專利名稱：一種海藻抗氧化活性成分的制備方法
技術領域：
本發明一種海藻抗氧化活性成分的制備方法，屬于海洋生物技術，用于研制開發醫藥保健品和功能食品的基料。
二技術背景海洋生物活性物質結構新穎、功能獨特是新藥研究開發和現代醫藥保健品開發的當今世界科學研究的活躍領域。
從對海洋藻類生物活性物質研究取得的許多成果來看，海洋藥物在實現這一偉大目標具有重要的潛力和優勢。利用海洋生物活性物質開發獨特的功能食品，這些是從陸生生物體內難以發現的，如海洋中的EPA，DHA在陸生生物中就很少有。當前癌癥、心血管病、艾滋病等各種免疫性疾病及流行性疾病對人類的生存構成很大威脅，現存的陸生天然藥物及化學合成藥物的抗癌、抗病毒、抗真菌及免疫調節作用的效果不理想，且副作用很多，甚至導致死亡。海洋是一個蘊藏許多藥理活性物質的寶庫。開發有效的保健品及功能食品，可以減少社會巨大的醫藥費用，可以通過食品預防疾病。
海洋生物中含有豐富的抗氧化成分，有顯著的抗氧化作用。
海洋生物活性物質研究過程中，分離提取是最關鍵的步驟之一。海洋生物種類繁多，但生物活性物質含量低微，經典的沉淀、結晶、吸附、萃取、離子交換技術等提取技術對于海洋活性物質的提取和純化存在較大的困難和局限性。海洋生物活性物質的提取大都采用有機溶劑萃取的方法，存在著溶劑回收困難，工序繁瑣，對環境污染嚴重等缺點。
超臨界液體技術已經成功地用來從海洋生物中分離提取EPA和DHA等海洋生物活性物質。該方法與常規地分離過程相比，具有操作簡單，萃取效率高，產品中無有毒溶劑殘留，沒有廢物排放不會造成環境污染，萃取中通常使用二氧化碳作萃取劑，價廉，易得，無毒，安全，還可以循環使用，特別適合分離熱敏性和易氧化的物質。
現代分離技術如超臨界流體萃取技術在海洋活性物質的提取、分離和純化中有重要的應用前景。超臨界流體技術是利用超臨界流體在超過氣液共存狀態時的溫度、壓力時，來溶解某種固體、液體或它們中的某些組分，并且利用這種能力從原料中提取有用成分或脫除有害的成分，從而達到分離提純的目的。超臨界流體技術能夠從天然物質中選擇性地提取、分離和純化所需組分，CO2不與生理活性物質發生化學反應，無毒，無污染，易于從產品中清除，并且可以循環使用。
目前已利用牡蠣、海藻、海參、海膽、海星、貽貝、海馬等海洋動物研制開發具有降低膽固醇含量、防癌、抗癌和增強免疫功能，改善腸胃功能、抗輻射損傷等功能食品，研究水平都只停留在第二代功能食品上，缺乏實施國際標準，功能食品的功能因子明確和量化、作用機理清楚的第三代功能食品。雖然國內外對海洋生物活性物質的研究投入了大量的人力物力，但是在海洋藥物開發方面真正達到臨床應用和產業化的卻很少，能獲得一類新藥證書的更是寥寥無幾，在海洋保健品和功能食品的研究與開發方面大都集中在抗癌和防治心腦血管方面。
三

發明內容
技術問題本發明的目的是提供一種海藻抗氧化活性成分的制備方法，提取高純度海藻抗氧化活性成分。提取得率達到7％以上，所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力高，抑制亞油酸過氧化活性強。方法簡便，成本低廉，易得，無毒，安全。
技術方案1、一種海藻抗氧化活性成分的制備方法，其特征在于(1)將100克蛋白核小球藻粉裝入超臨界CO2萃取罐，封閉好萃取釜；(2)設定超臨界二氧化碳萃取工藝參數壓力35-40MPa、溫度32-47℃、夾帶劑用量為1.0-1.5ml乙醇/g物料、CO2流量為20-30L/h、提取時間為1.5-2.5h；(3)達到設定的萃取時間后，將萃取物收集，合并第一分離釜和第二釜中的萃取物；(4)真空濃縮萃取物得油狀提取物或冷凍干燥得粉末狀提取物。
有益效果1、本發明所用原料蛋白核小球藻是海藻中綠藻類的一種，成本低廉，易得，無毒，安全。在生物學分類中，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)屬于真核生物界(Eukaryota)綠藻門(Chlorophyta)綠藻綱(Chlorophyceae)綠球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻屬(Chlorella)。早在上世紀60年代起，日本、美國、前蘇聯、德國、捷克、印度、埃及和我國等國家和地區都開展了小球藻的培養條件、營養成分、生理活性物質、食品應用、廢水(發酵生產廢水、養豬場廢水、城市污水)處理等方面的研究；小球藻已被FAO列為二十一世紀人類的綠色營養源健康食品。
