專利名稱：甲型、乙型肝炎聯合疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及甲型、乙型肝炎聯合疫苗，屬于醫學生物技術領域。
背景技術：
病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟損害為主的全身性急性或持續性傳染病，在世界各地均有流行。我國大部分地區屬于甲肝高流行區，每年疫情報告超過百萬例，絕大多數為學齡前兒童。隨著近年來經濟的發展和衛生條件的改善，甲肝流行出現了發病年齡上移，病情嚴重，病死率增加的特點。乙肝是世界性的公共衛生問題，我國屬于乙肝高流行區，人群攜帶率高，有1.2億乙型肝炎表面抗原攜帶者，每年新發病人多達900萬。疫苗的使用，有效地降低了甲、乙肝的發生率。1991，WHO將乙肝疫苗接種納入擴大免疫計劃，對嬰兒和成人實施普遍的免疫接種。我國于1992年將乙肝疫苗的免疫接種納入國家計劃免疫項目，并取得了良好的效果。但隨著疫苗種類的不斷增加，嬰幼兒接種次數也隨之增多。目前的美國疫苗接種程序要求兒童從出生到16歲共接種43劑疫苗抗原，需要注射次數從1988年的8次增加到1998年的14-20次。我國兒童一歲內需接種10劑疫苗抗原7次。兒童免疫負擔之重可想而知，不僅如此，接種疫苗也增加了交叉感染的機會，且在生產上增加生產成本及運輸、貯存、使用等多種費用，尤其在人口眾多的我國，醫務人員的工作量以及造成的經濟損失都是極為罕見的。因此，有必要研制更加科學、合理、經濟的疫苗。甲乙肝聯合疫苗具有甲、乙型肝炎雙重特異性保護性能，同時預防這兩種疾病，它符合當今世界疫苗研究的發展方向——制備多價聯合疫苗。

發明內容
本發明的目的在于提供一種能同時預防甲肝與乙肝這兩種疾病的聯合疫苗，降低生產成本以及運輸、貯存、使用等環節的多種費用，減輕患者尤其是嬰幼兒的免疫負擔與痛苦，減少醫務人員的工作量，減少交叉感染的機會。
本發明通過下列技術方案實現一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于它由下列成分組成呂-8株HAV抗原 320～1280ELU/mlHBs抗原 5～10ug/ml氫氧化鋁 0.5～1.5mg/ml2-苯氧基乙醇 4.0～6.0mg/ml吐溫-20 0.04～0.06mg/ml甘氨酸2.0～4.0mg/ml氯化鈉0.8～0.9mg/ml。
本發明提供的甲型、乙型肝炎聯合疫苗由下列工藝方法制得A、將甲肝病毒毒種HAV呂-8株的P26代毒種經凍融超聲后，按1∶5～50的體積比接種于人胚肺二倍體細胞(KMB17)上，在35℃培養12～16天收獲病毒液；B、將上述病毒液經凍融、超聲破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG濃縮、DEAE Sepharose FF層析，用1∶4000的甲醛37℃滅活12～15天獲得甲型肝炎純化抗原；C、在上述甲肝純化抗原中加入0.5～1.0mg/ml的Al(OH)3振搖吸附1～4小時，調整離子強度氯化鈉含量0.8～0.9mg/ml和溶液酸堿度的pH值7.0～8.0，制成含量為640～2560EU/ml的吸附甲肝滅活抗原，待用；D、將重組酵母表達的含量為20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步驟所得的吸附甲肝滅活抗原以及疫苗用輔料按上述配比混合后，在20～40℃振搖1～4小時，即得甲肝抗原含量為320～1280EU/ml，乙肝抗原含量為5～20ug/ml的聯合疫苗。
所述重組酵母表達抗原來自深圳康泰生物制品有限公司，菌種號為2150-2-3 PHBS56-GAP347/33。
本發明提供的聯合疫苗具有下列優點1)吸附完全，理化性質穩定，未發生相互干擾作用。用現有方法在上清中未檢出甲肝抗原和乙肝表面抗原，pH值、鋁含量、游離甲醛含量穩定。結果見表1。
