專利名稱：氧化應激抗性基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物，尤其是轉基因植物，植物部分及植物細胞，它們過量表達鐵結合蛋白(如鐵蛋白)，及針對廣泛的非生物及生物性氧化應激環(huán)境(如針對百草枯和萎蔫酸的處理以及針對病毒、細菌和真菌感染)有增強的抗性。本發(fā)明也包括編碼苜蓿鐵蛋白或其功能性變異體的核苷酸序列，以及用所說的序列使得植物對氧化應激條件產生抗性。
本發(fā)明有益于減少因廣泛的應激條件而導致的對作物的環(huán)境損害。
至于本說明書和權利要求，我們將依據(jù)給定的定義應用下述技術術語。至于本發(fā)明的解釋，應理解成下述定義的術語在應用當中是符合給定定義的，即使所說的定義與所說的技術術語的通常解釋吻合得不完全一致。
蛋白的“功能性變異體”是這樣一個多肽其氨基酸序列可通過替換、缺失和/或添加一個到多個氨基酸殘基而從原來蛋白的氨基酸序列衍生得到，(衍生方式要保證)盡管氨基酸序列有變化，但其功能性變異體至少保存原來蛋白的生物學活性當中的至少一種活性的一部分，該種活性對該領域的技術人員來說可以測定。功能性變異體與從之衍生而來的蛋白通常至少有50％的同源性(即其氨基酸序列50％是一致的)，有利的情況下至少有70％的同源性，更有利的情況下至少有90％的同源性。某蛋白的任一功能部分或其變異體亦稱為功能性變異體。
術語“過量表達此處用其最可能的廣義。一種特殊類型的分子(通常指一多肽或一RNA)當被說成在一個細胞內“過量表達”，指的是該分子表達的水平大大超過高出天然水平(例如超過20％)且可檢測到。細胞內一種分子的過量表達可通過傳統(tǒng)的突變和篩選技術以及遺傳操作方法完成。術語“異位表達”此處是指一種過量表達的特殊實現(xiàn)形式，包含這樣一種意思，例如一個異位表達的蛋白在植物的一個空間位點表達但自然狀況下此處它根本上不表達(或檢測不到)，此即，所說的蛋白在所說的位點上過量表達。
植物，植物部分，一個植物組織或一個植物細胞當它可以忍受重大的可檢測到的(例如，至少20％)更強的破壞效應，例如用某一類型的破壞性藥劑基劑量或強度更強，而較之于天然的對應部分并不受到任何可檢測到的損害。便稱為就擁有了針對一個損傷效應，例如破壞性藥劑的“增強抗性”。
在本發(fā)明描述的框架之內，“鐵蛋白”定義成該領域中通常的意義，指一個能結合鐵離子的蛋白(Theil E.C.，1987，生化年鑒(Ann.Rev.Biochem.)56289-315)。真核生物鐵蛋白家族的成員在氨基酸序列和三維結構兩方面均高度保守(Lobreaux，S.等，1992，生化雜志(Biochem.J.)288931-939)。
術語“氧化應激”用的也是其非常廣泛的意義，包括所有類型的非生物性(例如用不同的化學試劑處理或暴露于極端的天氣環(huán)境如高溫、低溫或干燥條件下)和生物性(不同的感染試劑感染)應激條件，在其損傷效應的表現(xiàn)當中，氧化產生的活性自由基起到了一個可檢測到重要作用。
在它們的不同發(fā)育時期，植物均被暴露于廣泛的生物性和非生物性應激條件下。因此，發(fā)展廣泛的應激抗性力增強的良種畜是具有很高經濟意義的重要任務。
在應激條件下例如光照強度高，UV-B輻射，重金屬污染，高溫或低溫，缺水，澇害，損傷，病毒、細菌、真菌感染，昆蟲之類傷害，氧氣毒性可以明顯對作物產生損害。活性氧如單線態(tài)氧、超氧自由基(O2-)，羥自由基(OH+)和過氧化氫(H2O2)對應激植物的受傷起到了關鍵性作用。一個好的證據(jù)是由超氧自由基(O2-)和過氧化氫造成的生物學損傷依賴于鐵的存在。細胞內的自由鐵庫可通過Haber-Wiess或Fenton反應與H2O2或O2-反應從而產生活性羥自由基(Halliwell和Gutteridge，1984，Biochem.J.2191-14)。在細胞內大部分非代謝的鐵都被滯留在鐵蛋白中；因此鐵蛋白可以限制鐵的可獲得，也就可以限制活性羥自由基的產生。編碼鐵蛋白的cDNA已從多種植物中分離出來。這些蛋白質在氨基酸序列和三維結構方面均高度保守(Lobreoux S.等，1992，生化雜志(Biochem.J.)288931-939)。鐵蛋白位于葉綠體內且鐵可激活它們的合成(Seckbach，J.1982，植物營養(yǎng)雜志(J.Plant.Nutr.)5369-394；Lobreaux等1992，植物分子生物學(Plant Mol Biol)19563-575)。在正常的生長條件下，鐵蛋白僅只在胚胎內合成而不在營養(yǎng)器官如根和葉中合成(Lobreaux和Briat生化雜志(Biochem.J.)1991，274601-606)。
在那些鐵蛋白的合成和降解脫離了正常的代謝調控的系統(tǒng)中，可望出現(xiàn)鐵蛋白分子顯著的抗氧化劑效應。在氧化應激條件下已顯示，鐵蛋白分子發(fā)生降解，其釋放的鐵離子極大地提高了有害基團的生產速率(Cairo等1995，生化化學雜志(Journal of BiochemicalCemistry)270700-703)。
