腐菌B所分解，保證白腐菌A分泌的胞外酶長期維持一定的酶活。而交聯酶聚集體的這種無載體固定，也使其充分利用凝膠顆粒內部有限空間，使每一粒凝膠顆粒能容納更多體積的白腐菌胞外酶。
[0022]2.本發明的共固定化白腐菌凝膠顆粒啟動前已含有木素降解酶系，有效縮短固定化白腐菌的啟動時間。同時凝膠顆粒內胞外酶交聯聚集體的存在，減小了對白腐菌B分泌木素降解酶系的需求，可應用于存在抑制白腐菌分泌木素降解酶系污染物的廢水處理，增強了該凝膠顆粒系統對染色廢水環境的適應性。
[0023]3.本發明的凝膠顆粒內，除包埋白腐菌胞外酶聚集體的同時，還包埋白腐菌菌絲細胞。這些菌絲可直接利用廢水中污染物和其降解產物生成過氧化氫，為酶系統的氧化降解提供電子受體終端。
[0024]4.本發明的共固定化白腐菌凝膠顆粒可直接使用于廢水處理的流化床反應器，用于所有染色廢水的處理。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發明的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒的制備工藝路線；
圖2為本發明的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒對偶氮染料的降解效能；
圖中，a為實施例1對偶氮染料的降解效能，b為實施例2對偶氮染料的降解效能；
圖3為本發明的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒對三苯基甲烷類染料的降解效能；
圖中，a為實施例1對三苯基甲烷類染料的降解效能，b為實施例2對三苯基甲烷類染料的降解效能；
圖4為實施例1的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒的對變性劑Cr (VI)的穩定性測試； 圖5為實施例2的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒的對變性劑Cr (VI)的穩定性測試。

【具體實施方式】
[0026]下面通過具體實施例，對本發明的優勢做進一步具體的說明，但是本發明并不限于如下實施例。
[0027]實施例1
白腐菌A選用Trametes versicolor (購自中國工業微生物菌種保藏中心,菌株保藏編號為CICC50001),白腐菌B選用Phanerochaete chrysosporium (購自廣東微生物菌種保藏中心，菌株保藏編號為GM3.383)。
[0028]白腐菌A在培養液中培養10天后，4.5m濾紙收集培養液，透析去除基質中無機離子，膜過濾器濃縮10倍獲得粗酶液。向粗酶液中添加占粗酶液質量60%的硫酸銨，攪拌1min,制得反應液；向反應液中緩慢滴加0.2%(w/w)的濃度為25%的戊二醛，30°C和10rpm條件下恒溫震蕩交聯20h后，14000r/min離心1min去上清液，沉淀用蒸餾水多次洗滌，去除過量戊二醛和硫酸銨，制得交聯酶聚集體，加入蒸餾水制得酶聚集體懸浮液，置于4°C冰箱中保存備用。
[0029]白腐菌B培養3天后，濾布收集菌絲，置于蒸餾水中，玻璃珠打散菌絲，制得白腐菌B的細胞勻漿。酶聚集體懸浮液和細胞勻漿混合均勻，制得混合物，向混合物中加入2%海藻酸鈉(w/w)，制得均勻混合物。均勻混合物中包含12.5mg/ml的菌絲細胞和2.34 X 16U/ml的酶交聯聚集體。將均勻混合物滴入2%的CaCl2溶液中室溫靜置固定2h后，蒸餾水沖洗制得3±0.2mm直徑的共固定化白腐菌凝膠顆粒。
