本發明屬于生物制劑領域，尤其涉及一種兔用復合型合生元微生態制劑及其制備方法。
背景技術：
目前，我國合生元微生態制劑在動物的生產中的應用研究還較少，畜牧業動物食用添加劑中微生態制劑的使用情況還較少，人們對微生態制劑適用添加比較模糊，即混淆有針對性的添加對象，導致動物生長的效果往往低于預期效果。微生態制劑的出現是由于人們生活水平的提高，人們逐漸認識到抗生素長期添加于飼料中可通過食物鏈對人類的健康造成危害。微生態制劑的研究應用克服了長期使用抗生素給養殖業造成的種種弊端，對發展綠色飼料添加劑具有廣闊的應用前景，己被農業部列為二十一世紀重點推廣技術項目。這意味著對微生態制劑的研究、推廣符合我國可持續發展的總體要求。
現有的微生態制劑中菌株的穩定性沒有得到很好的保證，投給菌必須以活菌的形式通過胃到達腸道代謝，并定居在腸道內培殖，這對一般的孢子形式的細菌來說是不易做到的；微生態制劑沒有針對性的添加對象，國內對微生態制劑的應用還不夠充分，推廣度不夠，被養殖戶接受的程度不高為了解決濫用抗生素導致越來越多的致病菌產生抗藥性，藥物殘留，降低兔肉產品品質以及由于食物鏈累積對人類身體健康帶來的嚴重影響，生產替代抗生素的微生態制劑勢在必行。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種兔用復合型合生元微生態制劑及其制備方法，旨在解決目前動物用合生元微生態制劑吸收利用率低，應用效果差的問題。
本發明是這樣實現的，一種兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法，首先分別在不同的環境下篩選出腸道益生菌，通過對篩選出的腸道益生菌的功能和生物學特性比較，并且在模擬腸道環境下比較益生菌的活菌數變化，篩選出最佳的菌株，將各類低聚糖含量進行測定，選擇出最佳添加量，將腸道益生菌和低聚糖混合制成復合型合生元微生態制劑。本發明是這樣實現的，一種兔用復合型合生元微生態制劑，所述兔用復合型合生元微生態制劑由益生菌和益生元組成；
所述益生菌：益生元＝1:1～5的質量比比例混合。
進一步，所述益生菌由雙歧桿菌、芽孢桿菌和糞腸球菌組成(標準菌株均購自北京北納創聯生物技術研究院)。
進一步，所述益生元由低聚糖和酸化劑組成；
所述低聚糖為木寡糖、果寡糖，乳寡糖，L-阿拉伯糖，酸化劑由乳酸、檸檬酸、延胡索酸組成的復合酸化劑。
進一步，所述益生菌為0.02-15g/kg，益生菌營養物質為0.05-80g/kg，低聚糖為0.01-90g/kg。
進一步，低聚糖的添加量為木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；添加由1份乳酸、3份檸檬酸、1份延胡索酸組成的復合酸化劑0.1％-0.5％(占微生態制劑比例)。
本發明的另一目的在于提供一種所述兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
首先針對性的分離、篩選出腸道益生菌，通過在模擬腸道環境下比較益生菌的活菌數變化，篩選出最佳的菌株，將各類低聚糖含量進行測定，選擇出最佳添加量，將適合兔胃、腸道的益生菌和低聚糖混合制成復合型合生元微生態制劑。
進一步，兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法具體包括：
步驟一、從兔的養殖場內的土壤、喂養飼料槽、胃腸道區域分離篩選出糞腸球菌(糞鏈球菌)、枯草芽孢桿菌和雙歧桿菌，將分離得到的益生菌進行生物學特性、功能及安全性的鑒定，并進行體外益生效果評價，初步篩選益生菌；
步驟二、利用兔腸道微生物與糖代謝、維生素的關系，篩選出具有能提高能量的獲取和儲存、提高兔從日糧中獲取能量的能力的優質益生菌，利用益生菌在兔腸道中的提高能量的獲取和儲存、提高兔從日糧中獲取能量的能力，根據微生物技術指標篩選優質兔腸道益生菌；
