本發(fā)明屬于水產(chǎn)食品精深加工領(lǐng)域，涉及鮑魚內(nèi)臟有效成分的提取，特別涉及一種高壓脈沖電場(chǎng)偶聯(lián)生物酶解制備鮑魚內(nèi)臟磷脂的方法，同時(shí)得到蛋白、多糖和色素。

背景技術(shù)：

鮑魚（abalone）又名鰒、鰒魚，是種單殼軟體具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的海洋貝類。每1000 g新鮮鮑肉中含蛋白質(zhì)350~500 g、碳水化合物240~380 g、脂質(zhì)80~220 g，并含有多種的維生素與微量元素。《本草綱目》中記載，鮑魚性平，味甘、咸，有明目補(bǔ)虛、清熱滋陰、養(yǎng)血益胃、滋補(bǔ)肝腎的作用，是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值的海產(chǎn)品之一。

2011年我國(guó)的鮑魚年產(chǎn)量達(dá)到6.5萬(wàn)噸，2015年達(dá)到12.8萬(wàn)噸，鮑魚產(chǎn)業(yè)增長(zhǎng)迅猛。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)的鮑魚深加工與使用大部分以腹足為主，在加工過(guò)程中，占鮑魚總重量約25%左右的內(nèi)臟被丟棄，極少部分被加工成飼料。鮑魚內(nèi)臟中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和維生素等營(yíng)養(yǎng)素及一些生物活性物質(zhì)，大量的鮑魚內(nèi)臟被丟棄，得不到充分利用，不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，而且給環(huán)境帶來(lái)污染。

目前對(duì)鮑魚內(nèi)臟的研究主要集中在牲畜飼料的加工，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值的開發(fā)較少。鮑魚內(nèi)臟中含較多磷脂，能顯著提高人體免疫力、提高大腦活力，并且能有效防治高血脂、高血壓等心腦血管疾病；鮑魚內(nèi)臟中的多糖具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫等活性；鮑魚內(nèi)臟中的膠原蛋白具有良好的降血壓功能、預(yù)防關(guān)節(jié)炎功能、保護(hù)胃粘膜以及促進(jìn)皮膚膠原代謝等功能；因此，鮑魚內(nèi)臟具有很強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)、藥用開發(fā)價(jià)值與潛力。

公開號(hào)為CN 101912027A的發(fā)明專利“一種復(fù)合酶解鮑魚內(nèi)臟制備蛋白水解液的方法”公開了一種以鮑魚內(nèi)臟為原料，通過(guò)堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的復(fù)合酶解、乙基麥芽酚屏蔽苦味等技術(shù)制備了蛋白水解液。該發(fā)明制備的蛋白質(zhì)水解液富含氨基酸、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味鮮美，但僅對(duì)鮑魚內(nèi)臟中單一成分進(jìn)行利用，未能顯著提高鮑魚內(nèi)臟的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。公開號(hào)為CN 103255186A的發(fā)明專利“鮑魚多糖、脂質(zhì)和蛋白肽的聯(lián)產(chǎn)制備方法”，是以鮑魚內(nèi)臟為原料，通過(guò)復(fù)合酶解、膜分離、醇沉等手段提取制備鮑魚多糖、脂質(zhì)和蛋白肽，改進(jìn)了傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)原料利用不充分的缺點(diǎn)，但制備得到的組分較為單一，純度不高，脂質(zhì)與蛋白多肽尚未完全分離，制備效率低，且未能充分利用鮑魚內(nèi)臟殘?jiān)蛔阋宰畲蠡瘜?shí)現(xiàn)鮑魚內(nèi)臟的高值化利用，造成一定程度的資源浪費(fèi)。

