本發(fā)明屬于液體飲料滅菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用低頻超聲波對(duì)柑橘汁殺菌的方法。

背景技術(shù)：

柑橘是世界第一大貿(mào)易水果，我國(guó)的柑橘產(chǎn)量以及種植面積均居世界第一，其中寬皮柑橘產(chǎn)量最高，2015年產(chǎn)量高達(dá)1850萬(wàn)噸，占世界寬皮柑橘總產(chǎn)量的三分之二以上，出口量超過(guò)世界出口量的三分之一。果汁是柑橘類作物的主要加工產(chǎn)品，也是緩解鮮果滯銷壓力，增加農(nóng)產(chǎn)品附加價(jià)值的重要途徑。目前我國(guó)柑橘汁出口量?jī)H為進(jìn)口量的10％，柑橘作物的附加產(chǎn)值具有極高的提升空間。我國(guó)寬皮柑橘以鮮食為主，加工產(chǎn)品比較單一，主要以橘瓣罐頭為主，寬皮柑橘汁經(jīng)熱處理易產(chǎn)生異味物質(zhì)，嚴(yán)重影響橘汁感官品質(zhì)，是寬皮柑橘加工業(yè)以及橘汁行業(yè)發(fā)展的制約因素，也是導(dǎo)致其加工業(yè)滯后于種植業(yè)的重要原因，同時(shí)寬皮柑橘貯藏期短，易造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。

柑橘汁富含膳食纖維、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及黃酮、酚酸、香豆素、類胡蘿卜素、抗壞血酸等多種活性成分，對(duì)心腦血管疾病等慢性和退行性疾病具有潛在的預(yù)防與治療作用。尤其是非濃縮還原汁，因其較好的保留了水果原有的營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味，日益受到消費(fèi)者的青睞。柑橘汁作為一種熱敏性食品，傳統(tǒng)熱殺菌雖能有效的殺滅微生物并抑制酶活，但高溫處理對(duì)果汁色澤、味道、營(yíng)養(yǎng)成分以及活性物質(zhì)造成不同程度的破壞，加速色素降解，產(chǎn)生蒸煮異味，加劇褐變反應(yīng)，降低果汁新鮮度，甚至產(chǎn)生醛和環(huán)氧化合物，對(duì)果汁的安全性造成一定的危害和隱患。伴隨消費(fèi)者對(duì)健康關(guān)注度的上升，天然、無(wú)添加、非熱加工的健康食品的需求量也日益增加。因此，超聲波、輻照、超高壓、脈沖電泳、真空滲透脫水等非熱技術(shù)應(yīng)用于果汁加工領(lǐng)域的潛在可能性受到廣泛關(guān)注，新型果汁加工技術(shù)也亟需深入研究與推廣應(yīng)用。