步驟三、在人工模擬的兔胃腸道液中培養初步篩選后的益生菌，測定各類益生菌的活菌數，繁殖代數，進行更進一步的篩選，最終選取得到1株糞腸球菌(糞鏈球菌)、1株枯草芽孢桿菌和1株雙歧桿菌；
步驟四、根據益生菌的種類、各類益生元的功能特性以及與相應益生菌的利用程度選擇由低聚糖組成的益生元，得出各類低聚糖的最佳添加量為木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；
步驟五、向加入低聚糖后的益生菌中按照質量比0.1％-0.5％加入由3份重量的乳酸、1份重量的檸檬酸、1份延胡索酸組成的復合酸化劑；質量比0.1％-0.5％；
步驟六、將添加復合酸化劑后的3株益生菌與質量比5％的益生元(木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg)進行結合，配制出兔用復合型合生元微生態制劑。
進一步，步驟一中進行菌種的鑒定包括：
常規鑒定：芽孢桿菌繁殖快速，四小時增殖10萬倍，生命力強無濕狀態可耐低溫－60℃、耐高溫+280℃，耐強酸、耐強堿、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厭氧繁殖)。體積比一般病原菌分子大四倍數，占據空間優勢，抑制有害菌的生長繁殖。糞腸球菌為圓形或橢圓形、呈單個或成對或短鏈狀排列的革蘭陽性球菌，無芽胞，無鞭毛，為需氧或兼性厭氧菌。本菌對營養要求較高，要求高鹽(6.5％NaCl),高堿(pH9.6),40％膽汁培養基和10-45℃環境下生長。
將雙歧桿菌、芽孢桿菌和腸球菌益生菌和選擇出的益生元有機結合起來，再加入有利于益生菌生長的營養物質，制成復合型合生元微生態制劑。
營養物質：由于兔屬于哺乳類動物，所用稀釋生理鹽水與哺乳類、兩棲動物略有區別，一般NaCl濃度為0.9％，蛋白胨1-100g/kg、牛肉膏2-8g/kg、蔗糖1-50g/kg、酵母粉1-20g/kg、碘酸鉀1-3g/kg、磷酸二氫鈉0.5-2.5g/kg、硫酸鎂0.1-1g/kg、復合維生素0.01-10g/kg,、復合氨基酸0.01-10g/kg。
本發明的兔用復合型合生元微生態制劑及其制備方法，能避免單獨使用益生菌產品的弱點，相輔相成，揚長避短，促進了外源性益生菌在兔腸道的定植，并且選擇性刺激多種益生菌的生長和繁殖，從而達到促進動物健康的目的，減少了動物食用抗生素對兔肉質的影響，更加健康安全，無公害，不僅可以促進動物生長，還能提高飼料的轉化率、增加肉類品質和提高食品的安全質量，根據各類益生菌選擇出合適的益生元，解決了由傳統的抗生素而帶來的藥物殘留、產生抗藥性、動物腸道微生態平衡遭到破壞及降低肉制品質量等食品安全與質量問題。
本發明提供的兔用復合型合生元微生態制劑及其制備方法，解決了飼養商品兔單獨使用益生菌產品的弱點，并且適合于各類型商品兔，揚長避短，促進了外源性益生菌在動物腸道的定植，并且選擇性刺激多種益生菌的在兔只體內的迅速生長和繁殖，從而達到促進兔只健康的目的，其生產性能也得以極大提高，減少了傳統動物食用添加劑對兔肉的影響，更加經濟適用。目前對動物微生態制劑的作用機理了解程度還不夠全面，缺乏深層次的機理、機制研究，而本發明較清楚地闡述了該復合型微生態制劑的作用機理并且大膽采用了模擬動物腸道環境實驗，通過對篩選出的腸道益生菌的功能和生物學特性比較，在模擬腸道環境下比較益生菌的活菌數變化，篩選得到最佳的菌株；再將各類低聚糖含量進行了測定，選擇出最佳添加量，將腸道益生菌和低聚糖混合制成兔用復合型合生元微生態制劑。目前使用的抗生素替代品功能還比較單一，而本發明所得的復合型微生態制劑充分克服了這一缺點，通過將各種益生菌與益生元以最適的比例混合實現了調節動物腸道微生物平衡，維持腸道健康，刺激有益菌群的生長，競爭性抑制有害菌，最終達到促進動物的生長，提高兔只的免疫力以及生產性能，而且獲得的菌種能夠直接運用于發酵制備微生態制劑，無污染、無殘留。現有技術只是將益生菌與益生元簡單機械地混合，并沒有針對性，進而得到的復合型微生態制劑的效果不是很顯著，而本發明所得微生態制劑是將各種益生菌與益生元按照最佳的比例而制得的，很具針對性，效果也很明顯。
