脂酰輔酶a溶血心磷脂酰基轉移酶1(alcat1)的調節劑及其用途
【專利摘要】本發明提供了脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶1(ALCAT1)表達、功能或活性的調節劑組合物。具體地，ALCAT1的抑制劑用于治療代謝疾病、心臟病和一般而言與線粒體功能障礙相關的疾病。提供了用于鑒定新的ALCAT1調節劑的測定。
【專利說明】脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶1 (ALCAT1)的調節劑及 其用途
[0001] 關于聯邦咨助研究的聲明
[0002] 本發明根據美國國立衛生研究院提供的資助號DK076685由美國政府支持完成。 美國政府可具有本發明的某些權利。
[0003] 相關申請的奪叉引用
[0004] 本申請要求2012年2月16日提交的名稱為"MODULATORSOFACYL-COA LYSOCARDIOLIPINACYLTRANSFERASE1(ALCAT1)ANDUSESTHEREOF(脂酰輔酶A溶血心磷 脂酰基轉移酶I(ALCATl)的調節劑及其用途）"的美國臨時專利申請號61/599, 496的優先 權，其通過引用整體并入本文。 發明領域
[0005] 本發明實施方案涉及用于治療與線粒體功能障礙相關的疾病、代謝疾病、神經系 統疾病和心臟病的組合物。提供了鑒定新藥劑的方法以及治療用途。
[0006]背景
[0007] 心磷脂（CL)是最初在心臟中鑒定的一種線粒體磷脂，在維持正常心臟功能中起 關鍵作用。在哺乳動物中，通過代謝組織例如心臟、肝和骨骼肌中亞油酸占主導的脂肪酰基 鏈的組成（18 :2)來確定CL的生物功能。據信該獨特的酰基組成支持線粒體膜質子梯度和 各種線粒體酶和蛋白的活性。因此，在具有擴張性心肌病的嚙齒類動物和人類中發生心力 衰竭期間出現四亞油酰氧基CL(TLCL)的缺失，四亞油酰氧基CL(TLCL)是健康哺乳動物心 臟中的主要物類。CL是從磷脂酸以一系列步驟生物合成的。新合成的CL必須經歷涉及磷 脂酶和酰基轉移酶/轉酰酶的重塑過程，以使亞油酸整合進入其脂肪酰基鏈。因此，有缺陷 的CL重塑引起Barth綜合征中的擴張性心肌病，Barth綜合征是一種X連鎖遺傳疾患，特 征為CL中的亞油酸缺陷、線粒體功能障礙、生長延遲和中性粒細胞減少。而且，來自病理性 CL重塑的異常CL酰基組成已經牽涉與衰老和年齡相關疾病中許多病理生理性病癥相關的 線粒體功能障礙的病因，所述衰老和年齡相關疾病包括糖尿病、肥胖、心血管疾病和神經變 性，全部由以下表征：氧化應激、CL缺陷、CL中二十二碳六烯酸（DHA)的富集以及線粒體功 能障礙。
[0008] 概沭
[0009] 提供本概述以提出發明概述，以簡要說明本發明的性質和主旨。要理解，其不是用 于解釋或限制權利要求的范圍或含義。
[0010] 本發明實施方案尤其涉及調節溶血心磷脂、特別是脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉 移酶I(ALCATl)的表達、功能和/或活性的組合物。特別是，ALCATl的抑制劑用于治療代 謝疾病、心臟病和一般而言與線粒體功能障礙相關的疾病。提供了用于鑒定新的ALCATl調 節劑的測定。
[0011] 在一個實施方案中，一種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)表達、 功能或活性的調節劑的方法，包括使生物樣品與測試劑接觸；測量所述生物樣品中線粒體 融合蛋白分子的表達、功能或活性。在一個實施方案中，如果測試劑與基線對照相比增加所 述線粒體融合蛋白分子的表達、功能或活性，則鑒定所述測試劑為ALCATl表達、功能或活 性的抑制劑。優選地，ALCATl分子表達、功能或活性與正常基線對照相比明顯減少。
[0012] 在另一個實施方案中，測量線粒體融合蛋白分子（例如，MFN2)表達、功能或活性 的測定包括：免疫測定、生物測定、生物芯片測定、印跡、雜交測定、基于細胞的測定、高通量 篩選測定、色譜、化學測定、噬菌體展示測定或其組合。
[0013] 在另一個實施方案中，一種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl) 表達、功能或活性的調節劑的方法，包括：使生物樣品與測試劑接觸；測量（a)包括BNP、 β-MHC、ANF或ACTAl的指示心肌病的肥大標志物的表達；(b)PTEN誘導的假定激酶 I(PINKl)的表達、功能或活性；并鑒定ALCATl調節劑。
[0014] 在一個實施方案中，如果所述測試劑與基線對照相比減少指示心肌病的肥大標志 物的表達，則鑒定ALCATl表達、功能或活性的抑制劑。一方面，如果所述測試劑與基線對照 相比增加PTEN誘導的假定激酶I(PINKl)的表達、功能或活性，則鑒定ALCATl表達、功能或 活性的抑制劑。
[0015] 在另一個優選的實施方案中，一種在體外或體內預防或治療線粒體功能障礙的方 法，包括：給細胞或患者施用治療有效量的調節溶血心磷脂酰基轉移酶的表達、功能、活性 或其組合的藥劑。在一個實施方案中，所述溶血心磷脂酰基轉移酶是脂酰輔酶A溶血心磷 脂酰基轉移酶I(ALCATl)。
[0016] 在另一個優選的實施方案中，ALCATl調節：線粒體多核苷酸、線粒體多肽、線粒體 蛋白、mtDNA拷貝數；線粒體質量；線粒體形態；線粒體融合和mtDNA突變率。
[0017] 在另一個優選的實施方案中，線粒體蛋白包括：線粒體融合蛋白、線粒體融合蛋 白-1(1^^1)、線粒體融合蛋白-2、（1^吧）、抑制蛋白（?1'〇11讓^111)、肽、片段、變體、突變體 或其組合。
[0018] 在另一個實施方案中，線粒體融合蛋白任選與通過本文所述方法的任何一個鑒定 的一種或多種ALCATl抑制劑（包括還未確定的ALCATl抑制劑的任何其他抑制劑）一起施 用。
[0019] 在一個實施方案中，ALCATl的抑制劑與基線對照相比增加MFN2的表達、功能或活 性。
[0020] 在另一個實施方案中，ALCATl的抑制劑與正常基線對照相比減少如通過活性氧類 (ROS)測量的氧化應激。
[0021] 在另一個實施方案中，ALCATl的抑制劑調節心磷脂（CL)結構、功能、活性、表達或 其組合。
[0022] 在多個實施方案中，ALCATl的抑制劑預防或治療與線粒體功能障礙相關的疾病或 疾患。實例包括但不限于：糖尿病、肥胖、心臟疾病或疾患、神經退行性疾病或疾患、代謝疾 病或疾患。
[0023] 在另一個優選的實施方案中，一種在體外或體內預防或治療線粒體功能障礙的方 法，包括：給細胞或患者施用治療有效量的線粒體融合蛋白分子；和，在體外或體內預防或 治療線粒體功能障礙。
[0024] 在另一個優選的實施方案中，一種治療罹患心肌病或處于心肌病風險的患者的 方法，包括：給有相應需要的患者施用治療有效量的脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的抑制劑；和治療罹患心肌病的患者。
[0025] 在另一個優選的實施方案中，脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的抑 制劑通過本文所述方法的任何一個鑒定。
[0026] 在另一個實施方案中，一種藥物組合物，包括通過本文所述方法的任何一個鑒定 的脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的抑制劑。
[0027] 在另一個優選的實施方案中，一種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶 I(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑的方法，包括使生物樣品與測試劑接觸；測量所述 生物樣品中ALCATl分子的表達、功能或活性；和鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶 I(ALCATl)的調節劑。優選地，如果測試劑與基線對照相比增加了ALCATl分子的表達、功能 或活性，則鑒定所述測試劑為ALCATl表達、功能或活性的抑制劑。