超聲波作為一種非熱加工技術(shù)，具有環(huán)保、節(jié)能等特點(diǎn)，在實(shí)現(xiàn)殺菌的同時(shí)兼具提升果汁品質(zhì)的潛在優(yōu)勢(shì)，明確超聲技術(shù)的殺菌特性、穩(wěn)定性、適用性是超聲技術(shù)推廣應(yīng)用的新趨勢(shì)。超聲波是指頻率為20KHz～500MHz的聲波，超聲波的引入可引起介質(zhì)發(fā)生交替壓縮和伸張的機(jī)械震動(dòng)，當(dāng)液體分子間的距離超過(guò)保持液體作用的臨界分子間距時(shí)會(huì)形成空穴氣泡，在超聲波的連續(xù)作用下，部分空穴氣泡會(huì)瞬間絕熱收縮至爆破，產(chǎn)生局部高溫、高壓(5000～500000KPa)、強(qiáng)烈的剪切力等超聲波特有的聲化學(xué)效應(yīng)，同時(shí)引起質(zhì)點(diǎn)線性和非線性的交變震動(dòng)，并伴隨機(jī)械剪切力以及自由基的產(chǎn)生。空穴氣泡的大小與超聲頻率的高低呈負(fù)相關(guān)，因此低頻超聲波(20KHz～100KHz)能產(chǎn)生較大的空穴氣泡，氣泡崩塌時(shí)比高頻超聲波(100KHz～1MHz)更為劇烈，具有更高的超聲能量，有利于促進(jìn)聲化學(xué)效應(yīng)的產(chǎn)生。當(dāng)超聲波應(yīng)用于果汁殺菌時(shí)，其能量可瞬間分布于果汁中，空穴氣泡絕熱收縮至爆破的瞬間過(guò)程，產(chǎn)生“熱點(diǎn)”效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜在變化的壓強(qiáng)條件下拉伸，破裂，并伴有膜電位的改變，因而在中低溫條件下具有顯著的殺菌效力，達(dá)到減緩熱效應(yīng)(降低熱殺菌溫度/縮短熱殺菌時(shí)間)和降低能耗的效果。國(guó)內(nèi)外學(xué)者基于模擬體系和真實(shí)體系開展了眾多關(guān)于超聲技術(shù)的殺菌效力及其機(jī)理的研究。超聲處理對(duì)蘋果汁、牛奶、胡蘿卜汁、橙汁中微生物的滅活效果及作用機(jī)理等方面的研究均有報(bào)道。超聲技術(shù)的輔助殺菌作用也已被證實(shí)，超聲輔助巴氏殺菌可達(dá)到美國(guó)食品藥品管理局對(duì)橙汁中大腸桿菌的衛(wèi)生要求(5-log)；已有研究表明超聲處理能明顯抑制番石榴汁中的嗜溫需氧菌。同時(shí)，超聲處理能顯著提高果汁濁度，提高其懸浮穩(wěn)定性。除此之外，超聲聯(lián)合碳酸化處理能有效抑制L-抗壞血酸的降解，并能提升橙汁亮度，克服熱殺菌中果汁顏色劣變的問(wèn)題。綜上所述，超聲波作為一種新的殺菌技術(shù)，與傳統(tǒng)熱殺菌相比，能減少熱效應(yīng)，降低能耗，有效的減少營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的損失，尤其在糖度較高的果汁中，兼具良好的均質(zhì)效果，有潛力成為輔助甚至替代熱殺菌的新技術(shù)。目前為止，關(guān)于寬皮柑橘(溫州蜜柑)汁主要腐敗菌群與致病菌群(細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群)對(duì)低頻超聲波的耐受度尚未明確，殺菌效果對(duì)低頻超聲參數(shù)的依賴程度以及該技術(shù)對(duì)寬皮柑橘汁綜合品質(zhì)影響的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)以上問(wèn)題提供一種快速、成本低、殺菌效果好、果汁營(yíng)養(yǎng)損失小的利用低頻超聲波對(duì)柑橘汁殺菌的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：一種利用低頻超聲波對(duì)柑橘汁殺菌的方法，具體步驟如下：將柑橘汁在溫度45～50℃下進(jìn)行超聲波處理，超聲條件為：超聲頻率25KHz，超聲功率為685～720W，超聲時(shí)間36～46min；超聲處理完畢后殺菌過(guò)程即完成。

作為優(yōu)選地，所述超聲時(shí)間為41.5～44.4min，柑橘汁溫度為48～50℃。在此超聲條件下，柑橘汁的總殺菌均高于98％。

作為優(yōu)選地，將柑橘汁在溫度50℃下進(jìn)行超聲波處理，超聲條件為：超聲頻率25KHz，超聲功率為720W，超聲時(shí)間40min；超聲處理完畢后殺菌過(guò)程即完成。在此條件下處理的柑橘汁總殺菌率高達(dá)99.65％，且表現(xiàn)出最高的綜合品質(zhì)。

所述柑橘為溫州蜜柑。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法對(duì)橘汁糖酸成分無(wú)顯著性影響(P>0.05)，同時(shí)橘汁抗壞血酸、總酚，以及抗氧化能力均顯著高于巴氏殺菌橘汁(P<0.05)，具有提升橘汁品質(zhì)的潛在作用。本發(fā)明方法殺菌效果好，總殺菌率可以高達(dá)99.65％，殺菌快速、成本低、不破壞柑橘汁本身營(yíng)養(yǎng)成分，證實(shí)了低頻超聲波技術(shù)在寬皮柑橘汁加工領(lǐng)域具有適用性及可行性，克服傳統(tǒng)熱處理過(guò)程中果汁易出現(xiàn)的褐變、二次沉淀等問(wèn)題，可以實(shí)現(xiàn)商業(yè)殺菌要求以及提升活性成分與營(yíng)養(yǎng)成分保留率的需求，為低頻超聲技術(shù)在果汁加工領(lǐng)域的運(yùn)用提供可靠的技術(shù)參數(shù)。