本發明兔用復合型合生元微生態制劑能夠調節兔腸道微生物平衡，維持腸道健康，刺激有益菌群的生長，競爭性抑制有害菌，最終達到促進兔的生長，提高兔的免疫力的目的；獲得的菌種能夠直接運用于發酵制備微生態制劑，無污染、無殘留，是現階段標準的綠色動物食用添加劑，滿足人們對食品的健康標準，符合日益提高的食品安全與質量要求；這種兔用復合型合生元微生態制劑在畜牧業中發揮著重要作用，不僅可以促進兔生長，還能提高飼料的轉化率，并且符合食品質量與安全的標準。
本發明為尋找替代傳統兔用食用添加劑，以用來解決畜牧行業面臨的因抗生素濫用造成的兔肉的安全性和品質的問題，提出一種兔用復合型合生元微生態制劑；旨在彌補將益生菌或益生元直接添加進入飼料中的不足和對兔肉品質的影響，能夠提高兔肉生產質量，且對畜牧產業動物傳統食用添加劑更新換代具有促進作用。
本發明涉及一種有益于兔生長、提高兔肉的復合型合生元微生態制劑；合生元微生態制劑作為一種新型、綠色的動物食用添加劑，主要作用是優化兔的腸道菌群，調節兔腸道微生物平衡，維持其腸道健康，利用低聚糖益生元刺激有益菌群的生長，競爭性抑制有害菌，最終達到促進兔的生長，提高動物機體對病原物質的抵抗力，調節機體免疫系統，從而提高動物的免疫力，達到提高兔肉的品質目的；本發明模擬腸道環境篩選出有益菌后，根據各類益生菌選擇出合適的益生元，如木寡糖、寡甘露糖、果寡糖等低聚糖,合成一種復合型合生元微生態制劑，為我國畜牧業解決新型動物食用添加劑以提供新的選擇，且解決了由傳統的抗生素而帶來的藥物殘留、產生抗藥性、動物腸道微生態平衡遭到破壞及降低肉制品質量等食品安全與質量問題。
附圖說明
圖1是本發明實施例提供的兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法流程圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
本發明實施例的兔用復合型合生元微生態制劑為益生菌、益生元；按照質量比所述益生菌(凍干粉)：益生元＝1:1～5的比例混合。
進一步，所述益生菌由雙歧桿菌、芽孢桿菌和糞腸球菌組成(標準菌株均購自北京北納創聯生物技術研究院)。
進一步，所述益生元由低聚糖和酸化劑組成；
所述低聚糖為木寡糖、果寡糖，乳寡糖，L-阿拉伯糖，酸化劑由乳酸、檸檬酸、延胡索酸組成的復合酸化劑。
進一步，所述益生菌為0.02-15g/kg，益生菌營養物質為0.05-80g/kg，低聚糖為0.01-90g/kg。
進一步，低聚糖的添加量為木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；添加由1份乳酸、3份檸檬酸、1份延胡索酸組成的復合酸化劑0.1％-0.5％(占微生態制劑比例)。
本發明的另一目的在于提供一種所述兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
首先針對性的分離、篩選出腸道益生菌，通過在模擬腸道環境下比較益生菌的活菌數變化，篩選出最佳的菌株，將各類低聚糖含量進行測定，選擇出最佳添加量，將適合兔胃、腸道的益生菌和低聚糖混合制成復合型合生元微生態制劑。
進一步，兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法具體包括：