專業(yè)內部人士知道大量的傳統(tǒng)的植物育種方法和遺傳操作技術以提高特定作物對預定的應激條件(例如針對寒冷、干旱、紫外光或病原)的抗性。然而，這些已知的方法此處不去一一詳述，因它們和本發(fā)明中方法相去甚遠。這些以前發(fā)明的方法的一個共同特征是，它們提高的是不同植物針對一種單一的預設的應激條件(或針對來源相同的有限的一組應激條件)的抗性，例如通過表達一個特定的抗性基因。然而本領域還沒有一種特定的方法可以為植物提供針對廣泛的包括非生物和生物應激條件的抗性。
如此，本發(fā)明的目的是提供一個新的、普遍適用的方法，以提供作物，尤其是轉基因作物，它們針對廣泛的包括非生物和生物應激條件的增強的抗性。
根據(jù)另一方面，這也是本發(fā)明的一個目的即提供作物和育種材料，優(yōu)選為轉基因的植物，它們針對廣泛的包括非生物和生物應激條件的增強抗性。
基于其以前的內容，發(fā)明人逐漸明了一個重要的新的遺傳操作方法將被開發(fā)出來，以完成上述目標，或許能揭示不同的非生物和生物應激條件損傷機制中的一個共同步驟。
因此，本發(fā)明的方法建立在新的理論概念上，即在植物不同的器官中過量表達或異位表達的鐵蛋白或其他鐵結合蛋白，例如轉鐵蛋白，將會降低細胞內的鐵濃度，因此亦將減少氧誘導自由基團的損傷效應。此處有必要強調的是，本發(fā)明的方法絕對是新的，由于本領域中沒有公開過某種方法可以賦予植物針對廣泛的非生物的和生物的應激條件以抗性。而且，迄今為止也未公開某種方法其中鐵蛋白在植物中因任何理由以任何方式過量表達。
因此，為了達到本發(fā)明的上述目標，我們從苜蓿(Medicago sativaL.)克隆了鐵蛋白cDNA基因，在煙草的營養(yǎng)組織中進行了過量表達。
經發(fā)現(xiàn)，和本發(fā)明的基本概念相一致，在營養(yǎng)組織中異位表達苜蓿鐵蛋白的轉基因煙草較之原來的煙草植株對非生物性(用不同的化學試劑處理)和生物法(病毒，細菌和真菌感染)應激條件的抗性大大提高且轉化子顯示總體適應能力和再生特征也有改進。
還要強調的是，與本發(fā)明的基本概念相一致，有可能過量表達的鐵蛋白分子是通過結合植物細胞內的自由鐵離子而表達它們的綜合防護效應，可以設想，通過過量表達其他鐵結合蛋白，例如轉鐵蛋白，可產生類似的保護效應。
因此，本發(fā)明提供植物細胞，其過量表達鐵結合蛋白，并對氧化應激有增強的抗性。本發(fā)明的植物通過此處介紹的遺傳操作方法更利于產生，但也可以通過傳統(tǒng)的突變和篩選技術生產。本發(fā)明的轉化子植株較之于它們未經修飾的鐵結合蛋白表達水平未提高的對照部分，顯示了大大提高的針對氧化應激條件的抗性。
依據(jù)本發(fā)明的植物細胞最好是轉基因細胞，其通過導入核酸而轉化，導入核酸可用例如載體的形式，該核酸編碼一個鐵結合蛋白，最好是鐵蛋白的表達。
依據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明提供植物細胞過量表達一種鐵蛋白，它有如附屬序列表中SEQ ID No1所示的氨基酸序列，或該蛋白功能性變異體，上述功能性變異體與所說的鐵蛋白多肽至少達50％的同源性，更為有利地，至少70％的同源性為更有利，至少90％的同源性為最有利。
本發(fā)明還提供包括根據(jù)本發(fā)明細胞的植物，最好是轉基因植物，及其部分。
依據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，用10μM百草枯處理本發(fā)明的植物葉子70小時之后其光合反應的強度并未下降。
依據(jù)本發(fā)明的植物、植物部分或植物細胞針對萎蔫酸的處理和/或病毒和/或細菌和/或真菌起源的感染優(yōu)選擁有增強的抗性。
本發(fā)明還提供分離的、富集的、無細胞和/或重組的核酸序列，包括或由下述核苷酸序列組成，該核苷酸序列編碼有序列表中的SEQID No2序列的苜蓿鐵蛋白，或其功能性變異體。優(yōu)選的核酸與SEQID No1(

圖1的DNA序列)至少有90％的同源性，更優(yōu)選的情況至少有95％的同源性且最優(yōu)選的情況至少有98％的同源性。優(yōu)選的情況下這些核酸是cDNA，重組載體或其他重組構建體。
本發(fā)明也包括應用這些核酸制備與本發(fā)明植物細胞，植物部分和植物。
下述的

發(fā)明內容
和實施例顯示在植物的營養(yǎng)組織中合成鐵結合蛋白鐵蛋白提供了針對百草枯產生的自由基的抗性。與本觀察結果相一致我們也證實用廣譜的不相關的病原體感染本發(fā)明的轉基因植物所誘發(fā)的癥狀有顯著的減少。本發(fā)明基于鐵結合蛋白異位表達的新技術，因此就潛在著很高的農業(yè)價值，它可能減少作物由于生物性或非生物性應激條件引起的普遍氧化損害。
雖則不想受任何理論解釋的限制，我們認為上述發(fā)現(xiàn)支持這樣的假設由于鐵結合蛋白(鐵蛋白)的過量生產，本發(fā)明植物中的鐵離子就可以更有效地結合，因此，氧誘導自由基引起的損傷減少了且本發(fā)明植物的總體適應能力和再生性質有了提高。依據(jù)本發(fā)明的植物將也能夠顯示針對目前尚未檢測的其他應激條件的抗性，例如，針對極度的低溫或高溫和干燥，其中包含有類似的鐵介導的退化作用。