附圖說(shuō)明

圖1為超聲溫度對(duì)溫州蜜柑汁殺菌效果的影響分析圖。

圖2為超聲功率對(duì)溫州蜜柑汁殺菌效果的影響分析圖；A：超聲功率對(duì)殺菌率的影響，B：超聲功率殺菌效果線性擬合。

圖3為樣品處理量對(duì)溫州蜜柑汁殺菌效果的影響分析圖。

圖4為4℃時(shí)超聲時(shí)間對(duì)溫州蜜柑汁殺菌效果的影響分析圖；A：超聲時(shí)間對(duì)殺菌率的影響，B：超聲時(shí)間殺菌效果線性擬合。

圖5為40℃時(shí)超聲時(shí)間對(duì)溫州蜜柑汁殺菌效果的影響分析圖；A：超聲時(shí)間對(duì)殺菌率的影響，B：超聲時(shí)間殺菌效果線性擬合。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1試驗(yàn)方法

1.1寬皮柑橘(溫州蜜柑)汁制備

選取商業(yè)成熟度的溫州蜜柑(產(chǎn)自重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn))為試驗(yàn)原料，洗凈、擦干并切半，用Brown手動(dòng)榨汁機(jī)榨汁，經(jīng)80目無(wú)菌雙層紗布過(guò)濾后裝于無(wú)菌真空封裝袋，并用真空封裝機(jī)密封后待處理。

1.2超聲處理

1.2.1超聲位點(diǎn)選擇

選用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的專用低頻超聲波設(shè)備，并與恒溫水域槽連接，以實(shí)現(xiàn)對(duì)超聲處理過(guò)程中對(duì)介質(zhì)溫度的調(diào)控。超聲換能器均勻分布于清洗槽底部。超聲場(chǎng)能量分布具有不均勻性以及動(dòng)態(tài)變化性，參照朱攀攀等人(超聲局部效應(yīng)對(duì)咖啡酸穩(wěn)定性及抗氧化性的影響，2015)對(duì)超聲局部效應(yīng)的研究，選取距離超聲水域槽底部垂直距離為6cm超聲輻射面，橫截面的中心位置，為樣品超聲處理位點(diǎn)，液面高度為12cm。

1.2.2低頻超聲技術(shù)參數(shù)試驗(yàn)

選取超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲強(qiáng)度、處理量為考察參數(shù)，在低頻高能超聲波25KHz下設(shè)置不同超聲參數(shù)的實(shí)驗(yàn)：

1、超聲時(shí)間單因素(低溫)：超聲時(shí)間梯度10、20、30、40、50min；超聲溫度4℃；超聲功率640W；超聲頻率25KHz；樣品處理量100mL。

2、超聲時(shí)間單因素(中溫)：超聲時(shí)間梯度10、20、30、40、50min；超聲溫度40℃；超聲功率640W；超聲頻率25KHz；樣品處理量100mL。

3、超聲功率單因素：超聲功率梯度160、320、480、640、800W；超聲時(shí)間30min；超聲溫度40℃；超聲頻率25KHz；樣品處理量100mL。

4、超聲溫度單因素：超聲溫度梯度10、20、30、40、50℃；超聲時(shí)間30min；超聲功率640W；超聲頻率25KHz；樣品處理量100mL。

5、樣品處理量單因素：50、100、150、250mL；超聲溫度50℃；超聲時(shí)間30min；超聲功率640W；超聲頻率25KHz。

每組樣品重復(fù)處理三次。

1.3微生物測(cè)定

1.3.1細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

用無(wú)菌水將超聲處理后的溫州蜜柑汁樣品稀釋到適當(dāng)濃度并混合均勻，精確吸取1mL稀釋液，垂直滴加于細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片中央，利用壓板模具使稀釋液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)皿面積上，靜置一分鐘使培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后計(jì)數(shù)。精確量取1mL無(wú)菌水按以上操作步驟制作空白對(duì)照。測(cè)定方法參照《3M細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片判讀手冊(cè)》。

1.3.2霉菌/酵母菌測(cè)定

用無(wú)菌水將超聲處理后的溫州蜜柑汁樣品稀釋到適當(dāng)濃度并混合均勻，精確吸取1mL稀釋液，垂直滴加在霉菌和酵母菌測(cè)試片中央，利用壓板模具使稀釋液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)皿面積上，靜置一分鐘使培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)。精確量取1mL無(wú)菌水按以上操作步驟制作空白對(duì)照。測(cè)定方法參照《3M霉菌和酵母菌測(cè)試片判讀手冊(cè)》。

