專利名稱：杜仲3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶a還原酶蛋白編碼序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、基因工程技術領域。具體地，本發明涉及一種在杜仲中表達的eu-Hmgr蛋白(杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶蛋白，Eucommiaulmoides 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase，EUHMGR)及其核酸序列。
背景技術：
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)又名絲連皮、扯絲皮、絲棉皮、玉絲皮、思仲等，屬落葉喬木，在植物分類學上屬杜仲科杜仲屬。杜仲是我國特有樹種，經濟價值很高，資源稀少，被我國有關部門定為國家二級珍貴保護樹種。近代醫學研究發現，杜仲除傳統的醫療功效外，還具有雙向調節血壓的作用，并可降低人體膽固醇含量，預防心腦血管硬化。醫學上研究發現膽固醇的合成與HMGR活性相關，由于HMGR在調控膽固醇中起重要作用，所以人們將植物類異戊二烯途徑研究的焦點也多集中在HMGR上。
近年來，對許多植物材料的次生代謝的研究證明，HMGR是甲羥戊酸途徑中一個關鍵酶。在甲羥戊酸途徑中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰CoA(HMGCoA)在HMGR的作用下生成甲羥戊酸(MVA)。由于該反應是一個不可逆過程，因此HMGR被認為是該途徑中第一個限速酶。通過提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的活性或含量，可以間接的提高杜仲中次生代謝產物或其前體的含量。近代科學研究發現，次生代謝產生天然活性物質，是解決目前世界面臨的西藥毒副作用大，癌癥、艾滋病等疑難疾病無法醫治等難題的一條新途徑。
在對現有文獻的分析中，“Plant Cell(植物細胞)，1992，4(10)1333-1344”報道了從馬鈴薯中克隆了3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，NCBI網站上公布了橡膠樹等的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶還原酶基因的序列。但至今尚未有杜仲eu-Hmgr蛋白序列及其核酸序列報道。
在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的杜仲eu-Hmgr蛋白序列及其核酸序列。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列。使其包含所說基因的融合基因構建體，攜帶該構建體的新的重組表達載體，被所說的表達載體轉化植物細胞，以及由轉化細胞產生的所說基因的轉基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織，所獲得的轉基因植物將具有顯著提高的次生代謝產物含量。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明所分離出的DNA分子包括編碼具有杜仲eu-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1942位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1942位的核苷酸序列雜交。
較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1942位的核苷酸序列。
本發明分離出的杜仲eu-Hmgr蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發明所提供的載體DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。它包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
本發明用上述載體。在實例中該宿主細胞是煙草。
在本發明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“杜仲eu-Hmgr蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有杜仲eu-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第170-1942位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第170-1942位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第170-1942位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1942位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1942位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的杜仲eu-Hmgr蛋白相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，術語“杜仲eu-Hmgr蛋白或多肽”指具有杜仲eu-Hmgr蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術語還包括具有與天然杜仲eu-Hmgr蛋白相同功能的SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括杜仲eu-Hmgr蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明的杜仲eu-Hmgr蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與杜仲eu-Hmgr蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用杜仲tm-Hmgr蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發明中，“杜仲eu-Hmgr蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
表1


表287％identity in 208nt overlapQuery1695 aggtgggtactgttggagggggcactcaacttgcatctcagtctgcttgcttgaacttac 1754|||||||||| || ||||| || |||||||||||||||||||||||||| | | ||| |Sbjct2128 aggtgggtacagtcggaggtggaactcaacttgcatctcagtctgcttgtctcaatttgc 2187Query1755 ttggggttaagggtgcaaacaaagagtcccctggatcaaattcaaggctcttagcggcca 1814||||||| |||||||||||||||||||| || |||||||| ||||||||| | || ||||Sbjct2188 ttggggtgaagggtgcaaacaaagagtcgccaggatcaaactcaaggctccttgctgcca 2247