雖然上述內容對專業(yè)人員來說已十分明了，我們還想在此強調依據(jù)本發(fā)明的方法的普遍適用性。我們已經證實在植物營養(yǎng)組織中異位表達苜蓿來源的鐵結合蛋白可使轉基因煙草植株增強針對廣譜的應激條件的抗性。由于本發(fā)明的開拓性技術是基于絕對普通的概念即減小植物靶組織的鐵離子濃度，本領域的技術人員將會理解本發(fā)明的優(yōu)點不能被限制在已顯示的特定的實施方案中，而是相反確保植物總體的應激抗性的此種新方法可以應用于其他任何有農業(yè)或園藝價值的作物實例中。
另經證實的是，用兩種不同類型的啟動子(一種是植物的，一種是病毒的)胚胎特異性苜蓿鐵蛋白在煙草植株的營養(yǎng)組織中異位過量表達，對靶組織沒有任何損害。于是可以設想，任何類型的植物特異性啟動子(組成型的或空間的和/或發(fā)育調節(jié)型的)可用于本發(fā)明中以在期望的植物部分或組織中過量表達鐵結合蛋白。
由于有害基因的濃度通常在光合綠色組織中最高，這些組織是本發(fā)明的方法第一有用的靶標。然而應該理解，由于以上已論證的基本概念的高度普適性，故本發(fā)明根本不能局限于賦予綠色組織的應激抗性，它對設想暴露于任何氧化應激條件(例如被任何病原體感染)的所有其他感興趣的植物部分(例如，根、莖、花、果實或前述的特異部分)賦予抗性都有作用。1從苜蓿(Medicago sativa)分離的鐵蛋白cDNA的核苷酸序列及其推測的氨基酸序列。下劃線的部分對應于轉運肽。圖2不同物種鐵蛋白氨基酸序列的對比。
HuHfer 人H亞基(Boyd等1985，生物化學雜志(J.Biol.
Chem.)26011755)HoLfer 馬脾L鏈(Heuterspreute和Chrichton 1981，F(xiàn)EBS Lett.129322)Peafer 豌豆種子鐵蛋白(Lobreoux S.等1992，生化雜志(J.Biochem.)288931)Msfer 1苜蓿鐵蛋白(未發(fā)表)圖3本發(fā)明中轉基因煙草植株營養(yǎng)組織中鐵蛋白mRNA的積累。圖4本發(fā)明中轉基因煙草葉細胞抽提物SDS-PAGE后檢測鐵蛋白。圖5本發(fā)明中轉基因煙草葉細胞植物用FLAG抗體經Western印跡分析檢測鐵蛋白。圖6SR1對照和本發(fā)明中C3轉化植株用10μM百草枯處理后葉盤熒光強度(Fv/Fm)的變化。圖7SR1對照與本發(fā)明中不同的轉化植株經10和20μM百草枯處理后葉盤熒光強度(Fv/Fm)的變化。圖8對照SR1和本發(fā)明的轉化植物經3天10和20μM百草枯處理后葉片中葉綠素含量。
本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案及其概念將以下述實驗性實施例的方式做進一步的闡釋。然而，應該可以理解，下述實施例僅僅是為了更好地理解本發(fā)明的精神，完全不是本發(fā)明范圍的解釋或限制，其范圍是在后續(xù)的權利要求中定義的。
在下述實施例中，我們論證了本發(fā)明在變?yōu)楝F(xiàn)實的過程中，有無數(shù)優(yōu)點。我們分離了一段編碼一個新的苜蓿鐵蛋白多肽全長cDNA克隆(MsFER1)并用此cDNA在不同的啟動子轉錄控制下于轉基因煙草的營養(yǎng)組織中表達鐵蛋白。在對表達鐵蛋白的轉基因煙草進行生化特性鑒定以后，我們證實它們當中的大部分對來源相差很大的不同的非生物性(用損害性化學試劑處理)及生物性(用病毒、細菌和真菌病原感染)應激條件有顯著增強的抗性。實施例1鑒定全長苜蓿鐵蛋白cDNA(MsFER)克隆并測定其核苷酸及推測的氨基酸序列為了構建一個cDNA文庫和分離編碼鐵蛋白的cDNA克隆，重組DNA技術的一般方法的應用參照Sambrook J.，F(xiàn)ritsch，F(xiàn).F.和Maniatis T.所著“分子克隆，實驗室手冊”(第2版，紐約冷泉港1989)中所述。
很明確地，苜蓿鐵蛋白cDNA克隆是以如下方式分離出來。
細胞總RNA由體外培養(yǎng)的主要由體細胞胚構成的苜蓿組織中提取。樣品中也存在少量的愈傷組織(Cathala等，1983，DNA，2329-335)。體細胞胚的形成是用植物生長素(2，4-二氯苯氧基乙酸)如Dudits等所述的方法休克誘導產生的(1991，細胞科學(J.CellScience，)99473-482)。
然后用oligo-dT纖維素層析的方法從細胞總RNA中分離物中純化mRNA(Aviv H.和Leder P.1972，美國自然科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)691408-1412)。
首條鏈cDNA在oligo dT引物存在的情況下用AMV逆轉錄酶合成。第二條鏈則由DNA聚合酶I合成。用RNase H處理之后，在用末端轉移酶添加上dC和dG同源連接物(homolinker)以后，cDNA與用PstI消化的pGEM2載體退火。產物轉化進大腸桿菌MC 1061株中，用100μg/L氨芐青霉素篩選。用25μg cDNA產生出2.5×105個初級轉化子。96％的克隆包含有顯著大小的cDNA插入子。其過程的詳細描述見De Loose等(1988，基因(Gene)7013-23)。
然后用隨機測序預篩cDNA克隆的方法鑒定出50個EST。用Pharmacia T7測序試劑盒或USB測序2.0試劑盒按其操作說明書進行測序。以體細胞胚制備的RNA探針與cDNA克隆Northern雜交進行預篩選。強雜交克隆被篩選出來。