1.3.3大腸菌群測(cè)定

用無(wú)菌水將超聲處理后的溫州蜜柑汁樣品稀釋到適當(dāng)濃度并混合均勻，精確吸取1mL稀釋液，垂直滴加在大腸菌群測(cè)試片中央，利用壓板模具使稀釋液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)皿面積上，靜置一分鐘使培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片置于32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)數(shù)。精確量取1mL無(wú)菌水按以上操作步驟制作空白對(duì)照。測(cè)定方法參照《3M大腸菌群測(cè)試片判讀手冊(cè)》。

1.3.4殺菌率計(jì)算

低頻超聲處理后細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群的滅活效果用殺菌率(sterilizing rate，SR)表示，方程式如(1)所示。

式中：N₀，超聲處理前樣品中目標(biāo)微生物菌群(細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群)菌落數(shù)，cfu/mL；N_R：超聲處理后樣品中目標(biāo)微生物菌群(細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群)菌落數(shù)，cfu/mL。

1.4可滴定酸測(cè)定

參照GB/T8210-2011《柑桔鮮果檢驗(yàn)方法》中指示劑法測(cè)定。精確吸取溫州蜜柑汁樣品25mL，用蒸餾水稀釋至250mL，搖勻。吸取稀釋后果汁10mL，置于150mL錐形瓶中，加1％酚酞2～3滴。用已標(biāo)定的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，30s不褪色為終點(diǎn)。

1.5pH值測(cè)定

使用梅特勒-托利多FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測(cè)定。

1.6可溶性固形物測(cè)定

依照GB/T8210-2011《柑桔鮮果檢驗(yàn)方法》中阿貝折射儀測(cè)法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果統(tǒng)一校正到20℃條件下的數(shù)值。

1.7光學(xué)性質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.7.1色值測(cè)定

使用Color i5色差儀測(cè)定寬皮柑橘汁L*、a*、b*值。

1.7.2總色差計(jì)算

通過(guò)L*、a*、b*計(jì)算得寬皮柑橘汁總色差值(ΔE)。ΔE表示溫州蜜柑汁總體色澤差異，值越大，差異程度越大，根據(jù)ΔE數(shù)值大小可分為：基本無(wú)差異(0～0.5)、細(xì)微差異(0.5～1.5)、易辨別的差異(1.5～3)、顯著差異(3.0～6.0)、極顯著差異(6.0～12.0)、不同顏色(12.0以上)，用于表示溫州蜜柑汁的顏色變化程度及褐變程度。其計(jì)算公式如下：

1.7.3褐變度(A₄₂₀)測(cè)定

參照Meydav等人的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確量取4mL溫州蜜柑汁樣品，加入等體積95％乙醇，并混合均勻，于4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min測(cè)定420nm處的吸光度，所得吸光度即為該樣品的A₄₂₀。

1.7.4濁度(A₆₆₀)測(cè)定

參照應(yīng)潔琦的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確量取5mL溫州蜜柑汁樣品，于4℃下以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min測(cè)定660nm處的吸光度，所得吸光度即為該樣品的A₆₆₀。

1.8抗壞血酸(ascorbic acid；Vc)測(cè)定

表1 Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

參照Shinoda等人(Browning and Decomposed Products of Model Orange Juice，Bioscience Biotechnology&Biochemistry,2004,68(3):529-536)的方法并加以改進(jìn)。采用高效液相色譜法測(cè)定。檢測(cè)條件：色譜柱：Waters C18(250mm×4.6mm，5μm，美國(guó)Dionex)；流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鉀(磷酸調(diào)pH至3.50)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：25μL。

Vc工作曲線繪制：精確稱取5mg Vc標(biāo)準(zhǔn)品，用1g/L草酸溶液定容至250mL，搖勻，配制成20mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm水系濾膜過(guò)濾后備用。設(shè)定體積為0、10、20、30、40、60、80、100μL的梯度進(jìn)樣序列，并在上述液相色譜條件下測(cè)定。以峰面積為橫坐標(biāo)，Vc質(zhì)量為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

溫州蜜柑汁樣品測(cè)定：精確量取1mL樣品，用1g/1000mL草酸溶液稀釋至5mL。于4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液過(guò)0.22μm水系濾膜后待測(cè)。按上述液相條件測(cè)定樣品中Vc含量(以mg/100mL計(jì)算)。