[0028] 在多個實施方案中，ALCATl分子包括：核酸、寡核苷酸、多核苷酸、基因、氨基酸、 肽、多肽、蛋白、變體、片段、突變體或其組合。
[0029] 在多個實施方案中，生物樣品包括：流體、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、細胞、組 織或其組合。
[0030] 在其他實施方案中，測量任何分子的表達、功能或活性的測定包括：免疫測定、生 物測定、生物芯片測定、印跡、雜交測定、基于細胞的測定、高通量篩選測定、色譜、化學測 定、噬菌體展示測定或其組合。
[0031] 以下描述了其他方面。
[0032]附圖簡沭
[0033] 圖1A-1I顯示ALCATl引起C2C12細胞中的線粒體片段化和mtDNA不穩定。圖1A、 IB:通過MitotrackerRed對穩定表達ALCATl(圖1B)或載體對照（圖1A)的C2C12細胞 中線粒體網絡的共聚焦顯微鏡分析。插圖代表框選區域的放大。比例尺代表5μm。圖1C: 表達ALCATl或載體對照的C2C12中線粒體形態的定量分析，三個類別："管狀"具有>90% 延長的互連網絡，"混合"具有混合的管狀和短線粒體，和"片段化"具有>90%短點狀線粒 體，來自三個獨立實驗，N= 300 ;圖1D-1G:穩定表達載體對照（圖1D，圖IF中突出顯示） 或ALCATl(圖1E，圖IG中突出顯示）的C2C12細胞中線粒體形態的EM分析。比例尺代表 1μm。圖1H-1I:穩定表達ALCATl或載體對照的C2C12細胞中mtDNA拷貝數（圖1H)和點 突變率（圖II)的RT-PCR分析。*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01，N= 3。
[0034] 圖2Α-2Η顯示ALCATl缺陷顯著增加線粒體質量并提高mtDNA保真性。圖2A-2D: 來自野生型對照小鼠（WT)(圖2A，圖2C中突出顯示）和來自ALCATl敲除小鼠（KO)(圖2B， 圖2D中突出顯示）的MEF細胞中線粒體形態的EM分析。圖2E-2F:來自WT小鼠（圖2E) 和ALCATl敲除小鼠（圖2F)的脛骨前縱截面的EM分析。箭頭分別指示A帶、I帶、Z線和 線粒體（M)。圖2G-2H:從KO小鼠和WT對照分離的MEF細胞中mtDNA拷貝數（圖2G)和點 突變率（圖 2H)的RT-PCR分析。#ρ〈0· 01，N= 3。
[0035] 圖3Α-3Ε顯示ALCATl調節MFNl和MFN2的生物發生。圖3Α-3Β :穩定表達ALCATl 或載體對照的C2C12細胞中（圖3Α)和從WT和KO小鼠分離的MEF中（圖3B)MFN1、MFN2 和OPAl的mRNA表達水平的實時PCR分析。使用GAPDH表達作為內部對照。圖3C :表達 ALCATl或載體對照的C2C12中MFN1、MFN2和OPAl蛋白水平的Western印跡分析。每個泳 道下顯示每條帶的相對密度，使用肌動蛋白作為蛋白加載的內部對照。圖3D:在從KO和WT對照小鼠分離的MEF中1^^1、1^^2、0?41、鈣聯結蛋白和抑制蛋白的蛋白水平的取8七6111印 跡分析，使用機動蛋白作為蛋白加載的內部對照。N= 3個胎兒每組。圖3E:圖E中顯示數 據的定量分析。與對照比較時，*P〈〇. 05, #P〈0. 01。
[0036] 圖4A-4L顯示ALCATl損害線粒體融合，其可以通過C2C12細胞中的MFN2表達來 拯救。穩定表達ALCATl或載體對照的C2C12細胞用線粒體靶向的GFP或DsRed(mtRFP)的 表達質粒瞬時轉染，共同鋪板，并與PEG-1500融合，隨后共聚焦顯微鏡成像。圖4A-4D:穩 定表達載體對照的C2C12細胞中線粒體的共聚焦圖像，其說明完全融合，如通過圖4C中黃 色證明并在圖4D中突出顯示的。圖4E-4H:穩定表達ALCATl的C2C12細胞中線粒體的圖 像，其表現出融合缺陷，如通過圖4G中分開的綠色和紅色所示并在圖4E中突出顯示的。圖 4I-4L，MFN2(MFN2-YFP)的瞬時表達拯救了穩定表達ALCATl的C2C12細胞中的融合缺陷 (K，L中突出顯示）。比例尺代表5μm。
[0037] 圖5A-5J顯示MFNl和MFN2而非OPAl的過表達恢復C2C12-A1細胞中線粒體網 絡。圖5A-5D:穩定表達載體對照（圖5A-5B)或ALCATl(圖5C-5D)的C2C12細胞中線粒體 網絡的共聚焦圖像分析。穩定的C2C12細胞系用線粒體靶向的EGFP表達載體（圖5A&5C) 瞬時轉染并在成像之前用MitotrackerRed染色（圖5B&5D)。圖5E-5J:穩定表達ALCATl 并分別用Myc標簽化MFNl(圖5E-5F)、MFN2-YFP(黃色熒光蛋白）（圖5G-5H)或Myc標簽 化OPAl(圖5I-5J)的表達載體瞬時轉染的C2C12細胞中線粒體網絡的共聚焦圖像分析。 對于Myc標簽化蛋白，用抗Myc抗體免疫和隨后山羊抗小鼠FITC-軛合抗體（綠色）和 MitotrackerRed染色。比例尺代表5μm。
[0038] 圖6A-6D顯示MFN2恢復穩定表達ALCATl的C2C12細胞中線粒體呼吸容量。穩定 表達ALCATl的C2C12細胞用MFN2或EGFP的表達載體瞬時轉染，并與載體對照比較響應于 各種線粒體抑制劑治療的耗氧率（OCR)變化，所述線粒體抑制劑包括：圖6A，FCCP，一種線 粒體解偶聯劑；圖6B，魚藤酮，一種復合物I抑制劑；圖6C，抗霉素，一種復合物III抑制劑； 和圖6D，寡霉素，一種ATP酶抑制劑。使用MFN2抗體通過western印跡分析來分析外源性 和內源性MFN2蛋白水平，如圖6A所示。通過SeahorseX-24分析儀分析0CR，并從每個化 學治療的至少三次獨立測量計算。與對照相比*P〈〇. 05 ;與非轉染的表達ALCATl的細胞相 比 #ρ〈0· 05 和 ##ρ〈0· 01。
[0039] 圖7Α-7Η顯示通過ALCATl的氧化應激使ROS生成與MFN2缺陷關聯。圖7A-7D:來 自用ImMH2O2治療的WT小鼠（圖7Α，圖7C中突出顯示）或KO小鼠（圖7Β，圖7D中突出 顯示）的MEF中線粒體形態的EM分析。圖7Ε:穩定表達ALCATl或載體對照的C2C12細胞 用所示劑量的H2O2治療，隨后分析丙二醛（MDA)的水平，丙二醛（MDA)是來自氧化應激的脂 質過氧化產物。與載體對照相比林Ρ〈〇. 01。圖7F:穩定表達ALCATl或載體對照的C2C12 用圖7Ε所示增加劑量的H2O2治療，隨后Western印跡分析MFNl和MFN2,使用β-肌動蛋 白作為蛋白加載的內部對照。圖7G:穩定變動啊載體、ALCATl或ALCATl但在用I. 5mMH2O2 治療之前用各種劑量（〇、IM和5M)二聯苯碘（DPI)(-種NADPH氧化酶抑制劑）預治療的 C2C12細胞中MFNl和MFN2表達的Western印跡分析。圖7H:描述ALCATl在關聯氧化應激 與MFN2缺陷和線粒體片段化中的誘發作用的示意模型。
[0040] 圖8顯示穩定表達ALCATl的C2C12細胞中ALCATlmRNA表達水平的RT-PCR分析。 為個體克隆選擇用ALCATl表達載體或空載體穩定轉染的C2C12細胞。通過RT-PCR分析來 分析穩定表達ALCATl或載體對照的C2C12細胞系的ALCATlmRNA表達。
[0041] 圖9A-9D顯示ALCATl缺陷預防響應于MEF中氧化應激的線粒體片段化。在0. 5mM H2O2不存在（圖9A&9B)或存在（圖9C&9D)下培養從ALCATl敲除（KO)小鼠（圖9B&9D)和 野生型（WT)對照小鼠（圖9A和9C)分離的MEF持續2小時，隨后通過用MitotrackerRed 染色來分析線粒體網絡。與載體對照相反，ALCATl缺陷預防響應于氧化應激的線粒體片段 化。