小球藻主要生理功能有提高免疫力和機體防御能力，能抑制胃癌手術切除患者的白血球減少、增加食欲，能使長期遠洋航海者的感冒患病率下降；改善貧血，能使貧血孕婦的血紅蛋白值和血清鐵增加，能使貧血女性的血紅蛋白值提高，能使因化療引起的低血色素貧血患者的紅血球數和血紅蛋白值上升；促進腸蠕動、減輕便秘；經動物試驗表明，口服小球藻干粉可抑制血壓上升，抑制大動脈彈性蛋白質的減少，預防腦中風，對糖尿病患者也起保健作用，還能促進皮膚傷口的愈合；小球藻粉能抑制膽固醇的吸收并促進膽固醇的排泄，抑制由食物引起的動脈硬化，降低高膽固醇患者的血清膽固醇值；小球藻熱水浸提物能減輕輕癥慢性肝炎患者的GOT(Glutamic Oxalocacetic Transaminase enzyme，谷氨酸草酰乙酸轉氨酶)和GPT(Glutamic Pyruvic Transaminase enzyme，谷氨酸丙酮酸轉氨酶)的活性；小球藻具抗氧化作用，熱水浸出物采用硫氰酸鐵薄層色譜分析，確認含有兩種具有很高抗氧化活性物質的組分。
2、本發明方法簡便，萃取效率高。超臨界CO2萃取過程是利用處于臨界壓力7.39MPa和臨界溫度31.06℃以上具有較強溶解能力的CO2流體來提取原料中弱極性或非極性物質的化工分離新技術，分離過程中利用的二氧化碳為萃取溶劑，其具有無毒、惰性、無殘留、能循環利用等優點；且此法萃取效率高，過程易于調節。超臨界CO2萃取對熱敏性物質和不揮發性物質的提取和分離更具特色。超臨界CO2兼具氣體和液體特性，既有液體的溶解能力，又有氣體良好的流動和傳遞性能，且隨著壓力和溫度等相關提取因素的變化其溶解能力有顯著改變，以此可尋找出提取的最佳工藝參數，并可研究粗提取物的分離、純化工藝參數。本發明方法提供的最佳工藝參數簡便，提取得率達到7％。
3、本發明海藻提取物抗氧化活性高。通過正交試驗確定優化最佳工藝參數萃取溫度、壓力、CO2流量、夾帶劑量、提取時間，按正交表L16(45)進行試驗(表1)。
表1L16(45)正交試驗固素—參數表水平 A 溫度 B 壓力C CO2流量 D 夾帶劑量 E 提取時間(℃) (MPa) (L/h) (ml乙醇/g物料)(h)1 324020 1.0 32 403515 0 1.53 473030 0.5 2.54 552525 1.5 2水平范圍32-55 25-40 15-300-1.5 1.5-3選擇粗提取物得率為考核指標，以獲取最佳提取工藝參數。提取物的抗氧化活性，作為最終的考核指標。用DPPH(1，1-二苯基-2-苦肼基)法和亞油酸法檢測提取物的抗氧化活性。所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力(抑制率最高達49.23-54.16％)顯著高于BHT(抑制率達23.99％)、Trolox(抑制率達25.41％)、α-生育酚(抑制率達7.90％)(表2)。
粗提取物抑制亞油酸過氧化能力(第六天，最低氧化份額2.0-3.6％)，顯著高于BHT(第六天，12.8％)、Trolox(第六天，13.9％)、α-生育酚(第六天，111.3％，已沒有抗氧化效果)(表3)。
四

圖1超臨界CO2萃取工藝流程。
五
具體實施例方式
實施例1(1)稱取100克蛋白核小球藻粉末裝入超臨界CO2萃取罐，封閉好萃取釜；(2)超臨界二氧化碳萃取工藝參數壓力35MPa、溫度40℃、夾帶劑用量為1.5ml乙醇/g物料、CO2流量為20L/h，其中壓力、流量通過調節節流閥開啟度和二氧化碳高壓泵轉速達到預定值；(3)達到設定的萃取時間2.5h后，將萃取物收集，合并第一分離釜和第二釜中的萃取物；(4)真空濃縮(水浴40℃)萃取物得油狀提取物或冷凍干燥得粉末狀提取物即為海藻抗氧化活性成分。
將超臨界二氧化碳萃取所收集的物質進行真空低溫濃縮，測定提取物的重量，萃取得率達到3.5％。所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力(抑制率最高達54.16％)，顯著高于BHT(抑制率達23.99％)、Trolox(抑制率達25.41％)、α-生育酚(抑制率達7.90％)。
粗提取物抑制亞油酸過氧化能力(第六天，最低氧化份額3.6％)，顯著高于BHT(第六天，12.8％)、Trolox(第六天，13.9％)、α-生育酚(第六天，111.3％，已沒有抗氧化效果)。