1.9總酚含量測(cè)定

參照Folin-Ciocalteu法測(cè)定(CAI Y,LUO Q,SUN M,et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J].Life Sciences,2004,74(17):2157-2184.)，并加以改進(jìn)。將溫州蜜柑汁樣品于10000r/min離心20min，精確量取上清液500μL于25mL具塞試管，蒸餾水稀釋至10mL。加入0.5mL 2mol/L Foline-phenol試劑并充分震蕩，靜置5min后加入5mL濃度為5g/100mL的Na₂CO₃溶液，定容至25mL，充分震蕩后暗室反應(yīng)30min，在760nm處測(cè)定最大吸光值。精確量取500μL蒸餾水加入具塞試管，按以上操作步驟制作空白對(duì)照。

總酚工作曲線繪制：選取沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱量50mg，用蒸餾定容至25mL，配制成2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。用移液槍準(zhǔn)確移取0、20、40、80、100μL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25ml具塞試管，用蒸餾水稀釋至10mL。加入0.5mL 2mol/L Foline-phenol試劑并充分震蕩，靜置5min后加入5mL濃度為5g/100mL的Na₂CO₃溶液，定容至25mL，充分震蕩后暗室反應(yīng)30min，在760nm處測(cè)定最大吸光值。以760nm處吸光度為橫坐標(biāo)，沒(méi)食子酸質(zhì)量為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到總酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝328.38x+1.1158(R²＝0.995)，總酚含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示(mg GAE/100ml)。

1.10抗氧化性測(cè)定

1.10.1DPPH自由基清除能力

參照朱攀攀等人(朱攀攀,馬亞琴,竇華亭,等.超聲局部效應(yīng)對(duì)咖啡酸穩(wěn)定性及抗氧化性的影響[J].食品科學(xué),2015(23):12-17.)的測(cè)定方法并加以修改。精確稱取39mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容于100mL容量瓶，配制成0.1mmol/L DPPH工作液，備用。將溫州蜜柑汁于10000r/min離心20min，精確量取50μL上清液，與1.95mL DPPH(0.1mmol/L)工作液均勻混合后暗室反應(yīng)10min，在517nm處測(cè)定最大吸光值，記為A_樣品。精確量取50μL蒸餾水按以上操作步驟制作空白對(duì)照，記為A_空白。DPPH自由基清除能力以下述公式(3)表示：

1.10.2鐵離子還原能力(ferric-reducing antioxidant power,FRAP)

參照朱攀攀等人的測(cè)定方法并加以修改。將溫州蜜柑汁樣品于10000r/min 離心20min備用。精確量取50μL樣品與2.45mL FRAP工作液均勻混合后暗室反應(yīng)30min，在593nm處測(cè)定最大吸光值。精確量取50μL蒸餾水按以上操作步驟制作空白對(duì)照。其中，F(xiàn)RAP工作液配制方法為：0.1mol/L醋酸緩沖液(PH 3.6):10mmol/L TPTZ(溶于40mmol/L鹽酸):20mmol/L三氯化鐵＝10:1:1(V:V:V)。

FRAP工作曲線繪制：選取Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱量100mg，用蒸餾水定容至250mL，配制成400mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。用移液槍準(zhǔn)確移取0、25、50、75、100μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用蒸餾水稀釋至100μL，與4.9mL FRAP工作液均勻混合后暗室反應(yīng)30min，在593nm處測(cè)定最大吸光值。以593nm處吸光度為橫坐標(biāo)，Trolox質(zhì)量為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到FRAP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：y＝29.802x-4.1062(R²＝0.997)，抗氧化能力以Trolox當(dāng)量表示(mg TEAC/100mL)。

1.11數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果以(x±s表示。運(yùn)用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。應(yīng)用Origin 8.6軟件和Excel 2013進(jìn)行圖表繪制。

2結(jié)果與分析

2.1低頻超聲處理對(duì)溫州蜜柑汁中微生物滅活效果的影響

對(duì)前述“1.2.2低頻超聲技術(shù)參數(shù)試驗(yàn)”設(shè)置的不同實(shí)驗(yàn)得到的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.1.1超聲溫度對(duì)不同微生物滅活效果的影響