2)良好的安全性。依據生物制品異常毒性試驗規程接種小鼠和豚鼠，符合規程要求，在7天的觀察期內，小鼠和豚鼠全部健存，到期體重增加，結果見表2、表3。甲乙肝聯合疫苗006批(HAAg 640EU/ml，HBsAg10ug/ml)接種恒河猴，以甲肝疫苗、乙肝疫苗、史克甲乙肝聯合疫苗作為對照，3天內，所有動物的注射局部均無腫脹、硬結，亦未見厭食、嘔吐及活動異常等全身反應；接種疫苗后2-32周丙氨酸轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉氨酶(AST)無異常升高；接種前，接種后4、8、24、28周肝臟穿刺，取活組織進行病理檢測，無組織病理學改變，見表4。
3)良好的免疫原性。小鼠效力結果表明二者混合后，不影響其效力，達到了單價疫苗的免疫效果，達到或超過了國外甲乙肝聯合疫苗的免疫效果，結果見表5。
4)良好的穩定性。37℃放置27天后，上清未檢出抗原，理化性質穩定，小鼠效力未見顯著改變。長期穩定性良好，4℃放置6、12、18、24、30月后，理化性質穩定，小鼠效力未見顯著改變。說明其有效期達到2年以上。結果見表6、7。
表1甲乙肝聯合疫苗理化檢測結果疫苗批號甲肝:乙肝 pH值 鋁含量游離甲醛(EU:ug)(mg/ml) (ug/ml)甲乙聯苗001 320:10 6.95 0.66 0.181甲乙聯苗002 640:10 6.93 0.76 0.184甲乙聯苗003 1280:10 6.41 0.66 0.181甲乙聯苗004 2560:10 6.57 0.86 0.189甲乙聯苗005 1280:5 6.68 0.74 0.188甲肝疫苗 640 6.76 0.70 0.190乙肝疫苗10 6.54 1.37 0.186表2 甲乙肝聯合疫苗豚鼠安全實驗結果觀察天數 體重(g)疫苗批號 甲肝:乙肝 動物 1 2 3 4 5 6 7 注射 到期 結果(EU:ug) 號 前甲乙聯苗 640:101 - - - - - - - 242.5 248.5 健存006-1 2 - - - - - - - 275.5 284.5 健存甲乙聯苗 640:101 - - - - - - - 266.5 280.0 健存006-2 2 - - - - - - - 227.5 239.5 健存甲乙聯苗 320:101 - - - - - - - 301.0 315.0 健存007-1 2 - - - - - - - 188.5 197.5 健存甲乙聯苗 320:101 - - - - - - - 278.5 285.5 健存007-2 2 - - - - - - - 178.5 199.0 健存對照1 - - - - - - - 297.5 302.0 健存2 - - - - - - - 277.5 287.5 健存注“-”表示無異常，“+”表示異常表3甲乙肝聯合疫苗小鼠安全性實驗結果

注“-”表示無異常，“+”表示異常表4甲乙肝聯合疫苗恒河猴安全性實驗結果疫苗 檢測項目時間(周)0 2 4 6 8 12 16 20 24 28 32甲乙聯苗 ALT/GPT(U/L)10.5 19.0 20.8 20.0 20.3 19.024.325.316 31.529.5AST/GOT(U/L)27.3 24.5 30.3 25.0 22.3 17.526.821.023.825 21.5P.C - - - - -史克甲乙聯苗 ALT/GPT(U/L)26.0 30.0 25.5 15.3 19.3 35.521.523.033.525.823.3AST/GOT(U/L)37.0 36.0 34.8 30.8 31.3 30.532.537.330.531.024.0P.C - - -甲肝疫苗 ALT/GPT(U/L)22.0 23.5 22.0 26.0 38.0 26.039.526.019.532.013.0AST/GOT(U/L)37.0 36.5 38.5 32.5 38.0 27.530 33.524.526.532.5P.C - - - - -乙肝疫苗 ALT/GPT(U/L)15.0 24.5 14.5 18.0 20.5 15.512.014.016 21.541.0AST/GOT(U/L)30.5 25.5 