本發明涉及復合芽孢桿菌-海洋活性寡糖合生元研制方法及其在刺參養殖中的應用。

背景技術：

刺參是中國20多種可食用海參中品質最好的一種，位列海產八珍之首，具有極高的營養價值和經濟價值。近十多年來，刺參養殖業發展迅猛，2013年全國刺參產量超過13×10⁴噸，產值突破300億元，在水產養殖行業單種產值和利潤中最高，其發展速度和綜合經濟效益都是其他經濟水產品種所無法比擬的。隨著刺參產業向高密度集約化方式轉變，刺參養殖的健康和病害問題日益凸顯，腐皮綜合征等疾病頻發，導致生產性能降低，嚴重制約了刺參產業健康和可持續發展。雖然使用抗生素和化學藥物防治水生動物疾病具有一定的效果，但是會導致細菌出現抗藥性、藥物殘留及破壞動物與環境中正常菌群平衡等諸多弊端。隨著現代水產養殖業逐步向綠色、環保和無公害方向發展，益生菌和益生元等天然綠色飼料添加劑因具有利于腸道及水體微生態群系平衡、促進動物生長及增強免疫應答，可為宿主帶來諸多益處，且綠色安全、無污染，逐漸成為水產養殖領域研究的焦點。

技術實現要素：

本發明的目的在于高效科學配伍益生菌及益生元，從而顯著提高刺參的生長性能及非特異性免疫應答，以保證刺參產業健康可持續性發展。

為了達到上述目的，本發明提供了一種海洋合生元添加劑，該添加劑包含源自海洋、具有生物活性的海洋寡糖類益生元——殼寡糖，以及能利用殼寡糖作為能源物質生長的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus lincheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。所述三種芽孢桿菌與上述寡糖類益生元科學配伍，制備出的海洋合生元添加劑為可用于刺參養殖促進其生長及增強免疫力的復合型合生元添加劑；

上述海洋合生元添加劑的組成包括：

解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、海洋寡糖類益生元、菌體保護劑、礦物質載體；

所述海洋益生元殼寡糖的聚合度為2～10；

所述殼寡糖分子量<2000；

所述菌體保護劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖或明膠；優選脫脂奶粉；

所述礦物質載體為沸石粉。

優選方式下，所述海洋合生元添加劑各組分的配比為：

濃度分別大于等于1×10¹⁰CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液中加入占所述菌液質量5～8％的海洋寡糖類益生元殼寡糖、占所述菌液質量5～10％的菌體保護劑后得到的溶液與所述礦物質載體按體積質量比1:0.25ml/g混合，凍干。

進一步優化，解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液濃度等于1×10¹⁰CFU/mL，加入的海洋寡糖類益生元占所述菌液質量5％、菌體保護劑占所述菌液質量的10％。

本發明所述三種芽孢桿菌均對刺參沒有安全性風險，無致病性，可作為刺參的益生菌使用。

本發明還提供了上述海洋合生元添加劑的制備方法，具體步驟如下：

S1、取解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液，加入海洋寡糖類益生元、菌體保護劑，得到混合液；

所述海洋寡糖類益生元為聚合度為2～10的殼寡糖；

所述殼寡糖分子量<2000；

所述菌體保護劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖或明膠；優選脫脂奶粉。

優選方式下，所述三種芽孢桿菌菌液濃度分別大于等于1×10¹⁰CFU/mL；優選等于1×10¹⁰CFU/mL；

加入的所述海洋寡糖類益生元的量占所述三種芽孢桿菌菌菌液質量的5～8％；優選5％；

加入的所述菌體保護劑的量占所述三種芽孢桿菌菌液質量的5～10％；優選10％。

所述三種芽孢桿菌菌液的制備方法優選為：

將上述三種芽孢桿菌分別進行發酵富集，培養溫度為25～30℃，pH 6.8～7.8，培養48～72h，得到芽孢桿菌發酵液；分別調整芽孢桿菌發酵液濃度之后將三種芽孢桿菌發酵液混合制成混合菌液；