超聲溫度對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸桿菌的滅活效力如圖1所示(同種微生物菌群標(biāo)注不同字母表示差異顯著，相同下標(biāo)數(shù)字表示同種菌群(P<0.05))。由圖1可知，超聲溫度對(duì)霉菌、酵母菌、大腸菌群以及細(xì)菌4種目標(biāo)微生物群體的滅活率均具有極顯著影響(P<0.01)，同時(shí)霉菌、酵母菌的失活率隨超聲溫度的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出相似性。大腸菌群的滅活率隨超聲溫度的升高而增加，且在同等溫度水平下其滅活率均高于霉菌和酵母菌，并在超聲溫度為40℃時(shí)，實(shí)現(xiàn)全部滅活。霉菌與酵母菌的臨界殺菌溫度均接近30℃，超聲溫度為30℃時(shí)，細(xì)菌總數(shù)僅下降4.44％，霉菌與酵母菌的滅活率分別為14.28％、18.93％，殺菌效果不理想。當(dāng)超聲溫度從30℃增加至40℃，殺菌效果顯著上升，細(xì)菌總數(shù)下降66.45％，同時(shí)霉菌、酵母菌的滅活率也分別達(dá)到85.71％與95.37％，為30℃超聲溫度條件下的5倍。三種菌群對(duì)超聲溫度敏感程度不同，可能由于其不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，霉菌與酵母菌細(xì)胞壁的主要成分分別為幾丁質(zhì)和葡聚糖，均表現(xiàn)出較好的機(jī)械強(qiáng)度。大腸菌群屬G^-細(xì)菌，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中缺乏磷壁酸，構(gòu)成細(xì)胞壁的肽聚糖網(wǎng)結(jié)構(gòu)疏松，機(jī)械強(qiáng)度差，導(dǎo)致其較低的抗逆性。

2.1.2超聲功率對(duì)目標(biāo)微生物滅活效果的影響

超聲功率直接決定聲場(chǎng)中的能量密度，是影響超聲場(chǎng)中物理和化學(xué)效應(yīng)的重要因素，亦是影響殺菌效果的最重要的因素之一。超聲功率對(duì)不同目標(biāo)微生物菌群殺菌率的影響見圖2A。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲功率較低時(shí)，酵母菌比大腸菌群和霉菌耐受力更強(qiáng)。四種目標(biāo)菌群的滅活率隨著超聲功率的增大均曾上升趨勢(shì)，其中細(xì)菌、霉菌、酵母菌在超聲功率為800W時(shí)達(dá)到最高滅活率分別為95.66、83.01、46.94％，而大腸菌群在超聲功率為640W時(shí)，已實(shí)現(xiàn)全部滅活。

分別對(duì)三種目標(biāo)菌群在不同超聲功率下的滅活效果進(jìn)行擬合，如圖2B所示，可得到三種目標(biāo)菌群的臨界滅活功率分別為：275、263、3W。霉菌與酵母菌的臨界滅活功率相近，這可能源于二者均屬真菌均屬，具有相似的細(xì)胞機(jī)構(gòu)與滅活機(jī)制。

2.1.3樣品處理量對(duì)目標(biāo)微生物滅活效果的影響

由圖3可得，樣品處理量對(duì)大腸菌群的殺菌率無(wú)影響，而對(duì)霉菌、酵母菌以及細(xì)菌總數(shù)的滅活率影響顯著(P<0.05)，三者的殺菌率隨處理量的上升呈下降趨勢(shì)，當(dāng)超聲處理量由50ml增長(zhǎng)至250ml時(shí)，霉菌、酵母菌以及菌落總數(shù)的滅活率分別下降了17.06、23.23、15.25％。超聲場(chǎng)的不均勻性以及動(dòng)態(tài)變化性應(yīng)該是導(dǎo)致該現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因。

