技術領域：
：本發明屬于畜禽飼料領域，涉及一種益生菌發酵飼料及其制備方法和應用。
背景技術：
：：隨著我國畜禽養殖業的快速發展以及人們對于生活品質要求的不斷提升,畜禽產品的品質越來越多地受到關注,而飼料的品質直接決定著畜禽產品的品質。近年來，歐美發達國家大力推廣發酵飼料在養殖中的應用，我國也有部分養殖場開始認可和接受使用發酵飼料代替傳統飼料。簡而言之，發酵飼料是傳統飼料經過益生菌發酵后的產品。相比傳統飼料，發酵飼料具有明顯的優勢：益生菌可以利用飼料中的蛋白質、脂肪和多糖等大分子，將其降解成更利于動物吸收的小分子物質，提高了營養物質的利用率；芽孢桿菌發酵產生的細菌素能夠抑制有害細菌的生長；乳酸菌發酵產生有機酸除了有抑菌作用外，還能提高飼料的適口性；酵母菌發酵過程中產生大量蛋白質和維生素，給動物提供更為充足的營養。由于發酵飼料具有以上傳統飼料不具備的優點,在未來的養殖業中有巨大的應用前景。技術實現要素：：（一）發明目的：本發明的目的是提供一種益生菌發酵飼料及其制備方法和應用，制備的發酵飼料適口性好，有助于提高豬的采食量和飼料利用率，增強豬的抗病能力，促進豬的生長和健康。（二）技術方案：本發明的目的通過如下方案獲得實現：1.本發明提供了一種益生菌發酵飼料，由混合益生菌活菌及其代謝產物和無抗生素的發酵全價飼料組成，含水量為35%-50%，發酵飼料的活菌數最高可達1.21×1010cfu/g，ph為4.2-4.8；上述混合益生菌包括枯草芽孢桿菌wei-2（cgmccno.7744）、屎腸球菌wei-10（cgmccno.7746）、植物乳桿菌wei-70（cgmccno.11747）和釀酒酵母wj-113。其中枯草芽孢桿菌wei-2（cgmccno.7744）記載在申請號為201310719942.0的專利申請文件中；屎腸球菌wei-10（cgmccno.7746）記載在申請號為201310719899.8的專利申請文件中；飼用植物乳菌植物乳桿菌lactobacillusplantarum已于2015年11月26日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為cgmccno.11747，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所郵編:100101電話：86-10-64807596；釀酒酵母為按照申請號為200510010940.x的專利申請文件公開的方法進行分離篩選得到，并命名為釀酒酵母wj-113。2.本發明提供了一種益生菌發酵飼料的制備方法，制備方法包括：混合益生菌發酵液的制備和益生菌發酵飼料的制備，分別按以下步驟進行：（1）益生菌的培養。采用各菌株分別發酵培養的方法：枯草芽孢桿菌wei-2cgmccno.7744：lb培養基，30-40℃，160-180rpm，培養12-18h。lb培養基配方如下：tryptone10g/l，yeastextract5g/l，氯化鈉10g/l，ph7.2，121℃滅菌20min。屎腸球菌wei-10cgmccno.7746：屎腸球菌發酵培養基，35-42℃，靜置培養8-12h。屎腸球菌發酵培養基如下：蔗糖14-21g/l，蛋白胨14-21g/l，檸檬酸三銨1-3g/l，三水合乙酸鈉3-7g/l，七水合硫酸鎂0.1-0.4g/l，一水合硫酸錳0.02-0.07g/l，三水合磷酸氫二鉀1-3g/l，吐溫-801-3g/l，ph8.0，121℃滅菌20min。植物乳桿菌wei-70（cgmccno.11747）：植物乳桿菌發酵培養基，30-40℃，靜置培養16-20h。