本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體地，本發明涉及高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體及其基因和應用。

背景技術：

β-葡萄糖苷酶能水解結合于非還原性末端的β-d-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-d-葡萄糖和相應的配基，是纖維素分解酶系中的重要組成成分。

β-葡萄糖苷酶在飼料工業、食品工業、生物合成以及生物燃料等領域具有重要的應用價值。農業飼料豆粕中含有豐富的大豆異黃酮，且在天然大豆中大豆異黃酮主要以結合型存在。然而，研究表明結合型糖苷不能直接被小腸壁吸收，因此必須將結合型大豆異黃酮轉化為游離型大豆異黃酮才能發揮其藥理功效。β-葡萄糖苷酶可以將結合型大豆異黃酮轉化為游離型活性苷元，在豆粕飼料中添加一定的β-葡萄糖苷酶可以提高動物對大豆異黃酮的利用率。

在以玉米豆粕型日糧為主的飼料行業，單胃動物中胃腸道內的大豆異黃酮的水解是在一個較高的葡萄糖濃度環境下進行的，淀粉類能量物質水解產生的葡萄糖濃度遠大于大豆異黃酮的濃度，因此顯著抑制腸道內β-葡萄糖苷酶的活性，通過外源添加具有高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶是提高單胃動物腸道內大豆異黃酮的水解效率，提高飼料利用率的一個有效途徑。

β-葡萄糖苷酶也被廣泛應用于食品醫藥領域，在醫藥領域也具有重要應用。另外，在纖維素乙醇行業，具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶不僅可以減弱中間產物纖維二糖對上游eg和bgh的反饋抑制作用，也可以減弱產物葡萄糖對自身酶活的抑制。

因此，篩選或者改造得到較高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶對該酶的工業化應用具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供了一種高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體。

本發明的再一目的是提供編碼上述高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的基因。

本發明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。

本發明的再一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發明的另一目的是提供一種較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的應用。

本發明以來源于嗜酸耐熱脂環酸芽孢桿菌alicyclobacillussp.a4的β-葡萄糖苷酶為母本，采用分子生物學技術對β-葡萄糖苷酶序列進行定點突變表達。

根據本發明的較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體，是β-葡萄糖苷酶的催化通道非活性位點單點突變后得到的突變體，即β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由組氨酸“h”突變為精氨酸“r”

所較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的氨基酸序列如seqidno.1所示。

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編碼上述高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

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本發明還提供一種制備較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的方法：

1)以野生型重組質粒asbg1-pet30a(+)為模板，采用over-lappcr的方法，一步擴增得到含有較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體h315r-pet30a(+)；

2)將突變體重組載體轉化，誘導表達，獲得突變株，優選為h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

本發明還提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體，優選為h315r-pet30a(+)。將本發明的β-葡萄糖苷酶突變體基因與合適的表達載體進行連接，作為本發明的一個最優選的實施方案，優選over-lappcr的方法，一步擴增得到含有較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體h315r-pet30a(+)；

本發明還提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因的重組菌株，優選為重組菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

本發明還提供了上述較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的應用，例如作為飼料添加劑，應用于單胃動物的玉米豆粕型日糧飼料中。

本發明首先所要解決的技術問題是克服現有β-葡萄糖苷酶的不足，提供一種在水解大豆異黃酮時，具有較高耐受性或具有更好酶活促進效果的β-葡萄糖苷酶突變體。本發明的高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突變體水解底物pnpg時，葡萄糖的半抑制濃度ic50為1200mm，比野生型高出400mm。在水解1mm大豆苷時，10mm葡萄糖對野生型和突變體的酶活促進作用分別為163％和212％。

附圖說明

圖1為本發明的高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體與野生型β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受型曲線；

圖2為大豆苷水解時的葡萄糖耐受性hplc圖譜，其中，(a)未添加葡萄糖；(b)添加葡萄糖。

具體實施方式

試驗材料和試劑

1、菌株及載體：表達宿主大腸桿菌bl21(de3)購自北京全式金生物技術有限公司，表達質粒載體pet30a(+)為本實驗室保存。

2、酶類及其它生化試劑：kod-plus-neo高保真dna聚合酶購自toyobo公司，質粒小提中量試劑盒購自tiangen，dmt酶購自北京全式金生物技術有限公司。對硝基苯β-d-葡萄糖苷(p-nitrophenylβ-d-glucopy-ranoside，pnpg)購自sigma公司，大豆苷(daidzin)購自梯希愛化成工業發展有限公司，其它試劑均為國產分析純。

