專利名稱：葡萄屬植物提取物及方法和作為抗菌藥物增效劑的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物提取物，尤其是涉及從葡萄屬植物果、皮、根、藤、葉、籽不同部位所獲得的提取物；同時，本發明還涉及該提取物的制備方法及其作為抗菌藥物增效劑的新用途。
背景技術：
自1929年Fleiming發現青霉素，1940年Waksman發現鏈霉素以來，人們不斷從微生物次級代謝產物中找到了眾多有效的抗生素，并由此開發出許多半合成抗生素，這對防治細菌性感染起到了重要的作用。由于抗生素的長期大量使用，使得細菌耐藥性逐年增加，曾經有效的抗生素不能再抑制或殺死細菌，成為抗生素藥物療效下降的主要原因之一。近年來，耐藥性問題引起國際社會和醫學界的極大關注，各國除繼續致力于篩選對耐藥菌有效的作用機制的抗生素之外，開始尋找能提高抗生素效能、拮抗細菌耐藥性的物質，如滅活酶抑制劑、藥物滲透促進劑、外輸泵抑制劑、細菌生物被膜抑制劑、抗菌藥物增強劑及耐藥質粒消除劑。
我國學者曾研究報道某些中草藥如大蒜、山楂、紫草、車前子、金銀花等提取物具有消除細菌耐藥性質粒的作用，但消除率比較低，效果不夠理想。受此啟發，我們設想從中國西部高原植物中篩選和尋找具有消除細菌耐藥性作用的植物，經過10余年的探索與研究，最終發現葡萄科葡萄屬植物具有顯著的消除細菌耐藥性的作用，并能夠使多種抗菌藥物增強療效。
葡萄科植物有15屬，其中漿果可以食用的僅限于葡萄屬(Vitis)。葡萄屬全世界有70余種，分布于溫帶或亞熱帶，我國有37種，其中葡萄(Vitis Vinifernl)又稱蒲桃、草龍珠、山葫蘆，為葡萄科葡萄屬落葉植物葡萄的成熟果實，是著名的水果和釀酒原料，也作為藥材被藥典收載。
葡萄的用途很廣，除主要釀造不同類型的葡萄酒外，還大量用以鮮食、加工成葡萄干、葡萄汁、葡萄罐頭等，同時，在傳統醫學中，常將葡萄作為藥材收載、具有滋補強壯、軟堅驅寒、補肝利膽等作用。《神農本草經》記載，葡萄可主筋骨利濕弊、益氣倍力、強志，令人肥健耐饑，忍風寒，久食輕身不老延年；《隨息居飲食譜》記載，葡萄補氣、滋腎液、益陰肝、強筋骨、止渴等，例如紅葡萄干與駱駝蓬子合用，可止咳平咳，對支氣管哮喘有較好療效；綠葡萄干與核桃、紅棗合用，具有消熱解毒、涼血通脈、降壓及滋陰作用，對動脈硬化、高血壓等有較好的療效。
現代醫學研究發現葡萄含有多種活性物質，且存在于葡萄屬植物果、根、藤、葉、籽的不同部位，對防治貧血、肝炎、降低血脂和軟化血管等十分有益。
雖然近年來葡萄的醫療保健作用日益受到世界各國學者的關注，對其化學成分、藥理作用及開發應用進行了較為廣泛的研究，但至今為止，卻未見有關葡萄屬植物提取物作為抗菌藥物增效劑的研究與應用。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種葡萄屬植物果、皮、根、藤、葉、籽的提取物，該提取物不含任何有害物質，除具有改善心腦血管循環、抗氧化、抗衰老、抗病毒和增強免疫等多方面的醫療保健功能外，還具有顯著消除細菌耐藥性的作用。
本發明的目的之二在于提供一種葡萄屬植物提取物的制備方法，該方法結合了現代化學與生物技術，根據葡萄屬植物的不同部位，選擇了多種提取分離方法，其工藝過程簡單，產品收率高。
本發明的目的之三在于提供一種葡萄屬植物提取物作為抗菌藥物增效劑的新用途。
為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下一種葡萄屬植物提取物，它是采用水提法、乙醇提取法及甘油提取法分別對葡萄的果實、葡萄的根、藤和葉以及葡萄的皮、葡萄的籽進行分離提取得到提取液，經過離心交換法、層析法純化后，再將分別得到的提取液混勻后，最后經過濃縮干燥、噴霧干燥和冷凍干燥得到含一種或多種有效成分的粉末狀提取物。
所述的有效成份包括葡萄雙芪、白藜蘆醇、齊墩果酸、β-谷甾醇、沒食子酸及黃酮類化合物。
所述的葡萄雙芪Vinifeuin，分子式及分子量C28H22O6、454.48，存在于葡萄科葡萄屬植物(Vitis vinifera)葉子中。