2.2超聲聯(lián)合中溫技術(shù)的殺菌效力探究

圖4、5分別為在4℃與40℃的超聲溫度條件下，超聲時(shí)間對(duì)細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群滅活率的影響。由圖4A可得出，在4℃的超聲條件下，四種目標(biāo)菌群殺菌率在超聲初期均呈現(xiàn)出滯后現(xiàn)象，并在處理時(shí)間達(dá)到30min后，存活率急劇下降，超聲處理50min后霉菌、酵母菌、大腸菌群與細(xì)菌總數(shù)的殺菌率分別達(dá)到54.54、53.04、47.50、42.5％。超聲聯(lián)合中溫(40℃)技術(shù)的殺菌效果如圖5A所示。結(jié)果表明，超聲殺菌效力的滯后得以顯著改善，超聲處理30min后，大腸菌群實(shí)現(xiàn)全部滅活，霉菌與酵母菌的殺菌率也分別達(dá)到84.76％與96.57％。在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)4℃、40℃條件下殺菌效力進(jìn)行擬合(見圖4B、5B)，由圖4B、5B可得，相較于4℃，三種微生物菌群在40℃的超聲條件下，臨界殺菌分縮短了5.8、3.0和9.9min，試驗(yàn)證實(shí)中溫環(huán)境能有效的緩解超聲處理的滯后效應(yīng)，同時(shí)，超聲殺菌的滯后現(xiàn)象可聯(lián)合超高壓，脈沖電泳等技術(shù)得以緩解。

2.3低頻超聲技術(shù)對(duì)溫州蜜柑汁品質(zhì)的影響

2.3.1殺菌方式對(duì)糖酸成分的影響

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲頻率25kHz，超聲溫度為50℃，超聲功率為720W，超聲時(shí)間為40min，超聲處理量為150mL的工藝條件處理溫州蜜柑汁，并比較分析低頻超聲波對(duì)橘汁品質(zhì)的影響。由表2可知，與巴氏殺菌橘汁相比，超聲處理后橘汁中可滴定酸、可溶性固形物、pH值沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，表明超聲處理技術(shù)不會(huì)影響橘汁的基本酸甜口感。

表2殺菌方式對(duì)溫州蜜柑汁糖酸含量的影響

注：同列肩標(biāo)不同字母表示列組間有顯著差異(P＜0.05)。

2.3.2殺菌方式對(duì)溫州蜜柑汁光學(xué)性質(zhì)的影響

表3殺菌方式對(duì)溫州蜜柑汁光學(xué)性質(zhì)的影響

注：同列肩標(biāo)不同字母表示列組間有顯著差異(P＜0.05)。

低頻超聲技術(shù)對(duì)溫州蜜柑汁光學(xué)特性的影響見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于巴氏殺菌，低頻超聲波能顯著改善橘汁亮度水平，進(jìn)而提升橘汁的商業(yè)價(jià)值。與之同時(shí)，低頻超聲技術(shù)對(duì)橘汁黃色色澤的保留與提升作用更為顯著(P＜0.05)。低頻超聲處理對(duì)橘汁懸浮穩(wěn)定性體現(xiàn)出顯著的改善作用，溫州蜜柑汁濁度水平顯著提升，橘汁平均粒徑的降低是導(dǎo)致該現(xiàn)象產(chǎn)生的重要原因，同時(shí)超聲處理可達(dá)到抑制果膠甲酯酶的活性效果，有效抑制果膠的降解反應(yīng)，使溫州蜜柑汁穩(wěn)定性得以提升。粒徑減小引起溫州蜜柑汁對(duì)光的吸收與折射性能的改變，是引發(fā)總色差顯著增加的潛在因素，同時(shí)超聲處理滅活酶和去除溶解氧的作用可抑制酶促褐變的發(fā)生，保持橘汁色澤的穩(wěn)定性，超聲波技術(shù)引發(fā)的檸檬汁、橙汁色澤的微小改變不能被肉眼分辨。

2.3.3殺菌方式對(duì)溫州蜜柑汁活性成分及抗氧化性的影響

表4殺菌方式對(duì)溫州蜜柑汁營(yíng)活性成分及抗氧化性的影響

注：同列肩標(biāo)不同字母表示列組間有顯著差異(P＜0.05)。

低頻超聲波對(duì)橘汁活性成分與抗氧化性的影響如表4所示，低頻超聲波作為一種非熱加工技術(shù)，對(duì)熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分具有更好的保留效果，超聲處理橘汁Vc含量顯著高于巴氏殺菌橘汁。超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)具有消除溶解氧的作用，能有效的抑制Vc的有氧降解，降低脫氫抗壞血酸的積累水平，以脫氫抗壞血酸為底物的Vc的無(wú)氧降解也受到間接抑制。低頻超聲技術(shù)具有提升橘汁抗氧化能力的潛力，DPPH自由基清除能力比熱殺菌橘汁提高了9.7％，聲化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的OH^-在酚類等活性物質(zhì)的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上已有羥基基團(tuán)的臨位或者對(duì)位添加，對(duì)該物質(zhì)抗氧化能力的增強(qiáng)作用已有報(bào)道，同時(shí)低頻超聲技術(shù)的提取效應(yīng)引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)含物流出以及束縛態(tài)酚類物質(zhì)的釋放是引起總酚含量顯著上升的重要原因。抗氧化活性成分含量的提升與活性的增強(qiáng)是橘汁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提升的重要體現(xiàn)。