所述三種芽孢桿菌發酵培養基為改進后的2216E海洋培養基，具體成分質量體積比為：

蛋白胨:殼寡糖:酵母膏:沙濾海水＝0.3:0.1:0.1:100(g:g:g:g:ml)。

此步驟可采用平板計數法調整發酵后的三種芽孢桿菌發酵液濃度。

S2、將步驟S1制得的混合液與礦物質載體混合；

所述礦物質載體為沸石粉；

所述混合液與礦物質載體混合的體積質量比優選為1:0.25mL/g。

S3、將步驟S2制得的混合物真空冷凍干燥24h～48h，制成凍干粉，即為海洋合生元添加劑。

經實際測算，本發明制得的海洋合生元添加劑產品中三種芽孢桿菌的總含量>10¹⁰CFU/g。

本發明還提供了上述海洋合生元添加劑在刺參養殖中的應用，具體步驟為：將所述海洋合生元添加劑與海參基礎飼料按比例混合；

所述海洋合生元添加劑為所述基礎飼料質量的2～5％。

本發明的有益效果是：

1、本發明高效科學配伍益生菌及益生元，使二者協同作用，發揮“1+1>2”的效果，利用本發明所述合生元添加劑可同時發揮芽孢桿菌和海洋寡糖類益生元的雙重益生作用，選擇性促進外源性益生菌與內源性腸道有益微生物在動物腸道內定植及增殖，集益生菌的速效性和慢效應物質益生元的生長保護作用于一體，發揮協同效應，促進動物生長，激活宿主免疫系統，并直接或間接抑制有害微生物的繁殖，從而顯著提高刺參的生長性能及非特異性免疫應答，更好地促進動物健康生長。

2、本發明能改善刺參腸道微生態環境，促進刺參生長性能，提高刺參養殖品質與效益，可用作水產養殖功能性綠色飼料添加劑。

綜上所述，本發明依據腸道微生態營養學原理，在研究與把握現有水產添加劑基礎上，結合最新一代高通量測序與微生態菌群分析技術，科學篩選配伍特定益生菌和新型海洋寡糖類益生元，提供一種具有促進刺參生長及激活免疫系統的高效合生元制劑，使其充分發揮合生元各組分的益生作用，達到增強高密度集約化養殖模式下刺參的生長性能及抵御疾病的能力的目的，促進刺參養殖業的健康穩定發展。

具體實施方式

下面將說明本發明的具體實施方式：

實施例1

一、制備海洋合生元添加劑

步驟1：在改進后的2216E海洋培養基中分別發酵培養解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，培養溫度為30℃，pH 7.0，培養時間為48h，得到解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌發酵液，分別調節三種芽孢桿菌發酵液至1×10¹⁰CFU/mL，將三種芽孢桿菌菌液混合得到混合菌液；

所述三種芽孢桿菌發酵培養基為改進后的2216E海洋培養基，具體成分質量體積比為：

蛋白胨:殼寡糖:酵母膏:沙濾海水＝0.3:0.1:0.1:100(g:g:g:ml)；

步驟2：將上述三種芽孢桿菌混合菌液與海洋寡糖類益生元及脫脂奶粉混合，使海洋寡糖類益生元質量濃度為5％，脫脂奶粉保護劑質量濃度為10％；

上述海洋寡糖類益生元為聚合度為2～10的殼寡糖；

所述殼寡糖分子量<2000。

步驟3：將步驟2溶液與礦物質載體沸石粉混合，體積質量比為1:0.25ml/g；

步驟4：將步驟3制得的混合物真空冷凍干燥24h，制成凍干粉，即為海洋合生元添加劑。

二，試驗用刺參飼料的制備

步驟1：刺參基礎飼料的選擇，此處提供一種飼料配方(具體配方應視情況選擇)：稱量海帶粉2kg，鼠尾藻粉2kg，豆粕粉1kg，魚粉1kg，海泥3kg，貝殼粉0.75kg，復合維生素和礦物質0.25kg；

其中，所述復合維生素和礦物質與現有技術的基礎飼料所需添加成份和數量的要求相同。在此提供一種優選方式，所述復合維生素和礦物質成分為(mg/g)：維生素B10.5,維生素B21.0,煙酸0.75,維生素B61.5,維生素B120.05,泛酸鈣10,維生素C 50,氯化膽堿200,維生素K2,維生素A0.6，維生素E10，α纖維素723.6；MgSO₄-7H₂O 100,ZnSO₄-7H₂O 3,CoCl₂-6H₂O 1,MnSO₄-H₂O1,Al Cl₃-6H₂O 0.2,FeSO₄-7H₂O 30,CuCl₂-2H₂O 63，碳酸鈣801.8。