基于GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫的序列對比顯示一個cDNA克隆(被稱為MsFER1)與已知的鐵蛋白在推導出的氨基酸序列上高度同源，圖1所示既有MsFER1克隆的核苷酸(SEQ ID NO1)又有其氨基酸序列(SEQ ID NO2)。包含在此克隆中的cDNA插入子有1036bp長，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)在40和789之間。編碼的蛋白由251個氨基酸組成，它與不同來源的鐵蛋白有高度的氨基酸序列一致性。如圖2所示，植物鐵蛋白與人H及馬L鐵蛋白有39％～49％的氨基酸一致性，而豌豆和苜蓿鐵蛋白的成熟蛋白彼此十分相似(89％的氨基酸同源性)。然而，這兩種植物鐵蛋白，在葉綠體引導序列的相應區(qū)域差異很大。此處的氨基酸序列僅有47％的一致性。因此，剛剛描述的苜蓿鐵蛋白可看成鐵蛋白家族一個新的變種。實施例2將苜蓿鐵蛋白cDNA導入煙草植株以在營養(yǎng)組織中異位表達此蛋白所用的轉化技術基于Hinchee等綜述的土壤桿菌基因轉運系統(tǒng)，見“植物細胞和組織培養(yǎng)”p.231-270，I.K.Vasil T.A Thorpe，KluwerAcademic Publisher 1994。在本實施例中我們用此系統(tǒng)和Pellegrineschi等描述的載體(1995，生物化學協(xié)會通訊(Transitions)23247-250)。
將MsFER1 cDNA克隆到轉化載體的BamHI/KpnI位點，于此它功能性地連接到核酮糖1，5-磷酸羧化酶小亞基基因的啟動子上。此啟動子最初由Mauer和Chui所描述(1985，核酸研究(Nucleic AcidRes.)72373-2387)，對植物綠色組織中的表達特別有用。稱為A2，C3和C8的轉化煙草植株在所得的轉基因克隆，攜有此結構。作為選擇，也將MsFER1 cDNA連接到Benfey等描述的病毒啟動子CaMV35S(1989，The EMBO J.82195-2202)上。為了此克隆全長的構建體，我們用下述PCR引物，其在Per Septives自動DNA合成儀中合成。
CCG AAT TCC ATG GCT CTT TCA GCT TCC (SEQ ID NO3)Eco RI位點鐵蛋白轉運肽的克隆位點我們也生產了一種截短的MsFER1 cDNA版本，它缺少靶向引導序列的一個重要部分(見圖1)。在此克隆程序中我們用了下述引物CGG AAT TCC ATG GAT GGT GAT AAG AGG(SEQ ID NO4)Eco RI位點轉運肽內部的克隆位點上述寡核苷酸和T7測序引物(Boehringer Mannheim)被用以對指定的DNA片段進行PCR擴增(Mullis和Faloona 1987，酶學方法(Meth.Enzymol.)155335)。
將經EcoRI/KpnI消化的PCR產物(KpnI限制位點來自T7引物序列)克隆進pFLAG-ATS載體(Scientific Imaging System Kodak，USA)。后者經同樣的限制酶消化過。這些構建物中FLAG序列的存在使得其蛋白合成可用抗FLAG M2抗體進行免疫學追蹤(Scientific Imaging System Kodak，USA)。
為了產生全長FLAG FERR和部分(pt)FLAG FERR構建體，我們合成了以下Bam-Flag寡核苷酸CGG ATC CATGGA CFA CAA GGA CGA GGA(SEQ ID NO5)BamHI位點 MET FLAG編碼序列用此引物和pFLAG載體的C24測序引物，制備PCR產物并在BamHI/KpnI位點克隆進轉化載體。
如此構建的二元載體(binary vectors)被轉進土壤桿菌株中。然后煙草葉盤與此土壤桿菌細胞共培養(yǎng)，轉化子在如Claes等所述的含卡那霉素的培養(yǎng)基中進行篩選(1991.植物雜志115-26)。一級轉化子經自花傳粉，T2植物經進一步特征鑒定。實施例3轉基因煙草中鐵蛋白異位合成的分子證據(jù)Northern印跡雜交被首先用來顯示所述導入構建物的功能活性。Northern雜交的操作是依據(jù)廣泛應用的方案(Sambrook J.Fritsch F.F.和Maniatis T.“分子克隆，操作手冊”2版，冷泉港紐約，1989)。第一，是從轉化子營養(yǎng)組織中分離總RNA樣品(見Cathala等1983，DNA 2329-335)。在甲醛溶液中經瓊脂糖凝膠電泳之后，RNA被轉移到Hybond-N濾膜上(Amersham，Inc.)。放射標記探針是經隨機引物32P-標記而產生的(Freinberg A.P.和Vogelstein B.1983生化年鑒(Anal.Biochem.)137266-267)。經4-12小時甲醛存在下的預雜交后，再在42℃雜交16-24小時。洗滌條件如下65-72小時，0.1×SSC，0.1％SDS。如圖3所示，在轉化植物中有大量鐵蛋白mRNA的積累。