植物乳桿菌發酵培養基配方如下：麥芽糊精15-25g/l、玉米漿粉30-40g/l，三水合乙酸鈉2-5g/l，三水合磷酸氫二鉀2-4g/l，檸檬酸銨1-4g/l，七水合硫酸鎂0.2-1g/l，一水合硫酸錳0.05-0.2g/l、吐溫800.5-2g/l，ph6.5，121℃滅菌20min。釀酒酵母菌wj-113：ypd培養基，28-32℃，190-220rpm，培養18-20h。ypd培養基配方如下：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，自然ph。，115℃滅菌20min。（2）混合菌發酵液的制備。將分別培養的四種菌液按照（1-3）：（1-3）：（1-3）：（1-3）的比例充分混合，制成混合益生菌發酵液。（3）益生菌發酵飼料的制備。將無抗生素的全價料放入干凈的容器中，加入混合益生菌發酵液，二者的比例為菌液：全價料=（3.5-5.0）：10，最終的含水量為35%-45%，攪拌混勻。蓋蓋，密封。發酵時環境溫度為25-40℃，發酵時間為24-30h。發酵后的全價料的活菌數最高可達1.21×1010cfu/g，含水量為35%-50%，ph為4.2-4.8，有濃郁的醇香味。（4）益生菌發酵飼料的應用。制好的發酵飼料可用于直接飼喂或者以5-10%的比例添加至日糧中飼喂斷奶仔豬和育肥豬。發酵飼料的適口性好，營養豐富，飼喂后豬的采食量增加，料肉比顯著下降，腸道菌群得到顯著改善，腹瀉率降低，健康水平提高。（三）意義：本發明提供的一種益生菌發酵飼料，是全價料經過4種益生菌混合發酵制成，有效活菌數高，適口性好，適用于各個生長階段的豬，尤其適用斷奶仔豬和育肥豬，能夠顯著降低料肉比，降低腹瀉率，改善腸道菌群。本發明提供的發酵工藝，周期短，對設備依賴性低，適用于各種規模的豬場，利于推廣。具體實施方式:以下實例是為了更好地解釋本發明，但本發明絕不僅限于以下實例所述的范圍。實驗案例一、用于發酵飼料的益生菌的培養：本發明中用于發酵飼料的4種益生菌采用分別培養的方法，具體如下：枯草芽孢桿菌wei-2cgmccno.7744：從新鮮活化的枯草芽孢桿菌斜面上接種至lb培養基，37℃，180rpm，培養16h，活菌數可達9.8×108cfu/ml。lb培養基配方如下：tryptone10g/l，yeastextract5g/l，氯化鈉10g/l，ph7.2,121℃滅菌20min。屎腸球菌wei-10cgmccno.7746：從新鮮活化的屎腸球菌斜面上接種至屎腸球菌發酵培養基，40℃，靜置培養10h,活菌數可達2.31×109cfu/ml。屎腸球菌發酵培養基如下：蔗糖14-21g/l，蛋白胨14-21g/l，檸檬酸三銨1-3g/l，三水合乙酸鈉3-7g/l，七水合硫酸鎂0.1-0.4g/l，一水合硫酸錳0.02-0.07g/l，三水合磷酸氫二鉀1-3g/l，吐溫-801-3g/l，ph8.0，121℃滅菌20min。植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747：從新鮮活化的植物乳桿菌斜面上接種至植物乳桿菌發酵培養基，37℃，靜置培養18h,活菌數可達2.12×109cfu/ml。植物乳桿菌發酵培養基配方如下：麥芽糊精15-25g/l、玉米漿粉30-40g/l，三水合乙酸鈉2-5g/l，三水合磷酸氫二鉀2-4g/l，檸檬酸銨1-4g/l，七水合硫酸鎂0.2-1g/l，一水合硫酸錳0.05-0.2g/l、吐溫800.5-2g/l，ph6.5，121℃滅菌20min。釀酒酵母菌wj-113：從新鮮活化的釀酒酵母斜面上接種至ypd培養基，30℃，200rpm，培養20h,活菌數可達3.60×108cfu/ml。