高壓脈沖電場(chǎng)（Pulsed Electric Field，簡(jiǎn)稱PEF），PEF技術(shù)能增加細(xì)胞滲透性，提高被提取物質(zhì)的溶出，偶聯(lián)生物酶解可有效提高鮑魚內(nèi)臟有效成分溶物，增加其有效利用率。因此，PEF偶聯(lián)生物酶解技術(shù)開發(fā)一種鮑魚內(nèi)臟磷脂提取與綜合利用的方法，不僅能制備鮑魚內(nèi)臟磷脂，同時(shí)得到鮑魚內(nèi)臟中性磷脂、糖脂、色素、蛋白、粗多糖等單一成分，且有效解決鮑魚內(nèi)臟殘?jiān)膯?wèn)題，提高鮑魚內(nèi)臟活性成分的制備率，實(shí)現(xiàn)鮑魚內(nèi)臟的高值化利用，減少環(huán)境污染、節(jié)約加工成本，同時(shí)實(shí)現(xiàn)鮑魚內(nèi)臟的回收利用，大大提高鮑魚加工業(yè)的產(chǎn)值，從而帶動(dòng)與促進(jìn)海產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題提供一種鮑魚內(nèi)臟磷脂提取和綜合利用的方法，本方法以鮑魚加工過(guò)程中的副產(chǎn)物——鮑魚內(nèi)臟為原料，主要通過(guò)PEF偶聯(lián)生物酶解技術(shù)制備鮑魚內(nèi)臟中磷脂，同時(shí)得到蛋白、多糖和糖脂等單一組分，并解決鮑魚殘?jiān)膯?wèn)題。以解決上述技術(shù)存在的問(wèn)題并實(shí)現(xiàn)鮑魚產(chǎn)業(yè)的高值化利用，從而減少鮑魚副產(chǎn)物的資源浪費(fèi)，提高鮑魚加工業(yè)的附加值，實(shí)現(xiàn)資源的回收利用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鮑魚內(nèi)臟磷脂提取與綜合利用的方法，主要包括以下步驟：

1）原理預(yù)處理：將清洗干凈的鮑魚內(nèi)臟按固液重量比1：5~1：10加入蒸餾水，并用高速組織搗碎機(jī)，轉(zhuǎn)速10000r/min將其打漿；

2）PEF與酶解：絞成漿后的鮑魚內(nèi)臟置于配料缸，進(jìn)行15~20 min的高壓脈沖電場(chǎng)處理；用0.2 M PBS緩沖溶液調(diào)pH至5.5~8.0，加入復(fù)合蛋白酶，40~55 ℃酶解1~3 h，90℃滅酶10~20 min；4000 rpm離心10~20 min收集鮑魚內(nèi)臟提取物的上清液A，不溶物經(jīng)60~70 ℃的熱風(fēng)干燥加工成適宜牲畜飼料；

3）脂質(zhì)提取：用正己烷浸提2）收集到的上清液A，萃取得到鮑魚總脂和水溶液B；總脂用3~6倍體積丙酮洗滌，得到丙酮不溶物用少量甲醇溶解，-20 ℃?zhèn)溆茫?/p>

4）磷脂分離：將3）提取到的丙酮不溶物裝入制備硅膠層析柱，分別用8~12倍體積的氯仿、丙酮和甲醇沖洗，收集洗脫液，進(jìn)行旋蒸；

5）蛋白分離：調(diào)節(jié)步驟3）收集到的水溶液B的pH至5.0~5.5，4000 rpm離心10-20 min沉淀蛋白，冷凍干燥，備用；收集上清液C；

6）鮑魚多糖提取：將步驟5）獲得的上清液C濃縮，按3-8倍體積加入95wt%乙醇，4 ℃下沉淀10~12 h，4000 rpm離心10~20 min獲得多糖沉淀；將多糖重新溶解于蒸餾水，95wt%乙醇反復(fù)醇沉3-5次，收集沉淀物，冷凍干燥得到鮑魚多糖；

所述PEF處理參數(shù)：電場(chǎng)強(qiáng)度20~40 KV/cm，脈沖時(shí)間350~450μS，脈沖頻率200-400Hz；

所述復(fù)合蛋白酶：AS.1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的一種或多種組合，總添加量為原料重量的0.1~1%；