部分純化后鐵蛋白的合成就用Laulhere和Laulhere所述的生化方法(1989，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2643629-3635)進行分析。經SDS-PAGE后，對照SR1植物和轉化子(C3，A2，C3)的蛋白圖差異顯著。后者積累了不同數(shù)量分子量的26kDa的鐵蛋白(圖4)。用FLAG檢測系統(tǒng)也可以用化學發(fā)光(Super SigfnalRM-CL-HRP系統(tǒng)，Pierce)在多個轉基因煙草植株中(圖5)顯示鐵蛋白的合成。既有的分子數(shù)據(jù)令人信服地顯示了對照植物中鐵蛋白的缺乏和轉化子營養(yǎng)組織中該蛋白的積累。實施例4鐵蛋白的異位合成為轉基因植物提供了氧化應激抗性為了檢驗本發(fā)明的基本概念，我們分析了對照和轉化煙草對百草枯(Pq)的抗性。很好地證實了光合電子傳遞過程產生的電子減少Pq并且自由基形成(Ashton F.M.和Crafts A.S.1981，除草劑作用的模式，Wiley，紐約)。對照和轉化植物的葉盤被暴露至10或20μMPq。
功能性損傷用Vass I.等描述的PAM熒光探測儀(1996，生物化學，358964-8973)測定該光激發(fā)熒光而監(jiān)測。作為一個例子，圖6顯示對照SR1葉片在10μM Pq處理60小時后光合功能的喪失，而C3轉化子在分析過程中保留住了其光合活性。其他兩個轉化子(Full9，Pt2)經Pq處理后可觀察到類似反應，其中鐵蛋白基因是在CaMV35S啟動子控制下表達的。這些實驗經過數(shù)次重復(也參見圖7)并且功能特性鑒定令人信服地證實了轉化子中的百草枯抗性。這種抗性也可以在監(jiān)測到葉綠素含量變化的過程中看到(圖8)。
用Pq作為自由基的誘導物，此結果支持這樣的結論在其營養(yǎng)組織中合成鐵蛋白的轉化植物對自由基引起的損傷表達了增強了的忍受性。此處我們必須提及被分析的轉化植物在溫室條件下的生長過程中缺乏任何可見的變化。轉化子的光合作用與對照SR1植物相似。在對照條件下這些植物顯示了正常的葉綠素含量(圖8)。實施例5過量生產鐵蛋白的轉化植物對萎蔫酸的處理有增強的抗性病原發(fā)生中自由基功能已被K.E.Hammond-Kosack和J.D.G.Jones提出來(1996，植物細胞81773-1791)。因此，我們檢測了在綠色組織中表達苜蓿鐵蛋白基因轉化子的癥狀形成。首先，我們分析了作為非特異性真菌毒素的萎蔫酸的效應。萎蔫酸以不同濃度注射到對照SR1和轉基因(A2，C3和C8)煙草葉片中。注射兩天后我們分析葉組織的壞死程度。表1總結了三個試驗的結果。
表1表達鐵蛋白的轉化植物在萎蔫酸處理后減少壞死的情況

-無壞死；XXX＝嚴重壞死(或注射葉區(qū)域壞死的百分比)本資料顯示轉化植物葉片的壞死有相當多的減少。這些結果也證明了對真菌感染引起損傷的增強抗性。實施例6過量生產鐵蛋白的轉化植物對假單胞菌感染有增強的抗性基于同樣的概念，我們將丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)細菌懸液注射進煙草葉片中。20小時以后，分析其壞死程度(HR)。表2總結了兩個轉基因株系(A2，C8)中壞死減少的結果。
表2細菌注射后壞死程度

上述數(shù)據(jù)顯示最少有兩個轉化子(A2和C8)對細菌感染引起的損傷有大大增強的抗性。實施例7過量產生鐵蛋白的轉化植物對葡萄孢屬和鏈格孢屬真菌感染有增強的抗性我們檢測了依據(jù)實施例2的轉基因株系對兩種真菌瘤原諸如互格鏈格孢(Alternaria alternata)和灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)的反應。分離葉片并用真菌培養(yǎng)中的瓊脂塊(5mm直徑)接種。表3總結了經處理的對照和轉化植物壞死葉面積的大小。
表3真菌性病原對轉化植物的效應

從以上資料，可以推出轉化的煙草植物—包括全長的或截短的鐵蛋白基因—在其葉中表達鐵蛋白者與對照植物相比顯示癥狀大為下降(雖然程度不同)。實施例8過量產生鐵蛋白的轉化植物對煙草壞死病毒(TNV)感染有增強的抗性在用病毒感染植物的過程中氧的產生在病原發(fā)生中起到了一個重要作用。因此我們檢測了轉化和對照(SR1)植物在對抗煙草壞死病毒(TNV)感染中的反應(表4)。
表4轉化煙草在TNV感染后損傷數(shù)目和大小的減少實驗1SR1(對照) 17.4±2.5(全部損傷，cm2)C3(轉化子) 6.4±1.4C8(轉化子) 6.5±1.2A2(轉化子) 6.1±1.7實驗2 50.0±10.0(損傷數(shù)目)SR1(對照) 35.8±21.7Pt1(轉化子)25.8±7.3Pt2(轉化子)12.5±8.4Pt5(轉化子)18.7±12.3Pt9(轉化子)38.3±8.6Full4(轉化子) 45.0±19.1Full5(轉化子) 32.0±16.8Full6(轉化子) 46.2±6.1Full9(轉化子) 21.7±13.7如表4所示，在攜有RUBISO小亞基啟動子控制下的苜蓿鐵蛋白基因的轉化煙草株系，其損傷數(shù)目可見有重大下降(C3，C8和A2)。可能有功能性意義的是，在CaMV35S啟動子的控制下表達鐵蛋白基因的轉化株系中，兩個表達截短鐵蛋白基因的株系在癥狀上顯示了最顯著的下降。