28.0 30.5 32.5 27.026.528.531.534.027.5P.C - - - - -“-”表示肝組織無病理改變表5甲乙肝聯合疫苗效力實驗結果分組 甲肝ED50乙肝ED50(EU:ug)稀釋倍數 EU稀釋倍數 ug甲乙聯苗(1280:10) 23.6 54.2 10.7 0.94甲乙聯苗(640:10) 18.0 35.6 18.0 0.56甲乙聯苗(320:10) 7.9 40.5 13.0 0.77甲肝疫苗(1280) 21.5 59.5甲肝疫苗(640) 14.83 43.16史克甲乙聯苗(720:20) 9.8 73.5 22.3 0.90乙肝疫苗(10) 19.3 0.52Al(OH)3對照表6甲乙聯苗37℃加速穩定性ED50檢測結果疫苗批號 37℃放置時 甲肝ED50乙肝ED50間(天) 稀釋倍數EU 稀釋倍數 ug甲乙聯苗 11 31.62 20.24 27.630.36成人裝量 15 7.9480.61 31.620.32006-1 19 31.62 20.24 45.200.2227 19.81 32.31 35.350.28甲乙聯苗 11 29.28 21.86 31.620.32兒童裝量 15 11.79 54.28 10.770.93006-2 19 ＞6456.090.1827 26.48 24.17 11.850.84表7甲乙聯苗長期穩定性ED50檢測結果疫苗批號 4℃放置時間 甲肝ED50 乙肝ED50(月) 稀釋倍數 EU 稀釋倍數ug甲乙聯苗 6 50.79 12.60 45.80 0.22成人裝量 1248.33 13.24 25.08 0.40006-1 1838.31 16.71 49.17 0.202420.35 31.45 ＞64308.83 72.48 43.07 0.23甲乙聯苗 6 39.42 16.24 32 0.31兒童裝量 1230.20 21.19 12.70 0.78006-2 1820.43 31.32 19.46 0.512414.32 44.69 49.75 0.20307.89 81.12 16 0.635)因二者共同吸附于Al(OH)3上，可使接種者注射的Al(OH)3總含量減少一半，總體上減輕了接種者因鋁佐劑所致的局部反應，增加了含鋁疫苗接種的可接受性。
6)本疫苗采用2-苯氧乙醇作為防腐劑，避免了硫柳汞對嬰兒具有的低度神經發育毒性的潛在危險性。
7)本方法制備工藝簡單，適合于大規模生產。
綜上所述，本發明提供的甲乙肝聯合疫苗具有甲、乙型肝炎雙重特異性保護性能，是同時預防這甲、乙肝炎兩種疾病的聯合疫苗。接種本疫苗時，減少了接種針次，簡化了免疫程序，提高了接種率，給醫務工作者和接種者都帶來了極大的方便。接種本疫苗后，二者互為佐劑，免疫原性得到增強，全程免疫達到或超過單價疫苗的免疫效果。本發明提供的制備方法穩定可行，用該法制備的多批甲乙肝聯合疫苗具有良好的安全性、免疫原性和穩定性，完全達到國家生物制品的要求。
本發明接種小鼠和恒河猴進行免疫原性的進一步研究，結果表明1、小鼠接種后抗體產生早，抗體水平高于單價疫苗。接種后2周甲乙聯苗為100％陽轉，乙肝單價疫苗僅有60％陽轉。聯合疫苗所誘導的抗體水平均高于單價對照如

圖1、2所示。
2、合疫苗接種恒河猴2周后，甲肝抗體和乙肝抗體均100％陽轉；接種史克聯合疫苗后，第2周，甲肝抗體和乙肝抗體均只有75％陽轉，4周后甲肝抗體100％陽轉，6周即加強免疫一次后乙肝抗體聯100％陽轉；接種甲肝疫苗后，第二周甲肝抗體未陽轉，第4周完全陽轉；接種乙肝疫苗后，2周陽轉率為0，4周為50％，6周即加強免疫一次后完全陽轉。聯合疫苗免疫恒河猴后所誘導的甲肝抗體產生水平與國外同種疫苗對照和甲肝對照相當；所誘導的乙肝抗體水平高于單價乙肝疫苗，和國外同種疫苗對照相當，見表8、表9。