[0042] 圖10顯示C2C12細胞中ALCATl的過表達引起線粒體膨脹。為個體克隆選擇用 ALCATl表達載體或空載體穩定轉染的C2C12細胞。通過電子顯微鏡分析穩定表達ALCATl 或載體對照的C2C12細胞系的線粒體形態。ALCATl過表達引起嚴重的線粒體膨脹，如通過 擴大的線粒體和受損的嵴證明的。
[0043] 圖11A-11F顯示ALCATl調節心肌病中的氧化應激和脂質過氧化。分析穩定過表 達ALCATl或載體對照的H9c2細胞（圖11A)的脂質過氧化副產物硫代巴比土酸反應性物 質（TBARS)的細胞內水平，響應于用鹽水（PBS)或鹽水加2mMH2O2治療2小時；圖IlB:來 自分離的線粒體的H2O2實時生成；圖IlC:用所示劑量H2O2治療之后的mtDNA拷貝數；平均 值土SEM(η= 3)。圖IlD:分析從用媒介物或T4治療連續28天的野生型（WT)和ALCATl 敲除（KO)小鼠分離的心室中的TABRS水平；平均值土SEM(η= 5)。圖11E-11F:穩定表達 載體對照（圖11Ε)或ALCATl(圖11F)的H9c2細胞分化成心肌細胞。
[0044] 圖12A-12E顯示ALCATl的靶向失活預防甲狀腺機能亢進心肌病的發作。WT和KO 小鼠用媒介物或T4治療28天，并通過H&E染色分析完整心臟切片的形態，圖12A;圖12B: 心臟體重比率；圖12C-12E:回波心臟描記參數，包括室間隔缺陷（IVSD)、左室舒張末期內 徑（LVEDD)和左室后壁厚度（LVPWD)。η= 6-8, *Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01。
[0045] 圖13A-13G顯示ALCATl的消除減輕了Τ4誘導的心肌細胞的肥大生長。圖 13A-13D:WT和KO小鼠用媒介物治療28天，并通過Η&Ε染色分析心肌細胞形態。圖13E-13F: 平均心肌細胞尺寸和直徑的定量分析，η= 250。#P〈0. 01。圖13G:在T4治療28天之后來 自WT和KO小鼠的心肌細胞尺寸的分布分析，η= 250。
[0046] 圖14A-14F顯示ALCATl缺陷預防Τ4誘導的心室纖維化的發作。WT和KO小鼠用媒 介物或Τ4治療治療28天，然后分析心室纖維化。圖14A-14D，來自分別用媒介物（圖14Α， 14C)和Τ4(圖14Β，14D)治療的WT和KO小鼠的Masson三色染色的左心室的代表性切片。 通過箭頭突出顯示表現藍色染色的纖維化區域。圖14E-14F:來自圖14A-14D中使用的相 同樣品的纖維化生物標志物（包括膠原蛋白I和膠原蛋白III)的mRNA水平的RT-PCR分 析。η= 5, *Ρ〈0· 05 ;**Ρ〈0· 01。
[0047] 圖15Α-1?顯示與心肌病相關的生物標志物的表達通過ALCATl缺陷正常化。圖 15A-15D:WT和KO小鼠用媒介物或Τ4治療治療28天，然后分析左心室肥大和心力衰竭 的生物標志物的mRNA表達水平，所述生物標志物包括腦利鈉肽（BNP)、β-肌球蛋白重 鏈（β-MHC)、心房利鈉因子（ANF)和骨骼肌α-肌動蛋白（ACTA1)。η= 6-8,乍〈0. 05 ; **Ρ〈0· 01。
[0048] 圖16A-16G顯示Τ4誘導的線粒體膨脹和線粒體自噬通過ALCATl缺陷減輕。圖 16A-16D:在Τ-4治療28天之后來自WT(圖16Α&16Β)和KO(圖16C&16D)的心肌細胞的代表 性電子顯微照片。箭頭突出顯示表現出受損結構和異常形態的線粒體。圖16A和16B中的 框選區域在圖16C和16D中被放大，圖16C和16D突出顯示了正經歷線粒體自噬的線粒體。 比例尺代表1μM。圖16E:在從個體WT和KO小鼠分離的心室組織中自我吞噬的生物標志 物LC3、ρ62和PINKl的Western印跡分析，使用GAPDH作為內部對照。圖16F-16G:圖16Ε 中所示LC3(圖16F)和PINKl(圖16G)蛋白的表達水平的定量分析。*P〈0. 05ΓΡ〈0. 01。
[0049] 圖17A-17C顯示通過ALCATl的氧化應激調節心肌細胞中的Akt-mTOR信號傳導。 圖17A-17B:穩定表達ALCATl或載體對照的H9c2心臟細胞用所示劑量的胰島素（圖17A) 或IOOnMT3刺激所示時間（圖17B)，隨后通過western印跡分析來分析Akt、Erk、S6Kl和 4E-BP的磷酸化，使用β-肌動蛋白作為內部對照。圖17C:WT和KO小鼠用媒介物或T4治 療28天，隨后Western印跡分析心肌細胞中Akt、GSK3α/β和4E-BP的磷酸化，通過使用 GAPDH作為內部對照的Western印跡分析。
[0050] 圖18A-18B顯示ALCATl在H9c2細胞中的穩定過表達導致肥大生長和分化至心肌 細胞的損傷。圖18A，通過細胞計數分析穩定表達Flag標簽化ALCATl或載體對照的H9c2 細胞連續7代（pl-p7)的生長速率。B，在正常培養基或分化培養基（DM)中培養穩定表達 ALCATl或載體對照的H9c2細胞以誘導分化至心肌細胞，隨后使用抗肌細胞生成素和Flag 抗體western印跡分析肌細胞生成素和ALCATl表達。GAPDH是蛋白加載的內部對照。
[0051] 圖19A-19F顯示ALCATl的消除預防線粒體損傷和與心肌病相關的線粒體自噬。用 媒介物或T4治療治療ALCATl敲除小鼠和WT對照28小時，隨后電子顯微鏡分析心室肌肉 的縱向切片。圖19A-19B:來自媒介物治療的WT(圖19A)和KO(圖19B)小鼠的心肌細胞的 代表性電子顯微照片。圖19C-19F，與KO(圖19E)相比，甲狀腺機能亢進引起WT小鼠中受 損線粒體數目的明顯增加（圖19C)。圖19C和19E中的框選區域在圖19D和19F中放大， 圖19D和19F突出顯示正經歷線粒體自噬的線粒體。比例尺大小為1μM。
[0052] 圖20顯示心肌細胞中響應于甲狀腺激素急性治療的Akt-mTOR信號轉導途徑的分 析。用媒介物或T4治療ALCATl敲除（KO)和野生型對照小鼠（WT) 2天，隨后Western印跡 分析Akt、S6K和mTOR的磷酸化，通過使用GAPDH作為蛋白加載內部對照的Western印跡分 析。
[0053] 圖21A-2ID顯示ALCAT1清除預防糖尿病性腎病的發作。用鏈唑霉素（STZ)以 150mg/kg體重腹膜內注射ALCATl敲除（KO)小鼠和野生型（WT)對照。STZ是通過清除胰 島β細胞而引起1型糖尿病的試劑。注射后三天，ALCATlKO和WT小鼠都發展了高血糖。 注射后12周，獲得腎樣品，切片，并用蘇木精和曙紅（Η&Ε)染色以檢查糖尿病誘導的腎病。 來自非糖尿病WT和KO小鼠的腎是正常的（圖21Α和21Β)。然而，WT對照小鼠發展了糖尿 病性腎衰竭，如糖尿病性腎病皮層中管狀擴張、萎縮和胞質空泡變性（圖21C)。相反，糖尿 病性ALCAT1K0小鼠腎中預防了這些病理性變化（圖21D)。
[0054] 圖22A-22D顯示ALCATl清除預防了與糖尿病性腎病相關的腎纖維化。ALCATl敲 除（KO)小鼠和野生型（WT)對照用鏈唑霉素（STZ)以150mg/kg體重腹膜內注射。注射后三 天，ALCATlKO和WT小鼠都發展了高血糖。注射后12周，獲得腎樣品，切片，并通過Masson 三色染色檢查，以分析糖尿病性腎病的主要指示器腎纖維化水平的變化。如圖22A和22B 所示，來自非糖尿病性WT和KO小鼠的腎表現出正常形態。相反，WT對照小鼠中糖尿病的 發作引起腎衰竭（圖22C)，如用三色重染色（藍色）所證明的。相反，糖尿病性ALCATlKO 小鼠腎中預防了這些病理性變化（圖22D)。
[0055] 圖23A-23F顯示ALCATl清除抑制了與糖尿病性腎病相關的生物標志物的mRNA表 達。ALCATl敲除（KO)小鼠和野生型（WT)對照用鏈唑霉素（STZ)以150mg/kg體重腹膜內注 射。注射后三天，ALCATlKO和WT小鼠都發展了高血糖。注射后12周，從腎樣品提取總RNA， 隨后RT-PCR分析指示糖尿病性腎病的生物標志物的mRNA水平，包括FAS(圖23A)、TNF(圖 23B)、TGF-P(圖 23〇、DGAT1 (圖23D)、CHREBP1 (圖23E)和SREBPl(圖23F)。糖尿病性腎 病的發作增加了WT糖尿病性小鼠腎中除了CHREBP1之外的所有生物標志物的mRNA表達。 相反，糖尿病性ALCATlKO小鼠腎中減輕了這些病理性變化。N= 3-6，*P〈0. 05，#P〈0. 01， ***P〈0. 001。結果證明，ALCATl抑制劑提供對糖尿病性腎病的新治療，糖尿病性腎病是糖 尿病患者中腎衰竭的最常見原因。