所述磷脂分離是在步驟3）中經(jīng)萃取得到鮑魚內(nèi)臟總脂，以甲醇為洗脫液經(jīng)硅膠柱層析分離得到磷脂，同時(shí)使用氯仿、丙酮作為洗脫液，得到中性脂肪、糖脂和色素；

所述工藝步驟在PEF處理后，鮑魚內(nèi)臟遭到不可逆破壞，細(xì)胞通透性增大，內(nèi)容物溶出；經(jīng)蛋白生物酶解，硅膠柱層析技術(shù)可得到純度較高的磷脂，同時(shí)還制備得到鮑魚內(nèi)臟的中性脂肪、糖脂和色素；經(jīng)過(guò)蛋白析出、多糖醇沉可分離得到鮑魚內(nèi)臟粗蛋白和多糖，有效提高鮑魚內(nèi)臟提取物得率；

所述工藝步驟制備得到鮑魚內(nèi)臟磷脂、糖脂、色素蛋白、多糖和磷脂或其中的任意一個(gè)產(chǎn)品，并將鮑魚內(nèi)臟殘?jiān)庸こ蛇m宜牲畜食用的飼料。

上述分步制備鮑魚內(nèi)臟磷脂與鮑魚內(nèi)臟的綜合利用，采用PEF偶聯(lián)生物酶解技術(shù)，通過(guò)硅膠柱層析制備鮑魚內(nèi)臟磷脂，同時(shí)得到糖脂和色素等；鮑魚蛋白通過(guò)等電點(diǎn)沉淀析出、多糖醇沉得到鮑魚內(nèi)臟蛋白、粗多糖，相比于現(xiàn)有鮑魚加工業(yè)技術(shù)至少具有下列有點(diǎn)：

1. 該發(fā)明利用PEF偶聯(lián)生物酶解技術(shù)、硅膠柱層析制備技術(shù)等實(shí)現(xiàn)了鮑魚內(nèi)臟中磷脂、蛋白和多糖等多種單一組分的高效提取，減少鮑魚加工過(guò)程中副產(chǎn)物的排放，提高制備效率，實(shí)現(xiàn)節(jié)約成本、節(jié)省能耗，提高鮑魚的附加值；

2. 該發(fā)明綠色加工技術(shù)，制備得到的鮑魚內(nèi)臟磷脂、蛋白、多糖和色素等來(lái)源安全、無(wú)毒，無(wú)化學(xué)試劑的污染，符合國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)，可廣泛應(yīng)用于食品加工中的功能性食品以及藥用加工等領(lǐng)域；

3. 該發(fā)明不僅解決鮑魚內(nèi)臟中營(yíng)養(yǎng)與藥用成分的提取，且將鮑魚不溶物經(jīng)60~70 ℃熱風(fēng)干燥加工成適宜牲畜食用的飼料，形成較為完整的生產(chǎn)體系，易產(chǎn)業(yè)化；

4. 該發(fā)明可有效應(yīng)用于鮑魚加工業(yè)中副產(chǎn)物的回收利用，可形成鮑魚內(nèi)臟副產(chǎn)物的加工生產(chǎn)線，提高產(chǎn)業(yè)附加值，帶動(dòng)海產(chǎn)品加工業(yè)大發(fā)展；

5. 該發(fā)明實(shí)現(xiàn)副產(chǎn)物鮑魚內(nèi)臟廢物資源化，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)工藝條件較易控制，具有良好的實(shí)用性和應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明PEF與生物酶解偶聯(lián)方法制備鮑魚內(nèi)臟磷脂的工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但以下實(shí)施例僅屬于本發(fā)明范疇，卻并不局限于此。

實(shí)施例1

一種PEF與生物酶解偶聯(lián)制備鮑魚內(nèi)臟磷脂的方法包括以下步驟：

1）原理預(yù)處理：將500 g清洗干凈的鮑魚內(nèi)臟按1：5的固液重量比比加入蒸餾水，并用高速組織搗碎機(jī)，轉(zhuǎn)速10000r/min將其打漿；