步驟2：飼料原料預處理，干燥至含水量不高于15％，粗粉碎至100～200目；

步驟3：每天投喂飼料之前，將本發明合生元制劑按照基礎飼料重量5％的添加量進行充分拌料混合，其中海洋合生元添加劑中益生菌的含量>10⁹CFU/g，在基礎飼料中有效含量>10⁸CFU/g，然后對刺參進行飼喂。

三，刺參的飼養與管理

選擇大小相似的健康刺參作為實驗對象，平均體重10g左右?？疾焐鲜霭l明合生元制劑對對刺參生長及免疫的促進效果。實驗開始前進行適應性暫養，所有養殖箱24h曝氣，采用流水系統，避光，每天更換30％的養殖水體，每周吸低排污一次，整個實驗過程中，溶氧≥6mg/l，水溫保持于16-18℃，pH 7.9-8.1，鹽度為30-32ppt。每天固定時間分別投喂基礎飼料及加入本發明合生元制劑的飼料，投喂量為刺參體質量的5％，試驗進行60天。

四，刺參樣品采集與數據分析

1.生長性能測定

存活率：N₂/N₁×100

日增重：(W₂-W₁)T^-1

其中N₂和N₁分別為每個平行刺參終末頭數和初始頭數，W₂和W₁分別為每個平行刺參終末體重和初始體重，T為試驗天數。

2.免疫指標的測定

刺參體腔細胞吞噬率測定

經結晶紫染色及甲醛滅活后濃度為10⁹cfu mL^-1的金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus Rosenbach)與一定體積的刺參體腔細胞懸液一起加入到一塊48孔板中，反復吸打，使細胞及菌液充分混合。調整細胞懸液體積及菌液體積使細胞密度：細菌密度＝1:50。18℃下避光反應1h，每隔20min吸打一次。然后取40μL混合液輕輕滴于載玻片上，涂片，待干。加5％甲醛(溶于生理鹽水)，固定吸附在玻片上的吞噬細胞3min，用蒸餾水沖洗，置倒置顯微鏡下觀察。計數100個吞噬細胞，吞噬率的計算公式為：

細胞吞噬率(％)＝總共發生吞噬作用的吞噬細胞數目/細胞總數×100

免疫相關酶活的測定

超氧化物歧化酶、溶菌酶及一氧化氮合酶活均采用試劑盒(購買自南京建成生物工程研究所)測定。

3.抗病力測定

在60d養殖實驗結束后,每個平行組隨機抽取10只刺參，每只刺參體腔注射100μL濃度為1×10⁹cfu mL^-1刺參致病菌—燦爛弧菌的菌懸液，連續注射3天，期間不進行飼料投喂，觀察兩周后，統計刺參累計發病率(累積發病率＝發病刺參個數/刺參總數)。

本發明合生元對刺參生長性能及非特異免疫力的影響如表1及表2所示：

表1.飼喂本發明合生元對刺參生長性能的影響(n＝30)

表2.飼喂本發明合生元對刺參免疫力及抗病力的影響

試驗結果表明：在刺參基礎飼料中額外添加本發明合生元，可以顯著提高刺參特定生長率等生長性能，有效增強刺參體腔細胞吞噬率、超氧化物歧化酶、溶菌酶及一氧化氮合酶活性，并能夠顯著降低刺參在燦爛弧菌脅迫下的累計發病率。因此，在刺參基礎飼料中適量添加本發明合生元能夠顯著促進刺參生長性能與非特異免疫力及抗病力，可以作為刺參新型綠色飼料添加劑使用。

本發明采用合生元的模式制得飼料添加劑，合生元是益生菌與益生元科學配伍制成的生物制劑，其本質不是兩種產品的簡單疊加，而是一個質的變化。通過高效配伍特定的益生菌和益生元，有針對性地促進外源性益生菌在動物腸道中定植和生長，并選擇性刺激內源有益菌群的增殖，調節免疫系統，提高機體對病原微生物的防御能力，改善動物腸道微生態群系平衡，起到益生菌和益生元的雙重作用，達到“1+1>2”的效果，從而更好地促進動物的生長和健康。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。