[0056] 圖24A-24F顯示ALCATl清除預防了高脂肪飲食誘導的脂肪肝疾病發作。ALCATl 敲除（KO)小鼠野生型（WT)對照用高脂肪飲食（HFD)喂養連續18周以誘導肥胖及其相關 脂肪肝疾病發作。在喂養研究結束時，通過H&E染色分析小鼠肝中與飲食誘導的肥胖相關 的病理性變化。響應于飲食誘導的肥胖的發作，WT小鼠發展了典型的脂肪肝疾病，如通過 擴大且蒼白肝所證明的（圖24A)。此外，H&E染色揭示了WT小鼠中細胞內波動和嚴重的肝 細胞內空泡的存在（圖24C，圖24E中放大）。相反，這些病例缺陷在喂食HFD的ALCATlKO 小鼠中完全消除（圖24A、24D，24F中放大）。
[0057] 圖25A-25F顯示ALCATl清除抑制了與脂肪肝疾病相關的生物標志物的mRNA表 達。ALCATl敲除（KO)小鼠和野生型（WT)對照用高脂肪飲食（HFD)喂食連續18周，以誘導肥 胖及其相關脂肪肝疾病的發作。在喂食研究結束時，分析小鼠肝中與肝脂肪變性相關的脂 肪生成基因的mRNA表達變化，所述脂肪生成基因包括PPARa(圖25A)、SrebpIc(圖25B)、 FAS(圖25C)、ACCl(圖25D)、DGATl(圖25E)和CPTla(圖25F)。肝脂肪變性的發作顯著 增加WT對照小鼠的肝中PPARa、Srebplc、FAS、ACCl和CPTla的mRNA表達。相反，這些病 理性變化在ALCATlKO小鼠的肝中完全緩解。N= 3-6, *P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001。 結果證明，ALCATl抑制劑提供了肥胖和2型糖尿病中最常見缺陷肝脂肪變性的新治療。
[0058] 圖26A-26D顯示預防ALCATl敲除小鼠患糖尿病誘導的心臟萎縮。ALCATl敲除 (KO)小鼠和野生型（WT)對照用鏈唑霉素（STZ)以150mg/kg體重腹膜內注射。注射后三 天，ALCATlKO和WT小鼠都發展了高血糖。注射后12周，通過H&E染色分析小鼠心臟萎縮 和形態的變化。1型糖尿病的發作引起WT對照小鼠中嚴重的心臟擴張和萎縮（圖26A)，如 通過心臟重量（圖26C)和心臟/體重比率（圖26D)的顯著降低所證明的。相反，這些病 理性缺陷在表現出正常心臟形態（圖26B)和心臟重量（圖26C和圖26D)的ALCATlKO糖 尿病小鼠中減輕。N= 3-6, *Ρ〈0· 05, #Ρ〈0· 01，*#Ρ〈(λ001。
[0059] 圖27A-27D顯示ALCATl清除預防糖尿病性心臟纖維化的發作。ALCATl敲除（KO) 小鼠和野生型（WT)對照用鏈唑霉素（STZ)以150mg/kg體重腹膜內注射。注射后三天， ALCATlKO和WT小鼠都發展了高血糖。注射后12周，心臟樣品經切片并通過Masson三色 染色分析以檢查ALCATl缺陷對心臟纖維化的影響，心臟纖維化是糖尿病性心力衰竭的主 要標志。WT對照小鼠和ALCATlKO小鼠在非糖尿病條件下都表現出正常的心臟結構（圖 27A&圖27B)。然而，WT對照小鼠中糖尿病的發作引起了嚴重的心臟纖維化（圖27C)，如通 過藍色的重染色所證明的。相反，ALCATl缺陷預防了ALCATlKO小鼠中心臟組織中膠原蛋 白纖維的高血糖誘導的沉積（圖27D)。結果表明，ALCATl抑制劑提供了糖尿病性心力衰竭 的新治療，糖尿病性心力衰竭是糖尿病患者死亡的最常見原因。
[0060] 圖28A-28F顯示預防ALCAT1敲除小鼠患糖尿病誘導的睪丸萎縮。ALCAT1敲除 (KO)小鼠和野生型（WT)對照用鏈唑霉素（STZ)以150mg/kg體重腹膜內注射。STZ是通過 清除胰島β細胞而引起1型糖尿病的試劑。注射后三天，ALCATlKO和WT小鼠都發展了高 血糖。注射后12周，睪丸樣品經切片并通過Η&Ε染色分析以檢查ALCATl在調節糖尿病誘 導的睪丸萎縮中的作用。如圖28Α所示，糖尿病發作引起WT對照小鼠中睪丸萎縮。此外， 高血糖引起精原細胞的嚴重損失（圖28C，圖28D中放大）和WT對照小鼠中巨細胞的誘導 (箭頭所示）。相反，這些缺陷在ALCATlKO小鼠中完全消除（圖28Β和28Ε，圖28F中放 大）。
[0061] 圖29A-29D顯示預防ALCATl敲除小鼠患糖尿病誘導的睪丸細胞凋亡。ALCATl敲 除（KO)小鼠和野生型（WT)對照用鏈唑霉素（STZ)以150mg/kg體重腹膜內注射。注射后 12周，睪丸樣品經切片并通過TUNEL染色分析高血糖誘導的細胞凋亡。在血糖正常條件下， ALCATlKO小鼠和WT對照的睪丸中細胞凋亡的水平是不能區分的（圖29A和29B)。然而， 糖尿病發作觸發了WT對照小鼠睪丸中的明顯細胞死亡，如通過對TUNEL染色陽性的細胞數 目增加所證明的（圖29C)。相反，ALCATl缺陷預防ALCATlKO小鼠睪丸中與糖尿病相關的 細胞凋亡的發作（圖29D)。
[0062] 圖30A-30F顯示ALCATl敲除小鼠表現出在睪丸中高水平的nauge形成。分析睪 丸樣品以獲得3周大的WT(圖30A，圖30C中突出顯示）和ALCATlKO小鼠（圖30B，圖30D 中突出顯示）中的中線粒體接合劑（nuage)形成。Nauge是睪丸中線粒體的獨特特征。使 用NIHImageJ軟件來定量nuage密度（圖30E)，其然后被標準化為相鄰線粒體基質的密 度，對比度和暗度以及相對nauge面積的對照（圖30F)。平均值土SEM(η= 24)。與之前 圖中觀察一致，ALCATl缺陷改善了睪丸中的線粒體功能，如通過ALCATlKO小鼠睪丸中增 加的nauge形成所證明的。總之，結果證明，ALCATl抑制劑提供了糖尿病誘導的生殖變性、 例如糖尿病患者中常見缺陷勃起功能障礙的新治療。*P〈〇. 05, **P〈0. 01。
[0063]詳沭
[0064] 以下參考供示例說明的實例應用來描述本發明的幾個方面。應該理解，提出了許 多具體細節、關系和方法，以提供對本發明的全面理解。然而，本領域普通技術人員容易理 解，在沒有所述具體細節的一個或多個，或者在使用其他方法的情況下，可以實施本發明。 本發明不受動作或事件的示例順序的限制，因為一些動作可以與其他動作或事件以不同順 序和/或共時發生。而且，并非所有示例動作或事件是實施根據本發明方法所必需的。 [0065] 可以在沒有所提出的理論方面的情況下實施本發明的實施方案。而且，對提出理 論方面的理解是 申請人:不尋求受所提出理論的束縛。
[0066] 本文公開的所有基因、基因名稱和基因產物預期對應于本文公開的組合物和方法 可應用的任何物種的同系物。因此，該術語包括但不限于來自人類和小鼠的基因和基因產 物。要理解，當公開來自特定物種的基因或基因產物時，該公開預期僅是示例性的，而不要 被解釋為限制，除非在其出現的上下文中清楚指明。因此，例如，對于在一些實施方案中涉 及哺乳動物核酸和氨基酸序列的本文公開的基因預期涵蓋來自其他動物的同源和/或直 系同源基因和基因產物，所述其他動物包括但不限于其他哺乳動物、魚、兩棲動物、爬行動 物和鳥。在優選實施方案中，基因或核酸序列是人的。
[0067] 定義
[0068] 本文使用的術語僅為了描述具體的實施方案，而并非為了限制本發明。如本文使 用的，除非上下文明確指出相反，單數形式"一"、"一"和"該"也預期包括復數形式。而且， 在術語"包括"、"包括"、"具有"、"具有"、"有"或其變體在詳述和/或權利要求書中使用的 程度上，此類術語預期是包含性的，類似于術語"包含"的方式。