實施例1高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的制備

本發明以來源于嗜酸耐熱脂環酸芽孢桿菌alicyclobacillussp.a4β-葡萄糖苷酶asbg1(其氨基酸序列如seqidno.3)為母本，采用分子生物學技術對asbg1進行單點突變后表達。

seqidno.3如下所示：

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以野生型重組質粒asbg1-pet30a(+)為模板，在β-葡萄糖苷酶突變位點的左右各17bp處設計長約34bp并包含突變位點序列的突變引物，一步擴增得到含有較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體h315r-pet30a(+)。并轉化大腸桿菌感受態細胞bl21(de3)，獲得重組表達菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

表1.較高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體的突變引物

a，下劃線表示突變位點序列

將構建好的重組表達菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)過夜活化，后按1％轉接至裝有300mllb培養液(含50μg/mlkana)的1l大瓶中，37℃，220rpm培養至od600值約為0.6-0.8(約2-3h)時加入終濃度為0.6mmiptg誘導表達，并轉至28℃，190rpm誘導培養約8-10h。12,000rpm，10min離心收集菌體。粗酶液采用his-tag蛋白磁珠純化，經酶活測定和sds-page驗證，收集得到純蛋白洗脫峰。

實施例2重組高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體和野生型的比活分析

β-葡萄糖苷酶活性的測定：在405nm下測定酶水解底物pnpg所生成的產物對硝基苯酚(pnp)的量。

反應步驟：125μl4mmpnpg底物與125μl緩沖液混勻，加入250μl適當稀釋的酶液，于55℃反應10min，加入1.5ml1mol/l的na2co3終止反應，使用分光光度計測定od405值。

酶活單位的定義：1個β-葡萄糖苷酶活性單位(u)定義為在給定反應條件下，每分鐘分解底物pnpg生成1μmol對硝基苯酚(pnp)所需的酶量。

酶活測定表明：在反應條件下，測得野生型酶比活為54u/mg，重組較高葡萄糖耐受型突變體酶比活為52u/mg，兩者相差不大。

實施例3重組β-葡萄糖苷酶突變體和野生型的葡萄糖耐受性曲線測定

以pnpg為底物，分別測定重組β-葡萄糖苷酶突變體和野生型在不同葡萄糖濃度梯度(0-3mol/l)下突變體和野生型的酶比活，以添加葡萄糖的反應組和未添加葡萄糖的對照組酶活的相對比值表征相應濃度葡萄糖對突變體或野生型酶活的促進作用。以相應葡萄糖濃度為橫坐標，相對酶活為縱坐標繪制葡萄糖耐受性曲線。

測定結果(圖1)表明，重組較高葡萄糖耐受型突變體的葡萄糖耐受型顯著提高，野生型酶的ic50為800mm，重組較高葡萄糖耐受型突變體β-葡萄糖苷酶的ic50提高至1200mm。

實施例4重組β-葡萄糖苷酶突變體和野生型水解大豆苷時的葡萄糖耐受性測定

以大豆苷為底物測定重組β-葡萄糖苷酶突變體及野生型的葡萄糖耐受性，反應體系為400μl，由終濃度為1mm的大豆苷、外源添加的終濃度0或10mm的葡萄糖和適當稀釋的酶液組成，最適條件下反應10min后，于沸水浴5min終止反應。水解產物成分分析用反向高效液相色譜儀進行檢測，以底物大豆苷的水解率來表征酶活的高低。水解率＝100％×(ac-at)/ac,其中ac和at分別表示空白組(未加酶液)和處理組(加酶液)的底物峰面積。hplc圖譜如圖2，對圖譜進行定量分析表明，葡萄糖對重組較高葡萄糖耐受型突變體的酶活促進作用為212％，對野生型酶活促進作用為163％，突變體的葡萄糖促進作用高于野生型。

<110>中國農業科學院飼料研究所

<120>高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突變體及其基因和應用

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