所述的白藜蘆醇Resveratrol，Res，化學名為芪三酚(3、4、5-trihydroxystilbene)分子式及分子量C14H12Q3、228.25，存在于葡萄科(Vitis)植物的果、藤、葉子中。
所述的齊墩果酸Oleanolic acid OA，化學名為3β-hydroxy-olea-12-en-oid acid，分子式及分子量C30H4O3、456.71，存在于葡萄科葡萄屬植物果肉和果皮中。
所述的β-谷甾醇Sitosterol，分子式及分子量C29H5OO，414.72，存在于葡萄科葡萄屬植物種子中。
所述的沒食子酸Gall acid，分子式及分子量GH6O6，170.13，存在于葡萄科葡萄屬(Vitis vinifera)的果實、藤和種子中。
所述的黃酮類化合物Flavonoids，主要是指本母核為2-苯基色原酮類化合物，現泛指兩個苯環通過中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物，葡萄籽中總黃酮含量為130.6mg/g。
一種葡萄屬植物提取物的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟一、分離提取A、將無核葡萄干用蒸餾水浸泡25～35分鐘，再在100℃的溫度下水煎25～35分鐘，過濾去渣后，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后在100℃的高溫下滅菌10分鐘即得到提取液1；B、將葡萄根、藤、葉粉碎后，加入乙醇，過濾去渣，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液2；C、將葡萄皮用蒸餾水浸泡后，加入酸性乙醇，過濾去渣，再經硅膠柱層析分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液3；D、將葡萄種子粉碎后，加入甘油于150℃的溫度下提取，過濾去渣，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液4。
二、活性成份的測定A、采用HPLC法測定白藜蘆醇的含量；B、采用分光光度法、氣質聯用法及薄層掃描法測定黃酮類化合物、齊墩果酸、β-谷甾醇化合物、沒食子酸的含量。
三、提取液的干燥將提取液1、提取液2、提取液3及提取液4混勻后，分別進行濃縮干燥、噴霧干燥和冷凍干燥，即得到粉末狀的葡萄屬植物提取物。
一種葡萄屬植物提取物，其特征在于作為抗菌藥物增效劑的新用途。
在本發明制得的單位劑量為80-100毫克的粉末狀的葡萄屬植物提取物中，還可加入藥用輔劑制成醫學上可接受的醫藥制劑，配合抗菌藥物使用，達到提高抗菌藥物療效的目的。
本發明的優點在于1、原料易得，所得提取物不含任何有害物質，具有改善心腦血管循環、抗氧化、抗衰老、抗病毒和增強免疫等多方面的醫療保健功能。
2、結合了現代化學與生物技術，根據葡萄屬植物的不同部位，選擇了多種提取分離方法，其工藝過程簡單，產品收率高。
3、具有顯著消除細菌耐藥性的作用，配合抗菌藥物使用，可使71種藥物敏感性平均提高27.76％，從而大大增強了抗菌藥物的殺菌效力。


圖1為本發明的工藝流程2為本發明加入葡萄屬植物提取物前后抗菌藥物的藥敏變化曲線圖
具體實施例方式實施例1一種葡萄屬植物提取物，它是采用水提法、乙醇提取法及甘油提取法分別對葡萄的果實、葡萄的根、藤和葉以及葡萄的皮、葡萄的籽進行分離提取純化得到提取液，再將分別得到的提取液混勻后，最后經過濃縮干燥、噴霧干燥和冷凍干燥得到含葡萄雙芪、白藜蘆醇、齊墩果酸、β-谷甾醇、沒食子酸及黃酮類化合物的粉末狀提取物。
實施例2分離提取將葡萄干果實用蒸餾水浸泡30分鐘，再在100℃的溫度下水煎30分鐘，過濾去渣后，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后在100℃的高溫下滅菌10分鐘即得到提取液1；將葡萄根、藤、葉粉碎后，加入乙醇，過濾去渣，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液2；將葡萄皮用蒸餾水浸泡后，加入酸性乙醇，過濾去渣，再經硅膠柱層析分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液3；將葡萄種子粉碎后，加入甘油于150℃的溫度下提取，過濾去渣，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液4。