[0069] 術語"約"或"大約"表示如通過本領域普通技術人員測定的特定值在可接受的誤 差范圍內，這部分取決于該值是如何測量或測定的，即，測量系統的局限性。例如，根據本領 域實踐，"約"可以表示1之內或大于1個標準偏差。可選地，"約"可以表示給定值的最多 20%、優選最多10%、更優選最多5%和還更優選最多1%的范圍。可選地，特別就生物系統 或方法而言，該術語可以表示一個值的一個數量級之內，優選5倍之內，且更優選2倍之內。 當申請和權利要求書中描述特定值時，除非另外說明，應該假設術語"約"表示特定值的可 接受誤差范圍之內。
[0070] "任選的"或"任選"表示隨后描述的狀況可以發生或可以不發生，使得該描述包括 了該狀況發生的情況和該狀況不發生的情況。
[0071] 術語"測定"、"測量"、"評價"、"檢測"、"評估"和"分析"在本文可互換使用，指任 何形式的測量，并且包括測定一個要素是否存。這些術語包括定量和/或定性的測定。分 析可以是相對的或絕對的。"評估……的存在"包括測定存在的東西的量，以及測定其是存 在還是不存在。
[0072] 如本文使用的，術語"劑"意思是涵蓋能夠預防、緩解或治療疾病或其他醫學病癥 的任何分子、化學實體、組合物、藥物、治療劑、化療劑或生物劑。該術語包括小分子化合物、 反義試劑、SiRNA試劑、抗體、酶、肽有機或無機分子、天然或合成的化合物等。可以在臨床 試驗期間、臨床前試驗期間或FDA批準之后的任何階段根據本發明方法分析一種劑。
[0073] 術語"ALCAT1"意思是包括但不限于核酸、多核苷酸、寡核苷酸、有義和反義的多核 苷酸鏈、互補序列、肽、多肽、蛋白、同源和/或直系同源ALCATl分子、同種型、前體、突變體、 變體、衍生物、剪接變體、等位基因、不同物種及其活性片段。
[0074] 術語"片段"或"變體"表示長度至少380個氨基酸殘基并且與肽、多肽或蛋白 的一個連續部分100%相同的片段，或者與達到并且包括全長肽、多肽或蛋白的片段至 少90%、優選95 %相同的變體。例如，變體可以包括如本領域定義的保守氨基酸取代或 者非保守取代，條件是保留原始肽、多肽或蛋白活性的至少例如1〇%、25%、50%、75%或 90%。還包括具有翻譯后修飾的ALCATl分子、片段或變體，所述翻譯后修飾例如類泛素化 (sumoylation)、磷酸化、糖基化、剪接變體等，其全部可以影響ALCATl功能的效力。
[0075] 除非另外指明，術語"肽"、"多肽"或"蛋白"在本文可互換使用，盡管通常它們指 不同大小的肽序列。
[0076] 當在多核苷酸序列上下文中使用時，術語"變體"可以涵蓋與野生型基因相關的多 核苷酸序列。該定義還可以包括例如"等位基因"、"剪接"、"物種"或"多態"變體。剪接變 體可以具有與參考分子顯著的同一性，但是由于mRNA加工期間外顯子的交替剪接而一般 具有或大或小數目的多核苷酸。相應的多肽可以具有其他功能結構域或結構域缺失。物種 變體是一個物種與另一個物種不同的多核苷酸序列。本發明中特別有用的是野生型基因產 物的變體。變體可以源自核酸序列中的至少一個突變，并且可以得到改變的mRNA或其結構 或功能可以改變或可以不改變的多肽。任何咯啶天然或重組基因可以具有〇、1或多個等位 基因形式。產生變體的常見突變變化一般歸因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。這些變 化類型的每一個可以在給定序列中單獨或與其他變化類型組合發生一次或多次。
[0077] 得到的多肽一般具有相對于彼此顯著的氨基酸同一性。多態變體是給定物種個體 之間特定基因的多核苷酸序列變化。多態變體還可以涵蓋"單核苷酸多態現象"(SNP)或其 中多核苷酸序列變化一個堿基的單堿基突變。SNP的存在可以指示例如具有疾病狀態傾向 的某些人口，疾病狀態傾向是相對于抗性的易感性。
[0078] 如本文使用的，"心臟病"指任何類型的心臟疾病，包括心肌病、肥大性心肌病、擴 張性心肌病、粥樣硬化、冠狀動脈疾病、缺血性心臟病、心肌炎、病毒感染、創傷、高血壓性心 臟病、心瓣膜病、先天性心臟病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心律失常、導致心臟重塑的疾 病，等。心臟疾病可能是由于任何原因，例如心臟組織損傷，例如收縮性損失（例如，如可能 通過降低的射血分數證明的）。
[0079] 由心臟功能不全表征的心臟損傷或疾患包括正常心臟功能的任何損傷或缺乏或 者異常心臟功能的存在。異常心臟功能可能是疾病、損傷和/或衰老的結果。如本文使用 的，異常心臟功能包括心肌細胞、心肌細胞群或心臟本身的形態和/或功能異常。形態和功 能異常的非限制性實例包括心肌細胞的物理惡化和/或死亡、心肌細胞的異常生長模式、 心肌細胞之間物理關聯的異常、心肌細胞對一種物質或多種物質的過低或過高生成、心肌 細胞不能產生它們正常會產生的一種物質或多種物質、以及電脈沖以異常模式或在異常時 間的傳輸。更總體水平的異常包括運動障礙、射血分數降低、通過回波心臟描記術觀察的變 化（例如，擴張）、EKG變化、運動耐量變化、毛細管灌注減少、和通過血管造影術觀察到的變 化。對許多疾病觀察到異常的心臟功能，所述疾病包括例如缺血性心臟病例如心絞痛、心肌 梗死、慢性缺血性心臟病、高血壓性心臟病、肺心病（肺原性心臟病）、瓣膜性心臟病例如風 濕熱、二尖瓣脫垂、二尖瓣環鈣化、類癌心臟病、感染性心內膜炎、先天性心臟病，心肌病例 如心肌炎、擴張性心肌病、高血壓性心肌病、導致充血性心力衰竭的心臟疾患、和心臟腫瘤 例如原發性肉瘤和繼發性腫瘤。心臟損傷還包括創傷,例如刀傷；生物的（例如,病毒性；自 身免疫疾病）或化學的（例如，化療、藥物）；手術；移植等。
[0080] 如本文使用的，"血脂障礙"指其中脂質代謝異常的生物病癥，包括脂蛋白過高生 成或過低生成。其中脂蛋白過高生成的血脂障礙通常導致總膽固醇升高、低密度脂蛋白 (LDL)膽固醇和甘油三酯濃縮，伴隨血液中高密度脂蛋白（HDL)膽固醇濃度降低。
[0081] 如本文使用的，"脂肪肝疾病"或"肝脂肪變性"指其中肝在肝的肝細胞中累積了超 過正常水平的甘油三酯的病癥。肝細胞內小或大囊狀液泡中含有甘油三酯。當肝的脂質含 量超過5%-10%重量時進行診斷。FLD可以與或可以不與飲用乙醇有關（參見Reddy等 人，Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol. ,2006,290 :G852_G858)。
[0082] 如本文使用的，"酒精性脂肪肝疾病"指其中受試者平均每天飲用超過20克乙醇 的脂肪肝疾病的病癥。AFLD在基本上所有的每天飲用大約60或更多克乙醇的個體中發展。 AFLD可以在攝入中度至大量乙醇甚至段時段之后發生。受試者可以是或可以不是過重或肥 胖的。這包括肝硬化。
[0083] 如本文使用的，"非酒精性脂肪肝疾病"指其中受試者平均每天飲用少于20克乙醇 的脂肪肝疾病的病癥。受試者可以是或可以不是過重或肥胖的。
[0084] 如本文使用的，"非酒精性脂肪性肝炎"或NASH指其中已經發展了伴隨肝中小葉炎 癥的脂肪大空泡的NA脂肪肝疾病發展階段。其中發展了伴隨肝中小葉炎癥的脂肪大空泡 的脂肪性肝炎也可以在酒精性脂肪肝疾病中發生。
[0085] 如本文使用的，"脂肪壞死"指其中已經發展了伴隨肝中小葉炎癥和氣球樣變性的 脂肪大空泡的NA脂肪肝疾病的階段。除了肝中脂肪大空泡、炎癥和氣球樣變性的存在以 夕卜，NAFLD從脂肪壞死水平的進一步發展包括纖維化的發展。其中已經發展了伴隨肝中小 葉炎癥和氣球樣變性的脂肪大空泡的脂肪壞死以及除了肝中脂肪大空泡、炎癥和氣球樣變 性的存在以外纖維化的發展也可以在酒精性脂肪肝疾病中發生。
[0086] 如本文使用的，短語"診斷"表示鑒定病理狀態的存在或性質。診斷方法的靈敏度 和特異性不同。診斷測定的"靈敏度"是測試陽性的患病個體的百分比（"真陽性"的百分 比）。未通過所述測定檢測的患病個體是"假陰性"。未患病并且在所述測定中測試陰性的 受試者被稱為"真陰性"。診斷測定的"特異性"是1減去假陽性率，其中"假陽性"率被定 義為測試陽性而沒有該疾病的哪些人的比例。雖然特定的診斷方法可能不提供確定的病癥 診斷，但是如果該方法提供輔助診斷的陽性指示，就足夠了。