ypd培養基配方如下：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，自然ph,115℃滅菌20min。實驗案例二、益生菌發酵飼料的制備：將培養好的枯草芽孢桿菌wei-2cgmccno.7744、屎腸球菌wei-10cgmccno.7746、植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747和釀酒酵母菌wj-113培養液按1：1：1：1的比例混合均勻，制成混合益生菌發酵液。將培養好的枯草芽孢桿菌wei-2cgmccno.7744、屎腸球菌wei-10cgmccno.7746、植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747和釀酒酵母菌wj-113培養液按2：1：2：1的比例混合均勻，制成混合益生菌發酵液。將培養好的枯草芽孢桿菌wei-2cgmccno.7744、屎腸球菌wei-10cgmccno.7746、植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747和釀酒酵母菌wj-113培養液按3：2：2：3的比例混合均勻，制成混合益生菌發酵液。將培養好的枯草芽孢桿菌wei-2cgmccno.7744、屎腸球菌wei-10cgmccno.7746、植物乳桿菌wei-70cgmccno.11747和釀酒酵母菌wj-113培養液按1：2：3：2的比例混合均勻，制成混合益生菌發酵液。稱取一定量的無抗生素的全價飼料，裝入干凈的容器中，加入混合益生菌發酵液，全價飼料與發酵液的質量比例為10：3.5~5.0，充分攪拌混合，塑料布封口，37℃發酵24h。發酵結束后檢測發酵飼料的含水量為39.2%；細菌總數為1.03×1010cfu/g，ph為4.4。實驗案例三、益生菌發酵飼料對斷奶仔豬腸道菌群和生長性能的影響。選取體重相近的54頭28日齡的斷奶仔豬，隨機分為2組，每組3個重復，每個重復6頭豬，公母各半。第一組為對照組（c），飼喂無抗生素的斷奶仔豬全價料；第二組為益生菌發酵飼料組（ff），飼喂經4種益生菌發酵的無抗斷奶仔豬全價料。斷奶仔豬用無抗生素的全價料預飼七天后，按上述分組分別飼喂不同日糧開始正式實驗。實驗期共1個月，全程自由采食飲水。實驗開始及結束分別采集糞便樣品，檢測糞便中的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌落數；計算統計料肉比和腹瀉率。菌落計數采用梯度稀釋后涂布于選擇性培養基的方法，大腸桿菌選擇性培養劑為麥康凱瓊脂，沙門氏菌選擇性培養基為ss瓊脂，金黃色葡萄球菌選擇性培養基為高鹽甘露醇瓊脂。飼喂實驗結果表明，益生菌發酵飼料組的料肉比和腹瀉率均顯著低于對照組（表1）。在腸道條件致病菌群的檢測中，對照組的腸道條件致病菌在飼喂前后基本無變化；飼喂益生菌發酵飼料的豬糞便中的條件致病菌比飼喂之前下降了15倍（表2）。表1.益生菌發酵飼料對斷奶仔豬生長性能的影響表2.益生菌發酵飼料對斷奶仔豬腸道條件致病菌的影響實驗案例四、益生菌發酵飼料對育肥豬腸道菌群和生長性能的影響。選取體重相近的54頭平均體重63.10±0.13kg的育肥豬，隨機分為2組，每組3個重復，每個重復6頭豬，公母各半。第一組為對照組（c），飼喂無抗生素的全價料；第二組為益生菌發酵飼料組（ff）,飼喂經4種益生菌發酵的無抗全價料。育肥豬用無抗生素的全價料預飼七天后，按上述分組分別飼喂不同日糧開始正式實驗。實驗期共1個月，全程自由采食飲水。