[0030]培養液的組分:2g/LKH2P04、0.25g/LMgS04、0.lg/LCaCl2、5mg/LMnS04、5mg/LVBl、
0.2g/L酒石酸銨、20g/L葡萄糖和150ml/L微量元素儲備液。
[0031]微量元素儲備液的組分:NaCll.0g/L、MgSO4.7Η203.0g/L、FeS04*7H20100mg/L,CoS04.7H20100mg/L、CaCl2100mg/L、ZnS04.7H20100mg/L、CuS04.5H2010mg/L、KAl (SO4)210mg/L、H3BO31mg/!和 NaMoO41Omg/L。
[0032]實施例2
白腐菌A和白腐菌B均選用白腐菌Phanerochaete chrysosporium (購自廣東微生物囷種保減中心，囷株保減編號為GIM3.383)。
[0033]白腐菌A在培養液中培養20天后，4.5m濾紙收集培養液，透析去除基質中無機離子，膜過濾器濃縮10倍獲得粗酶液。向粗酶液中添加占粗酶液質量90%的硫酸銨，攪拌60min,制得反應液；向反應液中緩慢滴加0.4%(w/w)的濃度為25%的戊二醛，20°C和10rpm條件下恒溫震蕩交聯30h后，14000r/min離心1min去上清液，沉淀用蒸餾水多次洗滌，去除過量戊二醛和硫酸銨，制得交聯酶聚集體，加入蒸餾水制得酶聚集體懸浮液，置于4°C冰箱中保存備用。
[0034]白腐菌B培養10天后，濾布收集菌絲，置于蒸餾水中，玻璃珠打散菌絲，制得白腐菌B的細胞勻漿。酶聚集體懸浮液和細胞勻漿混合均勻，制得混合物，向混合物中加入2%海藻酸鈉(w/w)，制得均勻混合物。均勻混合物中包含20.7mg/ml的菌絲細胞和1.73 X 17U/ml的酶交聯聚集體。將均勻混合物滴入2%的CaCl2溶液中室溫靜置固定3h后，蒸餾水沖洗制得3±0.2mm直徑的共固定化白腐菌凝膠顆粒。
[0035]培養液的組分和微量元素儲備液的組分同實施例1。
[0036]新型凝膠顆粒對偶氮類染料的降解效能測試
稱取40mg的酸性大紅GR溶于IL的白腐菌培養液中，制得人工染色廢水，酸性大紅GR為工業常用的偶氮類染料。10ml錐形瓶中添加40ml廢水和0.36±0.03g干重的共固定化白腐菌凝膠顆粒。以蒸餾水替代酶聚集體懸浮液，其它步驟同對應實施例，分別制得兩個對照組的白腐菌凝膠顆粒一對照組I和對照組2，添加等質量對照凝膠顆粒。在25°C和10rpm條件下恒溫振蕩培養2.5天，在510nm處測定培養前后人工染色廢水吸光度，按下式計算染料的脫色降解率，反映凝膠顆粒對染料的降解效能。
[0037]染料的脫色降解率(％)=(A0-At) /A0*100%
其中，Atl和A t分別為人工染色廢水培養前后的吸光度。
[0038]平行實驗10次，實驗結果見圖2。實驗表明，共固定化白腐菌凝膠顆粒相對于傳統的固定化白腐菌啟動時間更短，對染料具有更強的降解能力。
[0039]新型凝膠顆粒對三苯基甲烷類染料的降解效能測試
按上述降解偶氮類染料相似的測試方法，以堿性品紅替代酸性大紅GR制得人工染色廢水，堿性品紅為工業常用三苯基甲烷類染料。恒溫振蕩培養7天，在540nm處測定培養前后人工廢水吸光度，計算染料的脫色降解率。平行實驗10次，實驗結果見圖3。實驗證明，對于三苯基甲烷類染料，本發明的共固定化白腐菌凝膠顆粒具有更強的降解能力。同時，對比圖2和圖3，可以根據廢水組分的不同，可選擇采用不同的白腐菌胞外酶系和菌絲細胞。
[0040] 對變性劑Cr (VI)的穩定性測試