步驟一、從兔的養殖場內的土壤、喂養飼料槽、胃腸道區域分離篩選出糞腸球菌(糞鏈球菌)、枯草芽孢桿菌和雙歧桿菌，將分離得到的益生菌進行生物學特性、功能及安全性的鑒定，并進行體外益生效果評價，初步篩選益生菌；
步驟二、利用兔腸道微生物與糖代謝、維生素的關系，篩選出具有能提高能量的獲取和儲存、提高兔從日糧中獲取能量的能力的優質益生菌，利用益生菌在兔腸道中的提高能量的獲取和儲存、提高兔從日糧中獲取能量的能力，根據微生物技術指標篩選優質兔腸道益生菌；
步驟三、在人工模擬的兔胃腸道液中培養初步篩選后的益生菌，測定各類益生菌的活菌數，繁殖代數，進行更進一步的篩選，最終選取得到1株糞腸球菌(糞鏈球菌)、1株枯草芽孢桿菌和1株雙歧桿菌；
步驟四、根據益生菌的種類、各類益生元的功能特性以及與相應益生菌的利用程度選擇由低聚糖組成的益生元，得出各類低聚糖的最佳添加量為木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；
步驟五、向加入低聚糖后的益生菌中按照質量比0.1％-0.5％加入由3份重量的乳酸、1份重量的檸檬酸、1份延胡索酸組成的復合酸化劑；質量比0.1％-0.5％
進一步，步驟一中進行菌種的鑒定包括：
常規鑒定：芽孢桿菌繁殖快速，四小時增殖10萬倍，生命力強無濕狀態可耐低溫－60℃、耐高溫+280℃，耐強酸、耐強堿、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厭氧繁殖)。體積比一般病原菌分子大四倍數，占據空間優勢，抑制有害菌的生長繁殖。糞腸球菌為圓形或橢圓形、呈單個或成對或短鏈狀排列的革蘭陽性球菌，無芽胞，無鞭毛，為需氧或兼性厭氧菌。本菌對營養要求較高，要求高鹽(6.5％NaCl),高堿(pH9.6),40％膽汁培養基和10-45℃環境下生長。
將雙歧桿菌、芽孢桿菌和腸球菌益生菌和選擇出的益生元有機結合起來，再加入有利于益生菌生長的營養物質，制成復合型合生元微生態制劑。
營養物質：由于兔屬于哺乳類動物，所用稀釋生理鹽水與哺乳類、兩棲動物略有區別，一般NaCl濃度為0.9％，蛋白胨1-100g/kg、牛肉膏2-8g/kg、蔗糖1-50g/kg、酵母粉1-20g/kg、碘酸鉀1-3g/kg、磷酸二氫鈉0.5-2.5g/kg、硫酸鎂0.1-1g/kg、復合維生素0.01-10g/kg,、復合氨基酸0.01-10g/kg。
為能進一步了解本發明的發明內容、特點及功效，茲例舉以下實施例，并配合附圖詳細說明如下：
請參閱圖1：
一種兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法，首先分別在不同的環境下篩選出腸道益生菌，通過對篩選出的腸道益生菌的功能和生物學特性比較，并且在模擬腸道環境下比較益生菌的活菌數變化，篩選出最佳的菌株，將各類低聚糖含量進行測定，選擇出最佳添加量，將腸道益生菌和低聚糖混合制成復合型合生元微生態制劑。
進一步，兔用復合型合生元微生態制劑的制備方法具體包括：
S101、從兔的養殖場內的土壤、喂養飼料槽、胃腸道區域分離篩選出糞腸球菌(糞鏈球菌)、枯草芽孢桿菌和雙歧桿菌，將分離得到的益生菌進行生物學特性、功能及安全性的鑒定，并進行體外益生效果評價，初步篩選益生菌；
S102、利用兔腸道微生物與糖代謝、維生素的關系，篩選出具有能提高能量的獲取和儲存、提高兔從日糧中獲取能量的能力的優質益生菌，利用益生菌在兔腸道中的提高能量的獲取和儲存、提高兔從日糧中獲取能量的能力，根據微生物技術指標篩選優質兔腸道益生菌；
S103、在人工模擬的兔胃腸道液中培養初步篩選后的益生菌，測定各類益生菌的活菌數，繁殖代數，進行更進一步的篩選，最終選取得到1株糞腸球菌(糞鏈球菌)、1株枯草芽孢桿菌和1株雙歧桿菌；