[0087] 如本文使用的，短語"診斷"指分類疾病或癥狀，確定疾病嚴重度，監測疾病進展， 預測疾病結果和/或康復前景。術語"檢測"還可以任選涵蓋以上的任何一個。根據本發明 的疾病診斷可以通過測定獲自受試者的生物樣品中本發明多核苷酸或多肽的水平來實現， 其中測定的水平可以與疾病傾向、或疾病存在或不存在相關聯。應該注意，"獲自受試者的 生物樣品"還可以任選包括還沒有從受試者物理取出的樣品，如以下更詳細描述的。
[0088] "治療"是進行的干預，意圖預防疾患發展或改變疾患病理或癥狀。因此，"治療" 指治療性治療和預防性或預防性措施。"治療"還可以被規定為緩和護理。需要治療的那些 包括已經具有疾患的那些以及其中要預防疾患的那些。在腫瘤（例如，癌癥）治療中，治療 劑可以直接減少腫瘤細胞病理，或者使腫瘤細胞更容易受其他治療劑例如放射和/或化療 的治療。因此，病態、疾患或病癥的"治療"或"治療"包括：（1)預防或延遲可能摧患或易患 所述病態、疾患或病癥但還沒有經歷或表現出所述病態、疾患或病癥的臨床或亞臨床癥狀 的人或其他哺乳動物中發展的病態、疾患或病癥的臨床癥狀的出現；（2)抑制所述病態、疾 患或病癥，即，停止、減少或延遲疾病發展或其復發（在維持治療的情況下）或其至少一種 臨床或亞臨床癥狀；或（3)減輕疾病，S卩，引起所述病態、疾患或病癥或其臨床或亞臨床癥 狀的至少一個的退行。對待治療個體的益處是統計學上顯著的或至少是患者或醫師可察覺 的。
[0089] 如本文定義的，"治療有效"量的化合物（即，有效劑量）表示足以產生治療上（例 如臨床上）想要結果的量。可以每天一次或多次到每周一次或多次來施用組合物；包括每 兩天一次。技術人員將理解，某些因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時機，包括但 不限于疾病或疾患嚴重度、之前治療、受試者健康狀況和/或年齡、和存在的其他疾病。而 且，用治療有效量的本發明化合物治療受試者可以包括單次治療或一系列治療。
[0090] "預防有效量"可以指足以預防患者中代謝疾病或疾患的復發或擴散或者其出現 的劑的量，所述患者包括但不限于易患代謝疾病的那些，例如遺傳上易患或之前暴露于環 境因素例如乙醇的那些。預防有效量還可以指在疾病預防中提供預防益處的預防劑的量。 而且，相對于本發明劑的預防有效量表示單獨或與其他劑組合的劑在疾病預防中提供預防 益處的量。
[0091] 術語"樣品"意思以其最廣泛含義解釋。"樣品"指從個體分離或來自細胞培養成 分的生物樣品，例如；一種或多種細胞、組織或流體（包括但不限于血漿、血清、全血、腦脊 液、淋巴液、淚液、尿、唾液、乳汁、膿和組織滲出液和分泌物），以及獲自例如實驗程序的樣 品。生物樣品可以包括分離自細胞的染色體（例如，中期染色體的散布），分離自細胞的細 胞器或膜，完整細胞或組織，核酸例如溶液中或與固體支持體結合例如供Southern分析的 基因組DNA，溶液中或與固體支持體結合例如供Northern分析的RNA，溶液中或與固體支持 體結合的cDNA，溶液中或與固體支持體結合的寡核苷酸，溶液中或與固體支持體結合的多 肽或肽，組織，組織拓印等。
[0092] 可以使用許多公知的組織或流體收集方法來從受試者收集生物樣品以測定受試 者中感興趣的變體的DNA、RNA和/或多肽的水平。實例包括但不限于細針活檢、針活檢、芯 針活檢和手術活檢（例如腦活檢）和灌洗。不論采用的程序，一旦獲得活檢/樣品，可以測 定變體水平并且可以由此進行診斷。
[0093] 根據本發明，可以采用常規分子生物學、微生物學、重組DNA、免疫學、細胞生物學 和本領域技術內的其他相關技術。參見例如，Sambrook等人，（2001)MolecularCloning: ALaboratoryManual.第 3 版·ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpring Harbor,NewYork;Sambrook等人，（1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual.第 2 版·ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor,NewYork;Ausubel等 人編輯·（2005)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSons,Inc.： Hoboken,NJ;Bonifacino等人編輯.（2005)CurrentProtocolsinCellBiology.John WileyandSons,Inc. :Hoboken，NJ;Coligan等人編輯.（2005)(Χι;ΤΓθη?Protocolsin Immunology，JohnWileyandSons,Inc. :Hoboken，NJ;Coico等人編輯·（2005)Current ProtocolsinMicrobiology,JohnWileyandSons,Inc. :Hoboken,NJ;Coligan等人 編輯·（2005)CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWileyandSons,Inc.： Hoboken,NJ;Enna等人編輯.（2005)CurrentProtocolsinPharmacologyJohnWiley andSons,Inc. :Hoboken,NJ;Hames等人編輯·（1999)ProteinExpression：APractical Approach.OxfordUniversityPress：0xford；Freshney(2000)CultureofAnimal Cells:AManualofBasicTechnique.第 4 版.Wiley-Liss;以及其他。上列最新方案每 年更新數次。
[0094] ALCATl的組合物和調節劑
[0095] 在一個優選實施方案中，藥物組合物包括脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶 I(ALCATl)的抑制劑。在另一個優選的實施方案中，藥物組合物包括一個或多個劑量濃度的 多種脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)抑制劑。在另一個優選的實施方案中， 組合物包括脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的至少一種抑制劑和至少一種其 他治療劑。例如，第二治療劑可以是治療特定癥狀的治療劑。在另一實例中，所述劑靶向疾 病另一方面，例如，異常的細胞增殖。在該例中，所述劑是用于治療癌癥患者的化療劑。 [0096] 線粒體融合蛋白_2 (MFN2)編碼線粒體完整、融合、代謝和與ER拴結所需的線粒體 蛋白。人類MFN2的突變引起外周神經病變和Charcot-Marie-Tooth疾病。MFN2缺陷還牽 涉與肥胖和2型糖尿病相關的線粒體功能障礙。2型糖尿病患者中的肌肉MFN2表達減少。MFN2表達與肥胖負相關并且與胰島素敏感性正相關。減肥手術對2型糖尿病中胰島素抵 抗的緩解增加了肌肉的MFN2表達。同樣，已知提高胰島素敏感性的中等身體鍛煉顯著增加 MFN2表達和線粒體生物發生。此外，小鼠骨骼肌中MFN2的靶向缺失引起mtDNA不穩定性和 高突變率，導致嚴重的mtDNA耗竭。
[0097] 心磷脂（CL)是氧化磷酸化所需的關鍵線粒體磷脂。CL由于其豐富的亞油酸含量 和靠近內線粒體膜中ROS生成部位的定位而高度敏感于ROS對其雙鍵的氧化損傷，一種還 稱為CL過氧化的過程。CL是線粒體經歷細胞凋亡期間早期氧化的唯一磷脂，這觸發了細 胞色素c向胞質溶膠的釋放，導致細胞凋亡性消耗。因此，源于病理性重塑的異常CL酰基 組成已經牽涉通常與糖尿病、肥胖、心血管疾病、神經系統疾患、癌癥、衰老和其他年齡相關 的疾病相關的線粒體功能障礙的病因學（ClaypoolSM&KoehlerCM(2012)Thecomplexity ofcardiolipininhealthanddisease.TrendsBiochemSci.Jan；37 (I) :32-41)〇