實驗開始及結束分別采集糞便樣品，檢測糞便中的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌落數；計算統計料肉比和腹瀉率。菌落計數采用梯度稀釋后涂布于選擇性培養基的方法，大腸桿菌選擇性培養劑為麥康凱瓊脂，沙門氏菌選擇性培養基為ss瓊脂，金黃色葡萄球菌選擇性培養基為高鹽甘露醇瓊脂。飼喂實驗結果表明，益生菌發酵飼料組的料肉比顯著低于對照組,益生菌發酵飼料組的腹瀉率顯著低于對照組（表3）。在腸道條件致病菌群的檢測中，對照組的腸道條件致病菌在飼喂前后基本無變化；飼喂益生菌發酵飼料的豬糞便中的條件致病菌比飼喂之前下降了18倍（表4）。表3.益生菌發酵飼料對育肥豬生長性能的影響表4.益生菌發酵飼料對育肥豬腸道條件致病菌的影響實驗案例五、益生菌發酵飼料按10%添加量與基礎日糧混合后對斷奶仔豬腸道菌群和生長性能的影響。選取體重相近的54頭28日齡的斷奶仔豬，隨機分為2組，每組3個重復，每個重復6頭豬，公母各半。第一組為對照組（c），飼喂無抗生素的斷奶仔豬全價料；第二組為益生菌發酵飼料組（ff）,將4種益生菌發酵的無抗斷奶仔豬全價料按照10%的添加量與斷奶仔豬的基礎日糧混合后飼喂斷奶仔豬。斷奶仔豬用無抗生素的全價料預飼七天后，按上述分組分別飼喂不同日糧開始正式實驗。實驗期共1個月，全程自由采食飲水。實驗開始及結束分別采集糞便樣品，檢測糞便中的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌落數；計算統計料肉比和腹瀉率。菌落計數采用梯度稀釋后涂布于選擇性培養基的方法，大腸桿菌選擇性培養劑為麥康凱瓊脂，沙門氏菌選擇性培養基為ss瓊脂，金黃色葡萄球菌選擇性培養基為高鹽甘露醇瓊脂。飼喂實驗結果表明，益生菌發酵飼料組的料肉比和腹瀉率均顯著低于對照組（表5）。在腸道條件致病菌群的檢測中，對照組的腸道條件致病菌在飼喂前后基本無變化；飼喂益生菌發酵飼料的豬糞便中的條件致病菌比飼喂之前下降了10倍（表6）。表5.益生菌發酵飼料（10%添加）對斷奶仔豬生長性能的影響表6.益生菌發酵飼料（10%添加）對斷奶仔豬腸道條件致病菌的影響實驗案例六、益生菌發酵飼料按10%添加量與基礎日糧混合后對育肥豬腸道菌群和生長性能的影響。選取體重相近的54頭平均體重63.10±0.13kg的育肥豬，隨機分為2組，每組3個重復，每個重復6頭豬，公母各半。第一組為對照組（c），飼喂無抗生素的全價料；第二組為益生菌發酵飼料組（ff）,將4種益生菌發酵的無抗育肥豬全價料按照10%的添加量與育肥豬基礎日糧混合后飼喂育肥豬。育肥豬用無抗生素的全價料預飼七天后，按上述分組分別飼喂不同日糧開始正式實驗。實驗期共1個月，全程自由采食飲水。實驗開始及結束分別采集糞便樣品，檢測糞便中的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌落數；計算統計料肉比和腹瀉率。菌落計數采用梯度稀釋后涂布于選擇性培養基的方法，大腸桿菌選擇性培養劑為麥康凱瓊脂，沙門氏菌選擇性培養基為ss瓊脂，金黃色葡萄球菌選擇性培養基為高鹽甘露醇瓊脂。飼喂實驗結果表明，益生菌發酵飼料組的料肉比顯著低于對照組,兩組的腹瀉率無顯著差異（表7）。在腸道條件致病菌群的檢測中，對照組的腸道條件致病菌在飼喂前后基本無變化；飼喂益生菌發酵飼料的豬糞便中的條件致病菌比飼喂之前下降了19倍（表8）。表7.益生菌發酵飼料（10%添加）對育肥豬生長性能的影響c組ff組料肉比3.52±0.03a3.23±0.01b腹瀉率（%）2.10±0.02a2.09±0.03a表8.益生菌發酵飼料（10%添加）對育肥豬腸道條件致病菌的影響當前第1頁12