S104、根據益生菌的種類、各類益生元的功能特性以及與相應益生菌的利用程度選擇由低聚糖組成的益生元，得出各類低聚糖的最佳添加量為木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；
S105、向加入低聚糖后的益生菌中按照質量比0.1％-0.5％加入由1份重量的乳酸、3份重量的檸檬酸、1份延胡索酸組成的復合酸化劑；
S106、將添加復合酸化劑后的3株益生菌與質量比5％的益生元進行結合，配制出兔用復合型合生元微生態制劑。
實施例1：從養殖場附近的土壤初步篩選芽孢桿菌類益生菌。
第一步：含芽孢桿菌土壤樣品的采集。選擇大型養殖場附近的土壤為采集目的地，隨機選擇3-5個小區，每個小區取20-50g原始土壤，裝入已滅菌的自封袋中，帶回實驗室置于4℃冰箱中保存備用；
第二步：芽孢桿菌的分離。在無菌條件下，在土壤樣品加入到富集培養液，形成菌落，再將菌種接種到加入無菌生理鹽水制成菌懸液，再用10序列遞減法稀釋成不同的濃度梯度，將不同的溶度梯度樣品進行平板菌落計數，每個稀釋度做3個平行，由此制成的平板放入保溫箱中培養24-72h；
第三步：芽孢桿菌的分離純化。在無菌條件下，將經過鑒別后的益生菌用接種環接種于無菌生理鹽水中，制成菌懸液，再接種于平板上，培養后觀察，循環操作，直到獲得純菌落，斜面接種保存備用；
第四步：芽孢桿菌的鑒別。將分離純化后的芽孢桿菌進行形態觀察，生理生化特性測定和16S rDNA序列測定等方法，分別對不同的菌落進行鑒定，達到對其知類辨名的目的。
實施例2：從動物腸道中初步篩選雙歧桿菌益生菌。
第一步：含益生菌樣品的采集。選擇各個大型屠宰場為樣品采集目的地，隨機切取不同健康現殺動物的腸道組織，裝入已滅菌的自封袋中，并快速帶回實驗室置于4℃冰箱中保存備用；
第二步：益生菌的富集、分離。在無菌條件下，將腸道組織樣品內表面物質加入到富集培養液中培養，形成菌落，再將菌種接種到加入無菌生理鹽水制成菌懸液，再用10序列遞減法稀釋成不同的濃度梯度，將不同的溶度梯度樣品進行平板菌落計數，每個稀釋度做3個平行，由此制成的平板放入保溫箱中培養24-72h；
第三步：益生菌的分離純化。在無菌條件下，將經過鑒別后的益生菌用接種環接種于無菌生理鹽水中，制成菌懸液，再接種于平板上，培養后觀察，循環操作，直到獲得純菌落，斜面接種保存備用；
第四步：益生菌的鑒別。將分離純化后的乳桿菌進行形態觀察，生理生化特性測定和16S rDNA序列測定的等方法，分別對不同的菌落進行鑒定，達到對其知類辨名的目的。
實施例3：從兔腸道或者糞便中初步篩選糞腸球菌(糞鏈球菌)。
第一步：兔腸道樣品的采集。選擇大型商品兔養殖場為采集目的地，選擇用新鮮宰殺兔腸衣(各段)作為樣品約50g，裝入已滅菌的自封袋中，帶回實驗室置于4℃冰箱中保存備用；
第二步：糞腸球菌的富集、初步分離。在無菌條件下，在兔腸衣樣品中加入到富集培養液中，形成菌落，再將菌種接種到無菌生理鹽水制成菌懸液，再用10序列遞減法稀釋成不同的濃度梯度，將不同的溶度梯度樣品進行平板菌落計數，每個稀釋度做3個平行，由此制成的平板放入保溫箱中培養24-72h；
第三步：糞腸球菌的分離純化。在無菌條件下，將經過鑒別后的糞腸球菌用接種環接種于無菌生理鹽水中，制成菌懸液，再接種于平板上，培養后觀察，循環操作，直到獲得純種糞腸球菌形成的菌落，斜面接種保存備用；
第四步：糞腸球菌的鑒別。將分離純化后的糞腸球菌進行形態觀察，生理生化特性測定和16S rDNA序列測定的等方法，分別對不同的菌落進行鑒定，達到對其知類辨名的目的。
實施例4：復合型合生元微生態制劑的制備。
第一步：根據益生菌的種類、各類益生元的功能特性以及與相應益生菌的利用程度選擇由低聚糖和酸化劑組成的益生元，可選擇的低聚糖為寡甘露糖，果寡糖,低聚異麥芽糖,乳寡糖等，酸化劑使用由乳酸、檸檬酸、延胡索酸等物質組成的復合酸化劑