2）PEF與酶解：絞成漿后的鮑魚內(nèi)臟置于配料缸，進(jìn)行17 min的高壓脈沖電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度30 KV/cm，脈沖時(shí)間378 μS，脈沖頻率296 Hz；然后用0.2 M PBS緩沖溶液調(diào)pH至6.8，加入比例為AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：1：1的復(fù)合蛋白酶3 g，在45 ℃下酶解2 h，90 ℃滅酶15 min；4000 rpm離心13 min收集鮑魚內(nèi)臟提取物的上清液A 2255 mL，不溶物經(jīng)65 ℃的熱風(fēng)干燥加工成適宜牲畜食用的飼料 251 g；

3）磷脂提取：將步驟2）收集到的上清液A靜置12 h，萃取上層油狀液體，得到鮑魚總脂質(zhì)83 g；用200 mL丙酮洗滌得到丙酮不溶物43 g，用10ml甲醇溶解丙酮不溶物，然后分別以100 mL甲醇、100 mL氯仿、100 mL丙酮為洗脫液通過(guò)硅膠層析柱制備得到16.6 g磷脂、19.1 g糖脂和0.92 g色素；

4）蛋白質(zhì)分離：將步驟3）萃取去總脂質(zhì)后的水溶液B調(diào)節(jié)pH至5.17，4000 rpm離心15 min收集上清液C 1762 mL；沉淀通過(guò)冷凍干燥，得到白色蛋白118 g；

5）鮑魚多糖提取：將步驟4）獲得的上清液C濃縮至500 mL，按4倍體積加入95wt%乙醇，4 ℃下沉淀11 h，4000 rpm離心15 min獲得多糖沉淀，將初次醇沉得到的多糖重新溶解于200 mL蒸餾水，加入500 mL 95wt%乙醇反復(fù)醇沉3次，收集沉淀物，冷凍干燥得到鮑魚多糖103 g；

鮑魚內(nèi)臟含有約蛋白350~500 g、碳水化合物240~380 g、脂質(zhì)80~220 g。通過(guò)PEF偶聯(lián)生物酶解技術(shù)提取鮑魚內(nèi)臟活性成分，可依次提取到磷脂16.6 g，19.1 g糖脂和0.92 g色素，蛋白118 g，多糖103 g，說(shuō)明一種鮑魚內(nèi)臟磷脂提取與綜合利用的方法能有效提取鮑魚內(nèi)臟活性成分。

實(shí)施例2

一種PEF與生物酶解偶聯(lián)制備鮑魚內(nèi)臟磷脂的方法包括以下步驟：

1）原理預(yù)處理：將500 g清洗干凈的鮑魚內(nèi)臟按加入4000 mL蒸餾水，并用高速組織搗碎機(jī)，轉(zhuǎn)速10000r/min將其打漿；

2）PEF與酶解：絞成漿后的鮑魚內(nèi)臟置于配料缸，進(jìn)行20 min的高壓脈沖電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度34 KV/cm，脈沖時(shí)間450 μS，脈沖頻率312 Hz；然后用0.2 M PBS緩沖溶液調(diào)pH至6.3，加入比例為AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：0.5：0.8的復(fù)合蛋白酶5 g，在45 ℃下酶解2.5 h，90 ℃滅酶15 min；4000 rpm離心15 min收集鮑魚內(nèi)臟提取物的上清液A 3180 mL，不溶物經(jīng)65 ℃的熱風(fēng)干燥加工成適宜牲畜食用的飼料 293 g；

3）磷脂提取：將步驟2）收集的上清液A靜置15 h，萃取上層油狀液體，得到鮑魚總脂質(zhì)76.5 g；用350 mL丙酮洗滌得到丙酮不溶物41.6 g，用15ml甲醇溶解丙酮不溶物，然后分別以150 mL甲醇、150 mL氯仿、150 mL丙酮為洗脫液通過(guò)硅膠層析柱制備得到16.1 g磷脂、17.8 g糖脂和0.85 g色素；