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80％identity in 220nt over lapQuery299 gcgctcccccttcccctttacctaaccaatggaattttcttcacgctcttcttctccgta 358||||| || |||||||| ||||| ||||| | ||||||||||||| |||||||| ||Sbjct127 gcgcttccgcttcccctctacctgaccaacgcggttttcttcacgctgttcttctcggtg 186Query359 gcctactaccttctccaccggtggcgcgacaagatccgcaattcgactcctctccacgtc 418|| || ||||| || |||||||||||||||||||||||||| || ||||| || || ||Sbjct187 gcgtattacctccttcaccggtggcgcgacaagatccgcaactccactccccttcatatc 246Query419 ttgactctttctgagctcgccgccattgtttctcttatagcctcatttatatatctccta 478| ||||| ||||| | | || ||||| || || || ||||| || || || ||||||Sbjct247 gttactctctctgaaattgttgctattgtctccctcattgcctctttcatttacctccta 306Query479 ggttttttcggcatcgatttcgtgcagtccttcattgcacg 519|| || ||||| |||||||| |||||||| |||||||||||Sbjct307 ggattcttcggtatcgattttgtgcagtcattcattgcacg 34781％identity in 169nt over lapQuery1178 tttgcaaggcttcaaggcattcagtgttctatagcgggaaaaaatctttacatgagattt 1237||||| ||||| ||||||||| | || || || || || || |||||||| || |||||Sbjct1140 tttgcgaggctccaaggcattaaatgctcaattgctggtaagaatctttatataagattc 1199Query1238 acctgtagcactggtgatgctatggggatgaacatggtgtcaaaaggtgtgcagaatatt 1297| ||| |||||||| ||||| ||||||||||||||||| || ||||| || || || ||Sbjct1200 agctgcagcactggcgatgcaatggggatgaacatggtttctaaaggggttcaaaacgtt 1259Query1298 ctcgagtttcttcaaaatgattttccagatatggatgtaattggtatctc 1347|| || |||||||||| ||||||| | ||||||||||| ||||| |||||Sbjct1260 cttgaatttcttcaaagtgatttttctgatatggatgtcattggaatctc 130978％identity in 259nt over lapQuery755 ctcgggactgctatcgtgcggcctcaattcgccgcgaggcgattcagaggatcacaggt 814|||||||||||| | || ||||| | ||||| |||||||| | |||||||| ||| |
Sbjct586 ctcggggactgcaaacgagcggctgcgattcgacgcgaggctttgcagaggatgacaagg 645Query815 aagtcgctgtcgggcttgccattggaaggatttgattacgaggcgattttagggcagtgt 874| ||||||| ||||||||| | ||||| || ||||||||| |||||||||| || ||Sbjct646 aggtcgctggaaggcttgccagtagaagggttcgattacgagtcgattttaggacaatgc 705Query875 tgtgagatgccgattggcttccttcaaatcccggtcggtattgcgggacctttgttgttg 934||||| ||||| | || | | | || || ||||| || |||||||| || |||||| ||Sbjct706 tgtgaaatgccagtgggatacgtgcagattccggtggggattgcggggccgttgttgctg 765Query935 aacggctgcgaatactcggtgccaatggcgacgacagaggggtgcttggttgcgagtacc 994||||| | || ||||| || ||||||||||| || ||||| || ||||| ||||| ||Sbjct766 aacgggcgggagtactctgttccaatggcgaccacggagggttgtttggtggcgagcact 825Query995 aacagaggatgcaaggcgat 1014|| ||||| || ||||||||Sbjct826 aatagagggtgtaaggcgat 845Query杜仲eu-Hmgr的核酸序列Sbjct帕拉橡膠樹hb-Hmgr的核酸序列(AY352338.1)表2為本發明的杜仲eu-Hmgr與帕拉橡膠樹(Para rubber tree)ps-Hmgr的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表378％identity in 576aa over lap，86％similarity in 576aa over lapQuery13 TNGRNHHLHHQGNSSSPAIDCSPSPIPKASDALPLPLYLTNGIFFTLFFSVAYYLLHRWR 72T GR HH H++P D SP+ PKASDALPLPLYLTN +FFTLFFSVAYYLLHRWRSbjct3 TTGRLHHRKH----ATPVEDRSPT-TPKASDALPLPLYLTNAVFFTLFFSVAYYLLHRWR 57Query73 DKIRNSTPLHVLTLSELAAIVSLIASFIYLLGFFGIDFVQSFIARASHDPWDVDD-DERF 131DKIRNSTPLH++TLSE+ AIVSLIASFIYLLGFFGIDFVQSFIARASHD WD++D D +Sbjct58 DKIRNSTPLHIVTLSEIVAIVSLIASFIYLLGFFGIDFVQSFIARASHDVWDLEDTDPNY 117Query132 ILEEDRRRGPCTAALDCLVGPVAPSISDVRKLMDPPAPLPSVEDEQMVKSVISGTVPSYS 191+++ED R C A+ + + + APL S EDE +V SV+ G +PSYSSbjct118 LIDEDHRLVTCPPANISTKTTIIAAPTKLPTSEPLIAPLVSEEDEMIVNSVVDGKIPSYS 177Query192 LESKLGDCYRAASIRREAIQRITGKSLSGLPLEGFDYEAILGQCCEMPIGFLQIPVGIAG 251
LESKLGDC RAA+IRREA+QR+T +SL GLP+EGFDYE+ILGQCCEMP+G++QIPVGIAGSbjct178 LESKLGDCKRAAAIRREALQRMTRRSLEGLPVEGFDYESILGQCCEMPVGYVQIPVGIAG 237Query252 PLLLNGCEYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIYASGGATSILLRDGMTRAPVVRFPSAKRA 311PLLLNG EYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIY SGGATS+LL+DGMTRAPVVRF SA RASbjct238 PLLLNGREYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIYLSGGATSVLLKDGMTRAPVVRFASATRA 297Query312 SELKFFLEDPLNFETLSMVFNKSSRFARLQGIQCSIAGKNLYMRFTCSTGDAMGMNMVSK 371+ELKFFLEDP NF+TL++VFNKSSRFARLQGI+CSIAGKNLY+RF+CSTGDAMGMNMVSKSbjct298 AELKFFLEDPDNFDTLAVVFNKSSRFARLQGIKCSIAGKNLYIRFSCSTGDAMGMNMVSK 357Query372 GVQNILEFLQNDFPDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIISEDIVRKVLK 431GVQN+LEFLQ+DF DMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAII E++V+KVLKSbjct358 GVQNVLEFLQSDFSDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIIKEEVVKKVLK 417Query432 TTVPALVELNMLKNXXXXXXXXXXXXFNAHAANIVSAVFIATGQDPAQNIESSHCITMME 491T V +LVELNMLKN FNAHA NIVSA+FIATGQDPAQN+ESSHCITMMESbjct418 TNVASLVELNMLKNLAGSAVAGALGGFNAHAGNIVSAIFIATGQDPAQNVESSHCITMME 477Query492 AVNDGKDLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGANKESPGSNSRLLAAIVA 551AVNDGKDLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGANKESPGSNSRLLAAIVASbjct478 AVNDGKDLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGANKESPGSNSRLLAAIVA 537Query552 GSVLAGELSLMSAIAAGQLVNSHMKYNRSNRDFTKVTS 589GSVLAGELSLMSAIAAGQLV SHMKYNRS++D +K SSbjct538 GSVLAGELSLMSAIAAGQLVKSHMKYNRSSKDMSKAAS 575Query杜仲eu-Hmgr氨基酸序列Sbjct帕拉橡膠樹hb-Hmgr氨基酸序列(GenBank Accession No.AAQ63055.1)表3為本發明的杜仲eu-Hmgr蛋白的氨基酸序列與帕拉橡膠樹hb-Hmgr的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。
發明還包括杜仲eu-Hmgr蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的杜仲eu-Hmgr蛋白多肽時，可以將杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成杜仲eu-Hmgr蛋白表達載體。
如本發明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。
還可用Northern印跡法技術分析杜仲eu-Hmgr蛋白基因產物的表達，即分析杜仲eu-Hmgr蛋白的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
此外，本發明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有杜仲eu-Hmgr蛋白核苷酸編碼序列的8-100個連續核苷酸，較佳地具有15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼杜仲eu-Hmgr蛋白的核酸分子。
本發明涉及檢測樣品中是否存在杜仲eu-Hmgr蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于杜仲eu-Hmgr蛋白核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據本發明的杜仲tm-Hmgr蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選杜仲eu-Hmgr蛋白同源基因或同源蛋白。
為了得到與杜仲eu-Hmgr蛋白基因相關的杜仲cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選杜仲cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對杜仲eu-Hmgr蛋白的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自杜仲的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與杜仲eu-Hmgr蛋白的基因家族的核苷酸序列。
本發明的杜仲eu-Hmgr蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的分子。
利用本發明的杜仲eu-Hmgr蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與杜仲eu-Hmgr蛋白發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發明的杜仲eu-Hmgr蛋白基因可通過基因工程技術用來提高杜仲中次生代謝產物或其前體的含量，而這些次生代謝產物在臨床上具有巨大的應用價值，對保護人民的健康生長有所幫助。因而本發明具有很大的應用前景。
具體實施例方式
下面結合實驗室具體的試驗數據和結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1杜仲eu-Hmgr蛋白基因的克隆1.組織分離(isolation)杜仲幼嫩葉片來源于江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室，采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCOBRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據一些植物Hmgr的氨基酸保守序列，設計兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)3’-RACEPCR(UPM+F2)得到EUF2’(862bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知的木本植物如橡膠樹(Heveabrasiliensis)等的Hmgr基因的同源性很高，故初步認為它是一個Hmgr基因。
(2)5’-RACE根據3’RACE結果，設計反向特異引物R2，經PCR (UPM+R2)得到EUR2’(1489bp)(過程同(1))。回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。
(3)將5’RACE測序結果與3’RACE測序結果比序并進行拼接，得到全長片段序列信息，并設計一對特異引物進行PCR擴增eu-Hmgr編碼區(DF1+DR1)得到eu-Hmgr編碼區(1770bp)(過程同(1))。
BLAST的結果證明從杜仲中新得到的基因確為一個植物Hmgr基因。通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的杜仲EuHMGR的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物EuHMGRF15’-GCGGGGAAGAACAGTCCAATA-3’(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸EuHMGRR15’-GCAATAATATGAGTTGAGACT-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，EuHMGRF1/EuHMGRR1的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃1分鐘、58℃1分鐘和72℃2分鐘進行35個循環，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為1776bp。然后按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.3所示的序列。