第二步：測試各類低聚糖的添加量，各類低聚糖的添加量為木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg。添加由乳酸、檸檬酸、延胡索酸等物質組成的復合酸化劑0.1％-0.5％；
第三步：將三種益生菌和選擇出的益生元有機結合起來，再加入有利于益生菌生長的營養物質，制成復合型合生元微生態制劑；
第四步：最后制成的產品添加到動物食用料中進行動物實驗，根據實驗動物的增重量、飼料消耗量和料肉比等來判斷實驗動物的生產性能情況。
下面結合試驗對本發明的應用原理作進一步的描述。
步驟一、從養兔場內的土壤、喂養兔的飼料槽、胃腸道區域分離篩選出雙歧桿菌、芽孢桿菌和糞腸球菌益生菌，將分離得到的益生菌進行生物學特性、功能以及安全性的鑒定，并進行體外益生效果評價，初步篩選益生菌；
步驟二、利用兔腸道微生物與糖代謝、維生素的關系，篩選出提高兔從日糧中獲取能量的優質益生菌，利用優質益生菌在兔腸道中的提高能量的獲取和儲存、提高兔從日糧中獲取能量的能力，再根據微生物技術指標(現有技術:1.在選擇性培養基上分離益生菌,然后對所選的每株細菌逐一進行耐酸、耐膽鹽、耐消化酶等的生理特性檢測,最后進行益生菌其他特性實驗。2.先在動物消化道內取少量內容物,并進行稀釋,于厭氧狀態下,在MRS培養基中進行富集培養，獲得可作為益生菌種的細菌，然后再通過梯度培養，逐漸增加培養基的酸度(pH為3.0左右)及膽汁鹽濃度，選出具有耐酸和耐膽汁特性的菌株，再根據益生菌特性的要求，在培養基中添加其他的抑制劑或病原菌，篩選出長勢良好并能抑殺病原菌的菌株，最后再對該菌株進行革蘭氏染色、觸酶等形態和生化鑒定，并確定其種屬。)篩選優質兔腸道益生菌；3.篩選及測定將分離得到的益生菌進行生物學特性、功能的比較以及安全性的鑒定，并進行體外益生效果評價，初步篩選優質益生菌；1)雙歧桿菌(以從動物胃腸道篩選為例)：分別取胃﹑十二指腸﹑肥腸﹑空腸﹑盲腸內容物一定量溶于100mL改良MRS培養基，富集培養24h,取1mL梯度稀釋，涂布于平板上，在厭氧條件下培養48h，用接種環挑取藍色菌落純化3次，得到雙歧桿菌，挑取嚴格厭氧的菌株進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體顏色﹑大小﹑形狀等是否符合雙歧桿菌屬的基本特征。2)枯草芽孢桿菌(以從動物胃腸道篩選為例)分別取胃﹑十二指腸﹑肥腸﹑空腸﹑盲腸內容物一定量于50mL厭氧稀釋液中﹑攪拌﹑作10倍系列稀釋，分別取3個稀釋度各0.1mL涂布LBS平板，37℃培養48h-72h,用接種環挑取疑是菌落，先進行復紅簡單染色觀察，再進行革蘭氏染色和芽孢染色，挑取芽孢桿菌菌落進行純培養，并于斜面保存，再進行過氧化氫酶測定，即將各分離株接種于LB固體培養基斜面上，37℃培養18h-24h，取一干凈載玻片，在上面滴一滴10％的H2O2,挑取一環培養好的菌苔，在H2O2中涂抹，若有氣泡，則為陽性，反之為陰性。3)糞腸球菌(以養殖場附近的土壤為例)：
(1)土壤的采集處理
采用五點取樣法從養殖場附近的土壤中取樣。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土層里，所以先用滅菌鏟除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于無菌塑料袋內，并標明采取地點、日期。將其運回實驗室后至于冰箱中保存，備用。
(2)土壤中菌種的分離