[0098] ALCATl是一種溶血心磷脂酰基轉移酶，最近被鑒定為催化CL響應于糖尿病、肥胖 和心肌病中氧化應激的病理性重塑，導致ROS生成、線粒體功能障礙和胰島素抵抗。通過脂 酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的CL重塑還導致CL酰基組成的變化，提示年 齡相關疾病，包括CL缺陷、亞油酸耗竭和CL中二十二碳六烯酸（DHA)含量富集。ALCATl的 靶向失活預防飲食誘導的肥胖及其相關代謝并發癥的發作。
[0099] 在優選實施方案中，組合物包括脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的 調節劑。優選地，所述調節劑抑制ALCATl的表達、功能和/或活性。
[0100] 在另一個優選的實施方案中，使用包括脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶 I(ALCATl)的調節劑的組合物來預防或治療患者的線粒體功能障礙。患者的線粒體功能障 礙與其代謝疾病或疾患相關。實例包括但不限于：糖尿病、脂肪肝、不育、神經退行性疾病、 神經炎性疾病、肥胖、癌癥、自身免疫疾病、腦病、腎病、肝病、心臟病、肌肉疾病、勃起功能障 礙、絕經、代謝疾病或疾患、衰老相關疾病等。
[0101] 在另一個優選的實施方案中，在體外或體內預防或治療線粒體功能障礙的方法包 括給細胞或患者施用治療有效量的調節溶血心磷脂酰基轉移酶表達、功能、活性或其組合 的劑。優選地，溶血心磷脂酰基轉移酶是脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)。
[0102] 在另一個優選的實施方案中，ALCATl的調節劑調節：線粒體多核苷酸線粒體多 肽、線粒體蛋白、mtDNA拷貝數；線粒體質量；線粒體形態；線粒體融合和mtDNA突變率。優 選地，線粒體蛋白包括：線粒體融合蛋白、線粒體融合蛋白-I(MFNl)、線粒體融合蛋白-2、 (MFN2)、抑制蛋白、肽、片段、變體、突變體或其組合。
[0103] 在一個實施方案中，線粒體融合蛋白分子任選與一種或多種ALCATl抑制劑一起 施用給患者，其中ALCATl抑制劑與基線對照相比增加MFN2的表達、功能或活性。在另一個 實施方案中，ALCATl的抑制劑與正常基線對照相比減少如通過活性氧類（ROS)測量的氧化 應激。在另一個優選的實施方案中，ALCATl的抑制劑調節心磷脂（CL)結構、功能、活性、表 達或其組合。
[0104] 在另一個優選的實施方案中，一種在體外或體內預防或治療線粒體功能障礙的方 法，包括：給細胞或患者施用治療有效量的線粒體融合蛋白分子。在優選實施方案中，線粒 體融合蛋白分子包括：線粒體融合蛋白-I(MFNl)、線粒體融合蛋白-2 (MFN2)、片段、變體、 突變體或其組合。優選地，線粒體融合蛋白是MFN2。
[0105] 在一個實施方案中，脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的抑制劑任選 施用給細胞或患者。在優選實施方案中，ALCATl的抑制劑與基線對照相比增加MFN2的表 達、功能或活性。ALCATl抑制劑效力的其他測量包括測量如通過活性氧類（ROS)測量并與 正常基線對照相比的氧化應激。在另一個優選的實施方案中，ALCATl的抑制劑調節心磷脂 (CL)結構、功能、活性、表達或其組合。
[0106] 心臟功能異常、神經退行性和其他疾病：似乎增加的氧化應激牽涉入心臟肥大和 功能異常。氧化應激的減弱預防左心室重塑和功能異常。認為氧化應激是線粒體功能障礙 和胰島素抵抗的主要誘發因素，其已經牽涉入心肌病和心臟功能異常的發病機理。在所有 磷脂中，CL由于豐富的多不飽和脂肪酸含量和靠近ROS生成部位的定位而高度敏感于活性 氧類（ROS)對其雙鍵的氧化損傷，一種還稱為脂質過氧化的過程。因此，CL是線粒體中經 歷細胞凋亡期間早期氧化的唯一磷脂。雖然經歷CL過氧化的分子機制依然不清楚，但是已 經顯示增加的DHA使得CL對氧化應激高度敏感，導致脂質過氧化和線粒體功能障礙的惡性 循環。因此，CL中DHA含量在衰老心臟中增加，伴隨CL缺陷。心肌細胞的缺血-再灌注損 傷引起CL過氧化，導致細胞色素c氧化鎂活性的顯著降低，其只能通過外源添加的CL而不 能通過其他磷脂或過氧化的CL恢復。具體地，人類甲狀腺機能亢進的發作與升高的氧化應 激和CL過氧化相關，其可以通過甲狀腺功能正常化來減輕。人類甲狀腺機能亢進刺激嚙齒 類動物的CL重塑，導致多不飽和脂肪酸和過氧化能力指數的顯著增加。
[0107] 如上討論的，ALCATl催化CL響應于糖尿病、肥胖和心肌病中氧化應激的病理性重 塑，導致ROS生成、線粒體功能障礙和胰島素抵抗。通過ALCATl的CL重塑還導致具有提示 心臟疾病的酰基組成的CL生成，包括TLCL耗竭和DHA富集。本文結果證明了酶ALCAT1在 氧化應激和心臟功能異常的病因學中的作用。
[0108] 在一個優選實施方案中，一種治療罹患心肌病或處于心肌病風險的患者的方法， 包括給有相應需要的患者施用治療有效量的脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl) 的抑制劑。
[0109] 在另一個優選的實施方案中，罹患心肌病或處于心肌病風險的患者與正常健康對 照相比缺乏PTEN誘導的假定激酶I(PINKl)。在優選實施方案中，如果抑制劑導致與基線對 照相比增加的pink表達、功能或活性，則鑒定ALCATl的抑制劑。
[0110] 在優選實施方案中，罹患心肌病或處于心肌病風險的患者表達肥大，包括：BNP、i3-MHC、ANF或ACTAl。在多個實施方案中，ALCATl的抑制劑調節這些標志物的一個或多個 與基線對照相比的表達。
[0111] 在一些實施方案中，治療罹患心肌病或處于心肌病風險的患者的方法包括給有相 應需要的患者施用作為治療方案的部分的、用于治療心肌疾病、疾患或其癥狀的一種或多 種治療化合物。
[0112] 在另一個實施方案中，預防或治療罹患神經系統疾病或疾患的患者的方法包括給 患者施用治療有效量的一種或多種ALCATl調節劑。神經系統疾病或疾患指神經系統和/ 或視覺系統的任何疾患。"神經系統疾患"包括涉及中樞神經系統（腦、腦干和小腦）、外周 神經系統（包括顱神經）和自主神經系統（其部分位于中樞和外周神經系統兩者中）的疾 患。神經退行性疾病包括例如阿爾茨海默病、中風、多發性硬化等。
[0113] 以下是可以使用根據本發明的組合物和方法治療的幾種神經系統疾患、癥狀、體 征和綜合征的列表：后天癲癇性失語；急性播散性腦脊髓炎；腦白質腎上腺萎縮癥；年齡 相關的黃斑變性；胼胝體發育不全；失認癥；艾卡迪綜合征；亞歷山大病；阿爾帕斯病；交 叉性偏癱；阿爾茨海默病；血管性癡呆；肌萎縮側索硬化；無腦畸形；Angelma綜合征；血 管瘤病；缺氧；失語癥；失用癥；蛛網膜囊腫；蛛網膜炎；阿-基氏腦畸形（Anronl-Chiari malformation);動靜脈畸形；阿斯佩各綜合征；共濟失調毛細血管擴張癥；注意力缺乏多 動癥；孤獨癥；自主神經功能障礙；背痛；巴滕病；貝切特病；貝爾氏麻痹；良性自發性瞼痙 攣；良性灶；肌萎縮；良性顱內高血壓；賓斯旺格病；瞼痙攣；BlochSulzberger綜合征； 臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤（包括多形性成膠質細胞瘤）；脊髓腫瘤；布朗-塞卡 爾綜合征；卡納萬病；腕管綜合征；灼痛；中樞性疼痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解；頭部疾 患（cephalicdisorder);腦動脈瘤；腦動脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓； Charcot-Marie-Tooth疾病；化學療法誘導的神經病和神經性疼痛；Chiari畸形；舞蹈癥； 