表8恒河猴免疫后甲肝抗體產生情況時間抗體陽轉率(％) 甲肝抗體GMT(周)甲乙 史克甲 甲肝甲乙聯苗史克甲乙聯苗 甲肝疫苗聯苗 乙聯苗 疫苗2 100 75 0 14 100 100 100 1:32.00 1:32 1:32.006 100 100 100 1:362.041:512 1:512.008 100 100 100 1:608.871:430.54 1:256.0012 100 100 100 1:256.001:304.44 1:512.0016 100 100 100 1:107.631:90.51 1:128.0020 100 100 100 1:64.00 1:64.00 1:45.2524 100 100 100 1:53.82 1:53.82 1:64.0028 100 100 100 1:1024.00 1:2896.31 1:2048.0032 100 100 100 1:1024.00 1:1448.15 1:1448.1536 100 100 100 1:512.001:861.08 1:512.00
表9恒河猴免疫后乙肝抗體產生情況時間 抗體陽轉率(％) 乙肝抗體GMT(周) 甲乙 史克甲 乙肝疫 甲乙聯苗 史克甲乙聯乙肝疫苗聯苗 乙聯苗 苗苗2 100 75 0 14 100 75 50 1:22.63 1:1.411:6.736 100 100 100 1:724.08 1:512.00 1:215.278 100 100 100 1:430.54 1:362.04 1:107.6312100 100 100 1:608.87 1:256.00 1:430.5416100 100 100 1:128.00 1:90.51 1:256.0020100 100 100 1:128.00 1:22.63 1:181.0224100 100 100 1:107.63 1:22.63 1:128.0028100 100 100 1:1024.00 1:512.00 1:1439.5932100 100 100 1:427.99 1:181.02 1:512.0036100 100 100 1:362.04 1:128.00 1:430.具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例1按下列工藝方法制備甲型、乙型肝炎聯合疫苗A、先將人胚肺二倍體細胞株(KMB17)種子批細胞接種轉瓶培養，至細胞長成單層，再將甲肝病毒毒種HAV呂-8株的P26代工作種子批毒種經凍融超聲后，按1∶5的體積比接種于人胚肺二倍體細胞(KMB17)上，在35℃培養16天收獲病毒液，其抗原滴度1∶1024，感染性滴度7.73CID50/ml；B、將上述病毒液經凍融、超聲破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG濃縮、DEAE Sepharose FF層析，用1∶4000的甲醛37℃滅活12天獲得甲型肝炎純化抗原，其滴度為1∶512～1∶1024；C、在上述甲肝純化抗原中加入0.5mg/ml的Al(OH)3振搖吸附2小時，調整離子強度氯化鈉含量0.8mg/ml和溶液酸堿度的pH值7.0，制成含量為640～2560EU/ml的吸附甲肝滅活抗原，待用；D、將重組酵母表達的含量為20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步驟所得的吸附甲肝滅活抗原以及疫苗用輔料按下列配比混合后，在20℃振搖2小時，即得甲肝抗原含量為320EU/ml，乙肝抗原含量為10ug/ml的聯合疫苗呂8株HAV抗原 320EU/mlHBs抗原 10ug/ml氫氧化鋁 0.5mg/ml2-苯氧基乙醇 4.0mg/ml吐溫-20 0.04mg/ml甘氨酸 2.0mg/ml氯化鈉 0.8mg/ml。