將采回的樣品用四分法獲取樣品20-30g，將其置于研缽中研磨均勻。稱取1g土壤，置于液體培養基滅菌葡萄汁，經28℃，12h，180rpm搖床富集培養。取1mL富集培養液，分別進行五個梯度稀釋(1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000)，再用移液槍分別從每一稀釋度各取0.1mL稀釋液，注入平板上，利用涂布棒將樣品均勻的涂在培養基表面(注意不能使培養基表面破裂)，將培養皿蓋好，再把培養皿倒置，于適宜溫度(一般為25℃或28℃)的恒溫箱中培養，每個梯度做三個重復。觀察培養基，直到菌種形成清晰易辯的菌落為止。為了在篩選過程中排除細菌的干擾，在培養基中加30ug/mL的鏈霉素或者100mg/L的氯霉素。觀察并記錄菌落顏色與形態，然后在顯微觀察記錄細胞大小、形態，進行分析和初步的歸類。
步驟三、在人工模擬的兔胃腸道液中培養初步篩選后的兔腸道益生菌，測定各類益生菌的活菌數，繁殖代數，進行更進一步的篩選，篩選最佳的菌株；1.鑒定：雙歧桿菌為革蘭氏陽性的無芽孢桿菌，長短不等，典型的雙歧桿菌有V字型或Y字型，排列呈單、雙、短鏈、X、Y、V或柵狀。芽孢桿菌存在兩種形態：芽孢和營養體。營養體的細胞基本形態有桿狀和橢圓狀。桿狀中有長桿狀、短桿狀，橢圓狀有長橢圓和短橢圓。糞腸球菌是單細胞真核微生物，腸球菌細胞的形態通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節形等。比細菌的單細胞個體要大得多，一般為1-5微米×5-30微米，腸球菌無鞭毛，不能游動。2.比較：根據比較不同益生菌的形態特征，從而鑒定各益生菌。
步驟四：根據益生菌的種類、各類益生元的功能特性以及與相應益生菌的利用程度選擇由各類低聚糖和組成的益生元，選擇出各類低聚糖最佳添加量；
步驟五、對步驟三篩選株益生菌與步驟四選擇出的益生元，混合制成兔用復合型合生元微生態制劑。添加由乳酸、檸檬酸、延胡索酸物質組成的復合酸化劑0.1％-0.5％。在最佳酸化劑添加量下:1.動物的消化道環境能得到改善，從而改善動物的健康狀況和生長性能。2.提高胃腸道的酸度，從而提高胃蛋白酶的活性。3.改善胃腸道內微生物區系，抑制有害微生物的繁殖4.促進動物體對礦物質元素和維生素的吸收5.促進有益菌的增殖，能夠替代某些抗生素的功能)
進一步，步驟三篩選最佳的菌株中優選：1株腸球菌、1株枯草芽孢桿菌、和1株雙歧桿菌。1.提高兔飼料轉化率,促進肉兔生長；2.產生營養物質,并可以調節動物體內酶的活性；3.增強商品兔的免疫功能4.提高兔的成活率5.提高肉兔的日增重等6，增強動物的非特異性免疫功能。
進一步，步驟四中各類低聚糖為：木寡糖、果寡糖，乳寡糖，L-阿拉伯糖；
各類低聚糖最佳添加量優選木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg。1.能促使機體生成多種營養物質，包括維生素B1、B2、B6、B12、煙酸和葉酸；2.對腸道中雙岐桿菌、糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌等分別有選擇性增殖作用，使有益菌群在腸道中占有優勢，抑制有害菌的生長，減少有毒物質(如內毒素、氨類等)的形成，并且對腸粘膜細胞和肝具有保護作用，從而防止病變腸癌的發生，增強機體免疫力；3.對有害菌的抑制作用。
本發明的兔用復合型合生元微生態制劑能避免單獨使用益生菌產品的弱點，相輔相成，揚長避短，促進了外源性益生菌在兔腸道的定植，并且選擇性刺激多種益生菌的生長和繁殖，從而達到促進動物健康的目的，減少了動物食用抗生素對兔肉質的影響，更加健康安全，無公害，不僅可以促進動物生長，還能提高飼料的轉化率、增加肉類品質和提高食品的安全質量，根據各類益生菌選擇出合適的益生元，解決了由傳統的抗生素而帶來的藥物殘留、產生抗藥性、動物腸道微生態平衡遭到破壞及降低肉制品質量等食品安全與質量問題。
以上所述僅是對本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，凡是依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案的范圍內。