4）蛋白質(zhì)分離：將步驟3）萃取去總脂質(zhì)的上清液B調(diào)節(jié)pH至5.17，4000 rpm離心15 min收集上清液C 3310 mL；沉淀通過(guò)冷凍干燥，得到白色蛋白112 g；

5）鮑魚多糖提取：將步驟4）獲得的上清液C濃縮至500 mL，加入3000 mL 95wt%乙醇，4 ℃下沉淀13 h，4000 rpm離心15 min獲得鮑魚內(nèi)臟粗多糖；將初次醇沉得到的粗多糖重新溶解于150 mL蒸餾水，加入450 mL 95wt%乙醇反復(fù)醇沉5次，收集沉淀物，冷凍干燥得到鮑魚多糖107 g；

分別稱取500 g清洗干凈的鮑魚內(nèi)臟按加入4000 mL蒸餾水，并用高速組織搗碎機(jī)，轉(zhuǎn)速10000r/min將其打漿。① 將漿體靜置2.5 h，抽濾除去鮑魚內(nèi)臟水不溶物，并將其進(jìn)行熱風(fēng)干燥；濾液操作與本實(shí)施例2的步驟（3）~（5）一致；② 將漿體置于功率350 W、頻率28 KHz、溫度45 ℃下超聲輔助提取10 min，并靜置2.67 h，抽濾除去鮑魚內(nèi)臟水不溶物，并將其進(jìn)行熱風(fēng)干燥；濾液操作與本實(shí)施例2的步驟（3）~（5）一致；③ 將漿體靜置十分鐘，然后用0.2 M PBS緩沖溶液調(diào)pH至6.3，加入比例為AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：0.5：0.8的復(fù)合蛋白酶6 g，45 ℃酶解2.5 h，90 ℃滅酶15 min；濾液操作與本實(shí)施例2的步驟（3）~（5）一致。分別根據(jù)①②③和PEF偶聯(lián)生物復(fù)合酶解技術(shù)提取鮑魚內(nèi)臟活性成分與鮑魚內(nèi)臟水不溶物，結(jié)果如表1所示。

表1 不同方法制備鮑魚內(nèi)臟活性成分對(duì)比

由表1可知，溶劑提取、超聲輔助提取以及生物酶解均能制備得到鮑魚內(nèi)臟活性成分。其中溶劑靜置提取磷脂、蛋白、多糖、糖脂和色素等提取率較低，大多只被加工成適宜牲畜食用的飼料；超聲輔助提取與生物酶解是提取工藝中常用方法，能在單一溶劑提取的基礎(chǔ)上顯著提高提取物質(zhì)的提取率，一定程度上解決鮑魚內(nèi)臟廢棄的問(wèn)題，節(jié)約了能耗。相比于單一的活性成分制備技術(shù)，PEF偶聯(lián)生物酶解技術(shù)最大程度利用了鮑魚內(nèi)臟的回收問(wèn)題，不僅提取到含量較多的鮑魚內(nèi)臟磷脂、蛋白、多糖、糖脂和色素，且對(duì)鮑魚內(nèi)臟水不溶物加工成適宜牲畜食用的飼料，既節(jié)省了能耗、實(shí)現(xiàn)資源的再度分配，且制備得到安全、無(wú)毒的鮑魚內(nèi)臟蛋白、多糖和磷脂等活性成分可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的生產(chǎn)加工中，如作為添加劑應(yīng)用于功能性食品加工，藥用物質(zhì)的開發(fā)等，極大提高鮑魚加工業(yè)的附加值，帶動(dòng)海產(chǎn)品加工的發(fā)展。

上述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，但本發(fā)明的設(shè)計(jì)與構(gòu)思并不局限于此。凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆屬于侵犯本發(fā)明范疇的行為。