序列表(1)總的信息(i)申請人(A)名稱英國技術集團國際有限公司(B)街道弗利特街道10號(C)城市倫敦(E)國家聯(lián)合王國(大不列顛)(F)郵編(ZIP)EC4M 7SB(A)名稱MARIA DEAK(B)街道VAG U 3/B(C)城市SZEGED(E)國家匈牙利(F)郵編(ZIP)6724(A)名稱DENES DUDITS(B)街道BERKERT U 36(C)城市SZEGED(E)國家匈牙利(F)郵編(ZIP)6726(A)名稱KAROLYNE TOROK(B)街道TAPE OSTROM U 64(C)城市SZEGED(E)國家匈牙利(F)郵編(ZIP)6753(A)名稱LASZLO SASS(B)街道PIHENO UT 18/A(C)城市SZEGED(E)國家匈牙利(F)郵編(ZIP)6728
(A)名稱BALAZS BARNA(B)街道STOLLAR BELA U 16(C)城市BUDAPEST(E)國家匈牙利(F)郵編(ZIP)1055(A)名稱ZOLTAN KIRALY(B)街道HANKOCZY JENO U 17(C)城市BUDAPEST(E)國家匈牙利(F)郵編(ZIP)1022(ii) 發(fā)明題目應激和病原抗性植物(iii)序列數(shù)目5(iv) 計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM個人兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi) 在先申請資料(A)申請?zhí)朒U 9700762(B)申請日期1997-4-16(vi) 在先申請資料(A)申請?zhí)朒U 9700762(B)申請日期1997-9-22(vi) 在先申請資料(A)申請?zhí)朒U 9700762(B)申請日期1998-3-9(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1036堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii) 分子類型cDNA(iii)假論無(iv) 反義無(vi) 最初來源(A)生物首蓿(B)株L(ix) 特征(A)名稱/關鍵詞轉運肽(B)位置40…201(ix) 特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置40…789(xi) 序列描述SEQ ID N01CTCAATTTTC TCAACGACCC TTTTTGTTAT TCTTCTTTA ATG GCT CTT TCA GCT54Met Ala Leu Ser Ala1 5TCC AAA GTT TCG ATC TTT TCA CCA TCA CCT ATC GTG GGT CAT TTC TCA 102Ser Lys Val Ser Ile Phe Ser Pro Ser Pro Ile Val Gly His Phe Ser10 15 20AAA AAC ACC ACT TTT TCT TCT TTG AAT CTT CCT ATG GAT GGT GAT AAG 150Lys Asn Thr Thr Phe Ser Ser Leu Asn Leu Pro Met Asp Gly Asp Lys25 30 35AGG AAG AAC GTG AAG GTT CAT GCT GCT GCT GCA AAT GCA CCA ACG GCA 198Arg Lys Asn Val Lys Val His Ala Ala Ala Ala Asn Ala Pro Thr Ala40 45 50TTA ACA GGT GTT ATC TTT GAA CCG TTT GAA GAA GTC AAG AAA GAT GTT 246Leu Thr Gly Val Ile Phe Glu Pro Phe Glu Glu Val Lys Lys Asp Val55 60 65CTT GCT GTT CCT ATT GCT CAT AAT GTT TCC TTG GCT CGT CAG AAT TAT 294Leu Ala Val Pro Ile Ala His Asn Val Ser Leu Ala Arg Gln Asn Tyr70 75 80 85CAA GAT GAA GTT GAA TCT GCT ATC AAT GAA CAG ATT AAT GTG GAA TAC 342Gln Asp Glu Val Glu Ser Ala Ile Asn Glu Gln Ile Asn Val Glu Tyr90 95 100AAT GTT TCC TAT GTG TAC CAC TCT TTG TTT GCA TAC TTT GAC AGA GAC 390Asn Val Ser Tyr Val Tyr His Ser Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Arg Asp105 110 115AAC GTT GCT CTC AAG GGA CTT GCC AAG TTC TTT AAG GAA TCT AGT GAG 438Asn Val Ala Leu Lys Gly Leu Ala Lys