前人研究表明Cr (VI)對木素降解酶系的酶活有明顯抑制作用，以不同濃度Cr (VI)表征廢水環境的惡劣程度。以游離酶液替代酶聚集體懸浮液，其它步驟同對應實施例，分別制得兩個對照組的共固定白腐菌凝膠顆粒一對照組I和對照組2。10ml錐形瓶中添加40ml白腐菌培養液、40mg/L酸性大紅GR、0.48±0.02g干重的共固定化凝膠顆粒和不同濃度的Cr (VI)。在25°C和10rpm條件下恒溫振蕩培養3天后，在510nm處測定培養前后水體脫色度，實驗結果見圖4和圖5。由圖中可以看出，包含交聯酶聚集體的凝膠顆粒明顯比含游離酶(不含交聯酶聚集體)的凝膠顆粒對Cr (VI)抑制作用具有更強的抵抗能力。即使在180mg/L高濃度Cr (VI)條件下,該發明的新型共固定化白腐菌凝膠顆粒均能對酸性大紅GR依然能維持50%左右的脫色降解度。
【權利要求】
1.一種新型共固定化白腐菌凝膠顆粒，其特征在于，是通過以下步驟制備得到: O白腐菌A胞外酶交聯聚集體的制備:白腐菌A在培養液中培養10-20天后，收集培養液，透析去除無機離子，濃縮，制得粗酶液，粗酶液中加入硫酸銨，攪拌，得反應液；向反應液中滴加濃度為25%的戊二醛，在恒溫震蕩條件下交聯，離心，蒸餾水洗滌沉淀，制備得酶交聯聚集體，加入蒸餾水制得酶聚集體懸浮液； 2)白腐菌B細胞勻漿的制備:白腐菌B在培養液中培養3-10天，濾布收集菌絲，置于蒸餾水中，玻璃珠打散菌絲，制得白腐菌B的細胞勻漿； 3)共固定化凝膠顆粒的制備:將步驟I)制得的酶聚集體懸浮液和步驟2)制得的白腐菌B的細胞勻漿混合，得混合物；向混合物中加入海藻酸鈉，制得均勻混合物，將均勻混合物滴入2%的CaCl2溶液中，室溫靜置固定，將所得顆粒物用蒸餾水洗滌，制得新型共固定化白腐菌凝膠顆粒。
2.根據權利要求1所述的白腐菌凝膠顆粒，其特征在于，所述培養液的組分:2g/LKH2PO4^0.25 g/L MgSO4、0.1 g/L CaCl2,5 mg/L MnSO4,5 mg/L VB1、0.2 g/L 酒石酸銨、20g/L葡萄糖和150 mL/L微量元素儲備液。
3.根據權利要求2所述的白腐菌凝膠顆粒，其特征在于，所述微量元素儲備液的組分:NaCll.0g/L, MgSO4*7H20 3.0g/L、FeS04*7H20 lOOmg/L, CoSO4*7H20 100mg/L、CaCl2 10mg/L、ZnS04.7H20 100mg/L、CuS04.5H20 10mg/L、KAl (SO4) 2 100mg/L、H3BO3 1mgA^PNaMoO410mg/Lo
4.根據權利要求1所述的白腐菌凝膠顆粒，其特征在于，所述步驟I)中硫酸銨的加入量為粗酶液質量的60 %-90 %，攪拌10-60min。
5.根據權利要求1所述的白腐菌凝膠顆粒，其特征在于，所述步驟I)中戊二醛在反應液中的質量濃度為0.2-0.4%，交聯溫度為20-30°C，交聯的震蕩頻率為100 rpm，交聯時間為20-30 h,離心速度為14000r/min,離心時間為1min0
6.根據權利要求1所述的白腐菌凝膠顆粒，其特征在于，所述步驟3)中均勻混合物的木素降解胞外酶系總酶活大于50 U/mL，其包含的菌絲細胞干重大于5 mg/mL。
7.根據權利要求1所述的白腐菌凝膠顆粒，其特征在于，所述步驟3)中海藻酸鈉在混合物中的質量濃度為2%，固定時間為1-3 h。
【文檔編號】C12N11/10GK104498470SQ201510022825
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月16日 優先權日:2015年1月16日
【發明者】李彥春, 鄭力文 申請人:齊魯工業大學