實施例3活性成份的測定采用HPLC法測定白藜蘆醇的含量；采用分光光度法、氣質聯用法及薄層掃描法測定黃酮類化合物、β-谷甾醇化合物、沒食子酸的含量。
實施例4提取液的干燥將提取液1、提取液2、提取液3及提取液4混勻后，分別進行濃縮干燥、噴霧干燥和冷凍干燥，即得到粉末狀的葡萄屬植物提取物。
實施例5葡萄屬植物提取物消除細菌耐藥性的作用與作為抗菌藥物增效劑的效果采用藥敏紙片法和最小抑菌濃度法(Mic)，觀察葡萄活性物質作用國際標準大腸菌ATCC-25922，48小時后，78種藥物敏感性增加百分比，結果在檢測的78種抗菌藥物中，有71種藥物敏感性平均增加27.76％，有7種藥物敏感性未見增加，這7種藥物是阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素、紅霉素、壯觀霉素、青霉素G、克林霉素，見表1。
表1，葡萄活性物質作用國際標準菌ATCC-25922，48小時后，觀察78種抗菌藥物敏感性增加百分率％，有71種藥物敏感性平均增加27.76％，有7種藥物未見增加。

實施例6葡萄活性物質對大腸桿菌消除耐藥性研究結果選擇國際標準大腸桿菌(ATCC-25922株)、出血性大腸桿菌標準株(0157株)、臨床分離侵襲性大腸桿菌(90240株)臨床分離產素性大腸桿菌(91003株)的受試菌株，經過活性物質作用24小時后，觀察菌株對6類(58種)抗菌藥物的藥敏變化，6類抗菌藥物青霉素類(13種)、頭孢類(20種)、喹諾酮類(12種)、氨基糖苷類(8種)、四環素類(3種)、磺胺類(2種)。結果顯示6類(58種藥物)，見表2。
表2，葡萄活性物質作用大腸桿菌24小時6類(58種)抗菌藥物敏感性平均增加百分率％。
實施例7葡萄活性物質作用不同時間及去除葡萄活性物質后細菌藥敏變化的研究試菌選擇標準大腸桿菌(ATCC-259922)，標準肺炎克雷伯氏(GY2000)和標準出血性大腸桿菌(0157)。活性物質對菌株分離作用24小時、48小時、120小時，然后去除活性物質，使菌株在無活性物質壓力下繼續培養24小時、48小時、120小時，觀察檢測在這個過程中3株細菌對78種抗菌藥物的藥敏變化，進而分析研究消耐作用的規律、結果發現活性物質作用于菌株24小時藥敏平均增加20％左右，到48小時肺炎克雷伯氏菌達到頂峰30％左右，120小時2株大腸桿菌達到頂峰35-40％，當去除活性物質24小時后藥敏迅速下降至10％左右，以后下降比較緩慢，但始終仍比消耐前菌株敏感，見說明書附圖2。
實施例8葡萄活性物質在動物體內消除細菌耐藥性的研究設出血性大腸桿菌0157作受試菌。0157菌侏通過口腔、胃、腸道感染實驗動物(昆明種小白鼠)，再灌喂葡萄活性物質，從動物體內分離活性物質作用后的0157菌株與未灌喂活性物質動物體內分離的0157菌株作對比研究，檢測實驗菌株和對照菌株對78種抗菌藥物的藥敏性，結果顯示消耐因子在動物體內環境下消除細菌耐藥性同樣有效，在動物體內作用12小時可使0157菌株對78種抗菌藥物敏感性平均增加15％，作用24小時平均增加24％。
實施例9葡萄活性物質消除細菌耐藥性機理研究A、葡萄活性物質對產生β-內酰胺酶細菌作用的研究經過活性物質對30株臨床常見致病菌(致病性大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌)作用后，檢測細菌β-內酰胺酶，結果證實活性物質對細菌產生的β-內酰胺酶無抑制作用。
B、葡萄活性物質消除細菌耐藥質粒的研究經過質粒檢測，受試的30株臨床致病菌攜帶分子量大小不同的質粒1-8條帶，活性物質作用后，質粒丟失率為60-90％。研究結果顯示活性物質能夠有效的消除細菌質粒。