Phe Phe Lys Glu Ser Ser Glu120 125 130GAA GAA AGA GAG CAT GCT GAG AAG CTC ATG AAA TAC CAG AAT ATT CGT 486Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Tyr Gln Asn Ile Arg135 140 145GGT GGA AGA GTG GTG CTG CAC CCT ATT GTG AGC CCT CCC TCG GAA TTT 534Gly Gly Arg Val Val Leu His Pro Ile Val Ser Pro Pro Ser Glu Phe150 155 160 165GAT CAT GCA GAA AAG GGA GAT GCA TTA TAT GCC ATG GAA TTG GCT CTG 582Asp His Ala Glu Lys Gly Asp Ala Leu Tyr Ala Met Glu Leu Ala Leu170 175 180TCT TTG GAG AAG TTA GTA AAT GAG AAA CTT CTG AAT GTT CAC AGT GTG 630Ser Leu Glu Lys Leu Val Asn Glu Lys Leu Leu Asn Val His Ser Val185 190 195GCT GAT CGT AAC AAT GAT CCT CAA TTG GCA AAT TTC ATC GAG AGC GAG 678Ala Asp Arg Asn Asn Asp Pro Gln Leu Ala Asn Phe Ile Glu Ser Glu200 205 210TTT TTG GTA GAG CAG GTT GAA TCA ATT AAG AAG ATA TCA GAG TAT GTG 726Phe Leu Val Glu Gln Val Glu Ser Ile Lys Lys Ile Ser Glu Tyr Val215 220 225ACT CAA CTG AGA TTA GTT GGA AAG GGT CAC GGT GTG TGG CAC TTT GAT 774Thr Gln Leu Arg Leu Val Gly Lys Gly His Gly Val Trp His Phe Asp230 235 240 245CAG ACT CTT CTC CAT TGATTAATAT GATGTTTGAT CTTGAAGAAG CTACGTGTTG 829Gln Thr Leu Leu His250TTTTTACATT ACTGGAATAG TGAATAAATG AAATGTATTC TCCTAGGTAA TTTTAGAACG 889TAGAAGCTGT GTGTAATATT TTAGTTGCTT AGTAAGAATT ATGTGTAGAA GACTTGGAGC 949CATAATAACT GTTTGTAGCT TGCAGAAATT ATTTTGTTAG AAATGAAAAT GAGCTTGGCT 1009ATTACTACTA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1036(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度250氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Leu Ser Ala Ser Lys Val Ser Ile Phe Ser Pro Ser Pro Ile1 5 10 15Val Gly His Phe Ser Lys Asn Thr Thr Phe Ser Ser Leu Asn Leu Pro20 25 30Met Asp Gly Asp Lys Arg Lys Asn Val Lys Val His Ala Ala Ala Ala35 40 45Asn Ala Pro Thr Ala Leu Thr Gly Val Ile Phe Glu Pro Phe Glu Glu50 55 60Val Lys Lys Asp Val Leu Ala Val Pro Ile Ala His Asn Val Ser Leu65 70 75 80Ala Arg Gln Asn Tyr Gln Asp Glu Val Glu Ser Ala Ile Asn Glu Gln85 90 95Ile Asn Val Glu Tyr Asn Val Ser Tyr Val Tyr His Ser Leu Phe Ala100 105 110Tyr Phe Asp Arg Asp Asn Val Ala Leu Lys Gly Leu Ala Lys Phe Phe115 120 125Lys Glu Ser Ser Glu Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys130 135 140Tyr Gln Asn Ile Arg Gly Gly Arg Val Val Leu His Pro Ile Val Ser145 150 155 160Pro Pro Ser