2.4響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在響應(yīng)面模型考察的三個(gè)超聲參數(shù)中，超聲溫度和超聲功率對(duì)總殺菌率影響程度均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，超聲時(shí)間影響水平不顯著(P>0.05)。同時(shí)，超聲功率與超聲溫度的交互相達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，超聲時(shí)間的平方項(xiàng)達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其余項(xiàng)影響不顯著。

選取殺菌率為98％為目標(biāo)值，根據(jù)響應(yīng)面殺菌模型可得出，當(dāng)選定超聲殺菌參數(shù)滿足以下條件：超聲時(shí)間41.52～44.40min，超聲溫度47.92～49.98℃；超聲功率為685～720W，總殺菌均高于98％，由于不同超聲參數(shù)間非簡(jiǎn)單線性關(guān)系，故同時(shí)存在所列范圍外參數(shù)組合水平具有較好殺菌效果(總殺菌高于98％)。

溫州蜜柑汁經(jīng)超聲溫度50℃，超聲功率720W，樣品處理量為150mL，處理40min后，霉菌、酵母菌、大腸菌群滅活率分別達(dá)到99.43、99.29、100％、同時(shí)總殺菌率為99.65％，符合國(guó)標(biāo)中關(guān)于果蔬汁菌落總數(shù)安全限量(<100cfu/100mL)的要求。與傳統(tǒng)熱殺菌相比，低頻超聲技術(shù)在達(dá)到理想殺菌效果的同時(shí)，對(duì)溫州蜜柑汁的綜合品質(zhì)表現(xiàn)出一定的提升作用：懸浮穩(wěn)定性提升3倍；Vc保留水平及總酚含量分別提高5.2、3.3％；抗氧化能力提升9.7％；亮度以及黃色色值顯著提升。本發(fā)明結(jié)果證實(shí)了低頻超聲波技術(shù)在寬皮柑橘汁加工領(lǐng)域具有適用性及可行性，可以實(shí)現(xiàn)商業(yè)殺菌要求以及提升活性成分與營(yíng)養(yǎng)成分保留率的需求。

實(shí)施例2利用低頻超聲波對(duì)柑橘汁殺菌

選取不同超聲處理組合處理溫州蜜柑汁，并對(duì)處理后橘汁殺菌效果及品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明低頻超聲波作為一種非熱加工技術(shù)，對(duì)熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分具有更好的保留效果。兩組超聲處理溫州蜜柑汁的Vc保留水平、總酚含量、DPPH自由基清除率均顯著高于巴氏殺菌組橘汁，與此同時(shí)，兩組超聲處組之間的活性成分保留水平及抗氧化能力并無(wú)顯著差異，且超聲因素水平為50℃，36min，720W的溫州蜜柑汁處理組表現(xiàn)出最高的綜合品質(zhì)。超聲波產(chǎn)生的空穴效用具有消除溶解氧的作用，有效的抑制的Vc的有氧降解，同時(shí)Vc厭氧降解也會(huì)因?yàn)榈孜锏娜狈Χg接受到抑制。低頻超聲技術(shù)具有提升溫州蜜柑汁抗氧化能力的潛力，兩組超聲處理橘汁DPPH自由基清除能力比熱殺菌橘汁分別提高了9.7、7.5％，聲化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的OH^—在酚類等抗氧化活性成分的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上已有羥基基團(tuán)的臨位或者對(duì)位添加該成分抗氧化活性能力的增強(qiáng)作用已被證實(shí)，同時(shí)低頻超聲技術(shù)的提取效應(yīng)引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)容流出以及束縛態(tài)酚類物質(zhì)的釋放是產(chǎn)生總酚含量顯著上升的重要原因。兩組超聲處理組溫州蜜柑汁殺菌效果差異顯著，該結(jié)果同時(shí)驗(yàn)證的響應(yīng)面模型中超聲溫度因素和超聲功率因素對(duì)總殺菌率具有極顯著影響的結(jié)論。

表5不同殺菌條件對(duì)總殺菌率及活性成分的影響

注：同列肩標(biāo)不同字母表示列組間有顯著差異(P＜0.05)。