表2海藻提取物的清除自由基活性樣品 提取物得率(％) 抑制率(％)1 7.78 42.03±0.51c2 2.15 17.35±0.13i3 3.97 30.38±2.29f，g4 4.95 41.98±0.20c5 3.25 37.67±1.10d6 3.50 54.16±4.49a7 3.31 33.77±0.43e，f8 2.49 30.35±0.92f，g9 7.54 49.23±1.98b10 3.84 29.67±0.29g11 3.52 29.69±2.22g12 3.17 37.00±6.83d，e13 3.54 42.38±0.40c14 3.28 31.59±2.36f，g15 2.45 46.92±0.00b16 2.58 31.36±0.37f，gBHT /23.99±1.91hTrolox /25.41±0.03hα-生育酚 /7.90±0.49j注在本表抑制率縱列中，不同字母標注的數據間有顯著差異(p＜0.05)組6和9抑制率高，表明這兩組的粗提取物清除自由基能力強表3海藻提取物的抑制亞油酸過氧化活性樣品 第一天第二天第三天第四天第五天 第六天176.6％50.0％25.4％13.2％8.3％5.8％280.5％51.6％24.5％14.4％8.8％7.4％398.7％51.6％24.4％12.7％8.9％6.5％488.5％30.9％13.0％8.2％ 7.4％7.6％558.4％43.7％18.2％10.6％7.0％4.6％659.7％47.9％15.9％7.2％ 6.9％3.6％751.9％36.8％16.4％7.5％ 5.8％4.1％866.2％41.1％18.9％10.2％6.9％5.8％933.8％29.5％6.7％ 4.4％ 3.8％2.0％10 88.3％50.5％17.2％11.4％8.3％5.8％11 / 17.9％11.1％7.3％ 1.5％0.8％12 108.3％ 6.4％ 4.7％ 4.7％ 4.7％4.4％13 77.8％8.1％ 4.6％ 4.4％ 5.2％4.6％14 102.8％ 10.4％5.8％ 6.5％ 6.5％5.9％15 / 2.0％ 1.8％ 2.2％ 2.4％3.2％16 119.4％ 11.1％6.5％ 6.0％ 6.9％6.3％BHT 433.2％ 29.7％14.9％13.4％14.5％ 12.8％Trolox 38.9％30.6％14.8％14.5％14.9％ 13.9％α-生育酚322.2％ 35.8％20.8％32.5％80.5％ 111.3％注表中的數值(百分數)是試驗指標當天氧化份額，其計算方法是(加抗氧化劑亞油酸氧化程度/未加抗氧化劑亞油酸氧化程度)*100％，數值越小，亞油酸氧化過程抑制得越好，抗氧化活性越強實施例2(1)將100克蛋白核小球藻粉裝入超臨界CO2萃取罐，封閉好萃取釜；(2)設定超臨界二氧化碳萃取工藝參數壓力40MPa、溫度47℃、夾帶劑用量為1.5ml乙醇/g物料、CO2流量為30L/h，其中壓力、流量通過調節節流閥開啟度和二氧化碳高壓泵轉速達到預定值；(3)達到設定的萃取時間1.5h后，將萃取物收集，合并第一分離釜和第二釜中的萃取物；(4)真空濃縮(水浴40℃)萃取物得油狀提取物或冷凍干燥得粉末狀提取物即為海藻抗氧化活性成分。
將超臨界二氧化碳萃取所收集的物質進行真空低溫濃縮，測定提取物的重量，萃取得率達到7.54％，所提取的海藻抗氧化活性成分清除自由基的能力(抑制率最高達49.23％)，顯著高于BHT(抑制率達23.99％)、Trolox(抑制率達25.41％)、α-生育酚(抑制率達7.90％)。
粗提取物抑制亞油酸過氧化能力(第六天，最低氧化份額2.0％)，顯著高于BHT(第六天，12.8％)、Trolox(第六天，13.9％)、α-生育酚(第六天，111.3％，已沒有抗氧化效果)。
權利要求
1.一種海藻抗氧化活性成分的制備方法，其特征在于(1)將100克蛋白核小球藻粉裝入超臨界CO2萃取罐，封閉好萃取釜；(2)設定超臨界二氧化碳萃取工藝參數壓力35-40MPa、溫度32-47℃、夾帶劑用量為1.0-1.5ml乙醇/g物料、CO2流量為20-30L/h、提取時間為1.5-2.5h；(3)達到設定的萃取時間后，將萃取物收集，合并第一分離釜和第二釜中的萃取物；(4)真空濃縮萃取物得油狀提取物或冷凍干燥得粉末狀提取物即為海藻抗氧化活性成分。
全文摘要
本發明一種海藻抗氧化活性成分的制備方法，屬于海洋生物技術，用于研制開發醫藥保健品和功能食品的基料。將小球藻用超臨界CO
文檔編號A61P39/06GK1559647SQ20041001427
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月11日 優先權日2004年3月11日
發明者胡秋輝, 楊方美, 潘碧樞, 施瑛, 黃媛媛, 徐娟, 安辛欣 申請人:南京農業大學