實施例2杜仲eu-Hmgr蛋白基因的序列信息與同源性分析本發明新的杜仲eu-Hmgr蛋白全長cDNA的長度為2281bp，詳細序列見SEQ IDNO.3，其中開放讀框位于170-1952位核苷酸。根據全長cDNA推導出杜仲eu-Hmgr蛋白的氨基酸序列，共590個氨基酸殘基，分子量63313.88，pI為6.83。詳細序列見SEQ ID NO.4。
將杜仲eu-Hmgr蛋白的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與帕拉橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(AY352338.1)在核苷酸水平上具有較高的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它與帕拉橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(GenBank Accession No.AAQ63055.1)有78％的相同性和86％的相似性(見表3)。由此可見，杜仲eu-Hmgr蛋白與帕拉橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為杜仲eu-Hmgr蛋白在功能上也相似。
實施例3杜仲eu-Hmgr蛋白在大腸桿菌中進行原核表達及提純在該實施例中，將全長的杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
將杜仲eu-Hmgr蛋白多肽以融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據杜仲eu-Hmgr蛋白的氨基酸序列，設計蛋白編碼區的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pET32a(+)載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將杜仲eu-Hmgr蛋白基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pET32a(+)載體(Novagen)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌BL21，篩選鑒定得到含有pET32a(+)-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶表達載體的工程菌BL21-pET32a(+)-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶。
表達Trx-eu-Hmgr重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pET32a(+)-eu-Hmgr工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含100μm/ml氨芐青霉素)中培養約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續于37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達Trx-3-eu-Hmgr融合蛋白的工程菌。
Trx-3-eu-Hmgr融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達Trx-eu-Hmgr融合表達蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-eu-Hmgr，經離心沉淀收集菌體，并根據廠家(Novagen)的說明書以BugBuster試劑和Benzonase核酸酶來純化包涵體。包涵體可用溶解緩沖液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)來溶解，再用透析緩沖液(200mMTris-HCl，pH8.5)來透析。然后用組氨酸結合(His·Bind)樹脂進行親和層析，并經洗脫緩沖液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脫來收集Trx-eu-Hmgr融合蛋白。融合蛋白經腸激酶20℃酶切16小時后即可分離獲得eu-Hmgr的表達蛋白。
純化的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的活力測定按Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，95702～5712)的方法對表達純化的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶進行酶活力的測定，研究在其作用下3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成甲羥戊酸的能力。反應體系含有0.05M Tris-HCL(pH＝7.5)，5mM DTT，200mM NADPH，300mM14C標記的乙酰輔酶A(1mCi/mmol)及20mM磷酸葡萄糖，每毫升9.75mU磷酸葡萄糖脫氫酶用于NADPH的再生，總體積為100ul.反應流程如下首先加入400mg蛋白質37℃水浴5分鐘.然后加入20ml 6N的HCL終止反應，混合物再37℃水浴15分鐘，使3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉化成甲羥戊酸。反應終產物和酶作用物在Bio-Rex 5柱子上分離，反應終產物可從柱子中水洗下來。可用液體閃爍記數器測定14C標記的反應終產物的含量。結果表明，表達的蛋白的確具有催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成甲羥戊酸的酶活性。
實施例4杜仲eu-Hmgr蛋白在煙草中進行真核細胞表達將含目的基因(杜仲eu-Hmgr蛋白基因)的表達載體的構建，根據杜仲eu-Hmgr蛋白的全長序列(SEQ ID NO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將杜仲eu-Hmgr蛋白基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，利用葉盤法技術轉化模式植物煙草。
利用葉盤法轉化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種于2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養24-36小時；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經侵染的葉片放于MS培養基上，28℃暗培養48小時；7.將葉片轉到愈傷培養基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進行生根培養，2-7天左右生根；9.等根系發達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養。利用Northern blotting檢測eu-Hmgr蛋白在轉基因煙草植株中的表達1.RNA的提取待轉基因煙草葉片長到2-3片葉時抽取煙草葉的RNA。以正常生長的植株作為對照(條件同上)，利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關RNA的制備章節(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1OD260＝40μg/ml。
3 總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉入55℃水浴中。3)于通風櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4.RNA尼龍膜上轉移1)轉移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉移12-20小時。4)轉移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在含有5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA的溶液中，65℃下預雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContentsCDP-StarTMlabelling module標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIG labeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；轉基因煙草的eu-HMGR轉錄水平比未轉基因的對照材料的表達水平明顯高得多。
含杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(euhmgr)的轉基因煙草植株中的eu-Hmgr蛋白活性測定
1.蛋白的提取a)取500mg葉片，加入1000ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于50ml eppondorf管中研磨；b)13000，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過程于冰上進行。
2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1mlBradford試劑，混勻后，分光光度計測OD595；蛋白含量計算1OD595＝28.57μg。
3.eu-Hmgr蛋白活性測定參考Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，95702～5712)的方法(詳細操作過程同實例3)。結果表明，轉基因煙草植株的中的eu-Hmgr蛋白酶活性比沒有轉基因的對照明顯高得多(P＜0.05)。從而再次證明所克隆的杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的確具有催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成甲羥戊酸的酶活性，將可用于利用轉基因技術來提高植物的次生代謝產物的研究和產業化中。
本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GCGGGGAAGAACAGTCCAATA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸
(iii)序列描述SEQ ID NO.2GCAATAATATGAGTTGAGACT(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度2281bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度570氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.4<110>徐州師范大學<120>杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶蛋白編碼序列及其應用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2281<212>DNA<213>杜仲(Eucommia ulmoides)
<220>
<221>CDS<222>(170)..(1942)<223>
<400>1acgcggggaa gaacagtcca atagcacacc tcgtgccagc acatcatcgc ccccccgcct60cgcctgtgtt ccttgttata tccctcccaa attcccgatt ccttcgctca gccgcccctc120ttaaaccata ccacaacaca cattttcccc catttacttc tgcccggcc atg gat ctc178Met Asp Leu1cgc cgg aga ccc cct aag cca gca gcg aca aat ggc cga aac cac cac 226Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Ala Ala Thr Asn Gly Arg Asn His His5 10 15ctc cac cac cag ggc aat tcg tct tca ccg gcg att gat tgc agc cct 274Leu His His Glu Gly Asn Ser Ser Ser Pro Ala Ile Asp Cys Ser Pro20 25 30 35tca ccg att cca aag gct tcc gat gcg ctc ccc ctt ccc ctt tac cta 322Ser Pro Asn Pro Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Leu40 45 50acc aat gga att ttc ttc acg ctc ttc ttc tcc gta gcc tac tac ctt 370Thy Asn Gly Ile Phe Phe Thr Leu Phe Phe Phe Val Ala Tyr Tyr Leu55 60 65ctc cac cgg tgg cgc gac aag atc cgc aat tcg act cct ctc cac gtc 418Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu His Val70 75 80
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1.一種杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列，其特征在于，所分離出的DNA分子包括編碼具有杜仲eu-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.3中從核苷酸第170-1952位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1952位的核苷酸序列雜交。
2.根據權利要求1所述的杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，分離出的杜仲eu-Hmgr蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據權利要求1或2所述的杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1952位的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，它包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
5.根據權利要求4所述的杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，所提供的載體DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。
全文摘要
一種杜仲eu－Hmgr蛋白編碼序列，屬于基因工程領域。所分離出的DNA分子包括編碼具有杜仲eu－Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.3中從核苷酸第170－1952位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170－1952位的核苷酸序列雜交。本發明是一種3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A的還原酶，有助于提高杜仲中次生代謝產物或其前體的含量，次生代謝產物具有雙向調節人體血壓的作用，并可降低人體膽固醇含量，預防心腦血管硬化等功能。對于保護人民的健康生長有所幫助。
文檔編號A61K38/44GK1760363SQ200410065000
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月14日 優先權日2004年10月14日
發明者蔣繼宏, 曹小迎, 開國銀, 陳鳳美 申請人:蔣繼宏