C、葡萄活性物質對細菌耐藥基因作用的研究因為各種抗菌藥物對細菌作用靶點不同，會誘導細菌產生多種不同的耐藥基因，所以研究植物活性物質對細菌耐藥基因的作用是一項艱巨的工作，根據細菌產生的藥性的機理和本發明研究結果進行初步分析判斷，活性物質作用的基因位點很可能在細菌的胞膜和細菌R質粒。常見的耐藥性突變基因gyr或Parc，常常發生于稱為“喹諾酮耐藥決定區”(QRDR)的部位。目前放為，許多常見致病菌都存在與耐藥性有關的外輸泵，如大腸桿菌、枯草桿菌、腸球菌等，大腸桿菌膜上存在有AcrAB AcrEF EmrAB Emrol NorA QacB等主動外輸系統，其中染色體DNA上AcrAB基礎編碼的AcrAB蛋白是最主要的。本研究證實葡萄活性物質能夠明顯抑制NorA外輸蛋白的活性。
權利要求
1.一種葡萄屬植物提取物，其特征在于它是采用水提法、乙醇提取法及甘油提取法分別對葡萄的果實、葡萄的根、藤和葉以及葡萄的皮、葡萄的籽進行分離提取得到提取液，經過離心交換法、層析法純化后，再將分別得到的提取液混勻后，最后經過濃縮干燥、噴霧干燥和冷凍干燥得到含一種或多種有效成分的粉末狀提取物。
2.如權利要求1所述的提取物，其特征在于所述的有效成份包括葡萄雙芪、白藜蘆醇、齊墩果酸、β-谷甾醇、沒食子酸及黃酮類化合物。
3.如權利要求1所述的提取物的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟一、分離提取A、將無核葡萄干果實用蒸餾水浸泡25～35分鐘，再在100℃的溫度下水煎25～35分鐘，過濾去渣后，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后在100℃的高溫下滅菌10分鐘即得到提取液1；B、將葡萄根、藤、葉粉碎后，加入乙醇，過濾去渣，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液2；C、將葡萄皮用蒸餾水浸泡后，加入酸性乙醇，過濾去渣，再經硅膠柱層析分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液3；D、將葡萄種子粉碎后，加入甘油于150℃的溫度下提取，過濾去渣，再經樹脂吸附分離純化活性物質，最后過濾除菌即得到提取液4。二、活性成份的測定A、采用HPLC法測定白藜蘆醇的含量；B、采用分光光度法、氣質聯用法及薄層掃描法測定黃酮類化合物、齊墩果酸、β-谷甾醇化合物、沒食子酸的含量。三、提取液的干燥將提取液1、提取液2、提取液3及提取液4混勻后，分別進行濃縮干燥、噴霧干燥和冷凍干燥，即得到粉末狀的葡萄屬植物提取物。
4.一種葡萄屬植物提取物作為抗菌藥物增效劑的新用途。
5.如權利要求4所述的提取物的新用途，其特征在于在單位劑量為80-100毫克的粉末狀的葡萄屬植物提取物中加入藥用輔劑，制成配合抗菌藥物使用的醫學上可接受的醫藥制劑。
6.如權利要求4所述的提取物的新用途，其特征在于在消除細菌耐藥性及配合抗菌藥物使用能夠顯著提高抗菌藥物的療效方面的用途。
7.如權利要求4所述的提取物的用途，其特征在于在改善心腦血管循環、抗氧化、抗衰老、抗病毒和增強免疫等多方面的醫療保健用途。
全文摘要
本發明公開了一種葡萄屬植物提取物及其制備方法和作為抗生素增效劑的新用途，它是采用水提法、乙醇提取法及甘油提取法分別對葡萄的果實、葡萄的根、藤和葉以及葡萄的皮、葡萄的籽進行分離提取純化得到提取液，再將分別得到的提取液混勻后，最后經過濃縮干燥、噴霧干燥和冷凍干燥得到含一種或多種有效成分的粉末狀提取物；本發明原料易得，結合了現代化學與生物技術，根據葡萄屬植物的不同部位，選擇了多種提取分離方法，所得提取物不僅具有改善心腦血管循環、抗氧化、抗衰老、抗病毒和增強免疫等多方面的醫療保健功能，而且特別是發現具有消除細菌耐藥性的作用，并且配合抗菌藥物使用能夠顯著提高抗菌藥物的療效。
文檔編號A61P31/04GK1628774SQ20041004059
公開日2005年6月22日 申請日期2004年9月3日 優先權日2004年9月3日
發明者王秀英, 高榮, 黃鶴程, 朱冰, 張華平 申請人:王秀英