Glu Phe Asp His Ala Glu Lys Gly Asp Ala Leu Tyr Ala165 170 175Met Glu Leu Ala Leu Ser Leu Glu Lys Leu Val Asn Glu Lys Leu Leu180 185 190Asn Val His Ser Val Ala Asp Arg Asn Asn Asp Pro Gln Leu Ala Asn195 200 205Phe Ile Glu Ser Glu Phe Leu Val Glu Gln Val Glu Ser Ile Lys Lys210 215 220Ile Ser Glu Tyr Val Thr Gln Leu Arg Leu Val Gly Lys Gly His Gly225 230 235 240Val Trp His Phe Asp Gln Thr Leu Leu His245 250(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii) 分子類型其他核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(iii)假論無(iv) 反義無(xi)序列描述SEQ ID NO3CCGAATTCCA TGGCTCTTTC AGCTTCC 27(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C) 鏈型單(D) 拓撲學線性(ii) 分子類型其他核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(iii)假論無(iv) 反義無(xi)序列描述SEQ ID NO4GGGAATTCCA TGGATGGTGA TAAGAGG 27(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii) 分子類型其他核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(iii)假論無(iv) 反義無(xi)序列描述SEQ ID NO5CGGATCCATG GACTACAAGG ACGAGGA2權利要求
1.一種植物細胞，其特征在于它過量產生鐵結合蛋白。
2.權利要求1的植物細胞，其特征在于與野生型植物相比對氧化應激有增強的抗性。
3.權利要求1或2的植物細胞，其特征在于其鐵結合蛋白是鐵蛋白。
4.權利要求1到3中任一項的植物細胞，其通過導入的編碼表達鐵結合蛋白的核酸而被轉化。
5.權利要求1到4中任一項的植物細胞，其通過導入編碼鐵蛋白表達的核酸而被轉化。
6.權利要求1到5中任一項的植物細胞，其特征在于其鐵結合蛋白是具有SEQ ID No 2的氨基酸序列的鐵蛋白，或是其功能性變異體。
7.權利要求1到6中任一項的植物細胞，其特征在于其鐵結合蛋白與具有SEQ ID No 2的氨基酸序列的鐵蛋白的至少有50％的序列同源性。
8.權利要求1到7中任一項的植物細胞，其特征在于其鐵結合蛋白與具有SEQ ID No 2氨基酸序列的鐵蛋白至少有90％的序列同源性。
9.植物或植物的一部分，包含權利要求1到8中任一項的細胞。
10.權利要求9的植物或植物的一部分，其特征在于它是轉基因的。
11.權利要求9或10的植物或其一部分，其葉片的光合反應強度在用10μM百草枯處理70小時之后下降不超過10％。
12.權利要求11的植物，其特征在于其光合反應強度在處理之后并不下降。
13.權利要求8到12中任一項的植物和植物部分，其特征在于它對萎蔫酸處理和/或病毒和/或細菌和/或真菌來源的感染有增強的抗性。
14.權利要求8到13任一項的植物，其特征在于其鐵結合蛋白在營養(yǎng)組織中異位表達。
15.編碼具有SEQ ID No 1序列的苜蓿鐵蛋白或其功能性變異體的核苷酸序列在制備權利要求1到7任一項的植物細胞或制備權利要求8到14任一項的植物或植物部分中的應用。
16.分離的，富集的，無細胞的和/或重組核酸，包括SEQ ID No1的序列或與其具有至少90％的同源性或與這些序列互補的序列。
17.權利要求16的核酸，與之至少有95％的同源性或與之互補的序列。
18.權利要求16或17的核酸，形式是DNA。
19.權利要求16到18任一項的核酸，其不包括來自苜蓿的鐵蛋白引導序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物,尤其是轉基因植物,植物部分及植物細胞,它們過量表達鐵結合蛋白(如鐵蛋白),及針對廣泛非生物性及生物性氧化應激環(huán)境(如針對百草枯或萎蔫酸的處理以及針對病毒、細菌和真菌感染)有增強的抗性。本發(fā)明也包括編碼苜蓿鐵蛋白或其功能性變異體的核酸序列,以及用所說的序列使得植物對氧化應激條件產生抗性。本發(fā)明有益于減少因廣泛的應激條件而導致的對作物的環(huán)境損害。
文檔編號C12N15/29GK1252839SQ9880422
公開日2000年5月10日 申請日期1998年4月16日 優(yōu)先權日1997年4月16日
發(fā)明者M·代亞克, D·杜迪特斯, K·特勒克, L·扎斯, B·包拉日, Z·基拉伊 申請人:英國技術集團國際有限公司