實施例2按下列工藝方法制備甲型、乙型肝炎聯合疫苗A、先將人胚肺二倍體細胞株(KMB17)種子批細胞接種轉瓶培養，至細胞長成單層，再將甲肝病毒毒種HAV呂-8株的P26代毒種經凍融超聲后，按1∶10的體積比接種于人胚肺二倍體細胞(KMB17)上，在35℃培養16天收獲病毒液，其抗原滴度1∶1024，感染性滴度7.73CID50/ml；B、將上述病毒液經凍融、超聲破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG濃縮、DEAE Sepharose FF層析，用1∶4000的醛37℃滅活12天獲得甲型肝炎純化抗原，其滴度為1∶512～1∶1024；C、在上述甲肝純化抗原中加入1.0mg/ml的Al(OH)3振搖吸附4小時，調整離子強度氯化鈉含量0.85mg/ml和溶液酸堿度的pH值7.5，制成含量為640～2560EU/ml的吸附甲肝滅活抗原，待用；D、將市售的含量為20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步驟所得的吸附甲肝滅活抗原以及疫苗用輔料按下列配比混合后，在40℃振搖4小時，即得甲肝抗原含量為1280EU/ml，乙肝抗原含量為5ug/ml的聯合疫苗呂8株HAV抗原 1280EU/mlHBs抗原 5ug/ml氫氧化鋁1.5mg/ml2-苯氧基乙醇6.0mg/ml吐溫-200.06mg/ml甘氨酸 4.0mg/ml氯化鈉 0.85mg/ml。
實施例3制備方法同實例1，按下列配比混合后，在20～40℃振搖1小時，即得甲肝抗原含量為640EU/ml，乙肝抗原含量為10ug/ml的聯合疫苗呂8株HAV抗原 640EU/mlHBs抗原 10ug/ml氫氧化鋁 1.0mg/ml2-苯氧基乙醇 5.0mg/ml吐溫-20 0.05mg/ml甘氨酸3.0mg/ml氯化鈉0.9mg/ml。
權利要求
1.一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗，其特征在于它由下列成分組成呂-8株HAV抗原 320～1280ELU/mlHBs抗原 5～10ug/ml氫氧化鋁 0.5～1.5mg/ml2-苯氧基乙醇 4.0～6.0mg/ml吐溫-20 0.04～0.06mg/ml甘氨酸2.0～4.0mg/ml氯化鈉0.8～0.9mg/ml。
2.一種制備甲型、乙型肝炎聯合疫苗的工藝方法，其特征在于采用下列工藝步驟制得A、將甲肝病毒毒種HAV呂-8株的P26代毒種經凍融超聲后，按1∶5～50的體積比接種于人胚肺二倍體細胞(KMB17)上，在35℃培養12～16天收獲病毒液；B、將上述病毒液經凍融、超聲破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG濃縮、DEAE Sepharose FF層析，用1∶4000的甲醛37℃滅活12～15天獲得甲型肝炎純化抗原；C、在上述甲肝純化抗原中加入0.5～1.0mg/ml的Al(OH)3振搖吸附1～4小時，調整離子強度氯化鈉含量0.8～0.9mg/ml和溶液酸堿度的pH值7.0～8.0，制成含量為640～2560EU/ml的吸附甲肝滅活抗原，待用；D、將重組酵母表達的含量為20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步驟所得的吸附甲肝滅活抗原以及疫苗用輔料按上述配比混合后，在20～40℃振搖1～4小時，即得甲肝抗原含量為320～1280EU/ml，乙肝抗原含量為5～20ug/ml的聯合疫苗。
全文摘要
本發明提供一種甲型、乙型肝炎聯合疫苗，它具有甲、乙型肝炎雙重特異性保護性能，是同時預防這甲、乙肝炎兩種疾病的聯合疫苗。接種本疫苗時，減少了接種針次，簡化了免疫程序，提高了接種率，給醫務工作者和接種者都帶來了極大的方便。接種本疫苗后，二者互為佐劑，免疫原性得到增強，全程免疫達到或超過單價疫苗的免疫效果。本發明提供的制備方法穩定可行，用該法制備的多批甲乙肝聯合疫苗具有良好的安全性、免疫原性和穩定性，完全達到國家生物制品的要求。
文檔編號A61K39/295GK1596978SQ200410040308
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月23日 優先權日2004年7月23日
發明者褚嘉祐, 張華遠, 陳統球, 汪恩浩, 史荔, 毛群穎, 黃小琴 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所