慢性炎性脫髓鞘性多神經病；慢性痛；慢性區域性疼痛綜合征；科-勒綜合征；昏迷，包括 持續性植物狀態；先天性面癱；皮質基底節變性；顱動脈炎；顱縫早閉；克雅病；累積性創 傷疾患；庫興綜合征；巨細胞包涵體病；巨細胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征；丹-沃 綜合征（Dandy-Walkersyndrome);Dawson病；德摩西埃綜合征；Dejerine-Klumke麻搏； 癡呆；皮肌炎；糖尿病神經病變；彌漫性硬化；自主神經功能異常；書寫困難；誦讀困難；張 力失常；早期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍綜合征；腦炎；腦膨出；腦三叉神經血管瘤病；癲癇； 歐勃麻痹；特發性震顫；法布里病；法爾綜合征；昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性癲癇發作； 費希爾綜合征；弗里德賴希共濟失調；額顳癡呆和其他"tau蛋白病變（tauopathies) " ； 高歇病；格斯特曼綜合征；巨細胞動脈炎；巨細胞性包涵體病；球樣細胞腦白質營養不良； 格-巴綜合征；HTLV-I相關的脊髓病；哈-斯病；顱腦損傷；頭痛；偏側面肌痙攣；遺傳性痙 攣性截癱；多神經炎型遺傳性共濟失調；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；HIV 相關性癡呆和神經病（還是AIDS的神經表現）；前腦無裂畸形；亨廷頓舞蹈病和其他聚谷 氨酰胺重復疾病（polyglutaminerepeatdisease);積水性無腦畸形；腦積水；皮質醇增 多癥；缺氧；免疫介導的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調癥；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒雷 夫敘姆病；嬰兒性痙攣；炎性肌病；顱內囊腫；顱內高血壓Joubert綜合征；基-塞綜合 征（Kearns-Sayresyndrome);肯尼迪病Kinsboum綜合征；克-費綜合征（KlippelFeil syndrome);克拉伯病；庫-韋病；庫魯病；拉福拉病；朗-愛肌無力綜合征（Lambert-Eaton myasthenicsyndrome) ;Landau_Kleffner綜合征；側髓（瓦倫伯格）綜合征；學習無能； 利氏病；Lennox-Gustaut綜合征；累-奈綜合征；腦白質營養不良；路易體癡呆；無腦回； 閉鎖綜合征；LouGehrig病（即，運動神經元病或肌萎縮側索硬化）；椎間盤疾病；萊姆 病-神經后遺癥；馬-約病；巨腦（macrencephaly);巨腦（megalencephaly);梅-羅綜合 征；美尼爾癥；腦膜炎；門克斯病；異染性腦白質營養不良；小頭畸形；偏頭痛；米勒費希爾 綜合征；小中風；線粒體肌病；默比厄斯綜合征；單肢肌萎縮；運動神經元病；腦底異常血 管網病；粘多糖癥；多發性梗死性癡呆；多病灶運動神經病；多發性硬化和其它脫髓鞘病 癥；多系統萎縮伴隨直立性低血壓；P型肌肉萎縮癥；重癥肌無力；髓鞘脫失彌漫性硬化； 嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣攣；肌病；先天性肌強直；發作性睡病；神經纖維瘤病；神經阻滯 劑惡性綜合征；AIDS的神經表現；狼瘡的神經后遺癥；神經性肌強直；神經元臘樣脂褐質 癥；神經元遷移疾患；尼曼-皮克病；0'Sullivan-McLeod綜合征；枕神經痛；隱性脊柱神經 管閉合不全序列征；大田原綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼肌陣痙攣；視神經炎；直 立性低血壓；過度使用綜合征；感覺異常；帕金森病；先天性副肌強直；類腫瘤性疾病；陣 發性發作（paroxysmalattacks);帕-羅綜合征；佩-梅病；周期性癱瘓；周圍神經病；疼 痛性神經病和神經性疼痛；持續性植物狀態；全身性發育遲緩；感光性噴嚏反射；植烷酸貯 積病；皮克病；神經挾捏；垂體瘤；多肌炎；腦穿通畸形；小兒麻痹癥后期綜合征；皰疹后神 經痛；感染后腦脊髓炎；直立性低血壓；普-韋綜合征；原發性側索硬化；朊病毒病；進行 性一側面萎縮；進行性多灶性白質腦病；進行性硬化性灰質萎縮；進行性核上性麻痹；腦假 瘤；Ramsay-Hunt綜合征（I型和II型）；拉斯馬森腦炎；反射性交感神經營養不良綜合征； 雷夫敘姆病；反復性運動障礙；反復性應激損傷；腿多動綜合征；反轉錄病毒相關性脊髓 病；雷特綜合征；雷耶綜合征；舞蹈病；桑德霍夫病；謝耳德病；腦裂；中隔-視神經發育不 良;驚嚇嬰兒綜合征；帶狀皰疫；希-德綜合征；斯耶格倫綜合征；睡眠性呼吸暫停；索托斯 綜合征；疫攣狀態；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓瘤；脊髓性肌萎縮；僵人綜合征；中風；斯-韋 綜合征；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動脈硬化性腦病；西德納姆舞蹈病；暈厥；脊髓空洞 癥；遲發性運動障礙；泰-薩克斯病；顳動脈炎；脊髓栓系綜合征（tetheredspinalcord syndrome);肌強直性白內障；胸廓出口綜合征；三叉神經痛；Todd麻搏；圖雷特綜合癥；短 暫性腦缺血發作；傳染性海綿狀腦病；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經痛； 熱帶痙攣性輕截癱；結節性硬化癥；血管性癡呆（多發梗死性癡呆）；血管炎，包括顳動脈 炎；希-林病；瓦倫伯格綜合征；韋-霍病；韋斯特綜合征；急性頸部扭傷（whiplash);威廉 斯綜合征；Wildon病；以及澤爾韋格綜合征。
[0114] 在另一個優選的實施方案中，ALCATl調節劑的施用預防或治療罹患自身免疫疾病 的患者。自身免疫疾病的實例包括：類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、炎性腸病（IBD)，包 括克羅恩病（CD)和潰瘍性結腸炎（UC)，其是具有多基因易感性的慢性炎性病癥。
[0115] 在另一個優選的實施方案中，ALCATl調節劑的施用預防或治療罹患糖尿病性腎病 及其相關疾患的患者。此類疾患的實例是糖尿病性心肌纖維化。其他實例是糖尿病誘導的 睪丸中細胞凋亡和睪丸中nuage形成。
[0116] 在另一個優選的實施方案中，ALCATl是疾病進展或結果或對代謝疾病療法的響應 或耐受或與線粒體功能障礙相關的任何疾病或疾患的預后標志物。
[0117] ALCATl的調節劑：在優選實施方案中，鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶 I(ALCATl)的調節劑的方法包括使生物樣品與測試劑接觸并測量所述生物樣品中線粒體融 合蛋白分子的表達、功能或活性。在優選實施方案中，如果測試劑與基線對照相比增加線粒 體融合蛋白分子例如MFN2的表達、功能或活性，則鑒定所述測試劑為ALCATl的抑制劑。
[0118] 在另一個優選的實施方案中，鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl) 的調節劑的方法包括使生物樣品與測試劑接觸并測量包括ΒΝΡ、β-MHC、ANF或ACTAl的指 示心肌病的肥大標志物的表達。在優選實施方案中，如果測試劑與基線對照相比減少指示 心肌病的肥大標志物的表達，則鑒定所述測試劑為ALCATl的抑制劑。
[0119] 在另一個優選的實施方案中，鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl) 表達、功能或活性的調節劑的方法包括使生物樣品與測試劑接觸；測量包括FAS、TNF、 TGF-β、DGAT1、CHREBP1或SREBPl的指示糖尿病性腎病的核酸標志物或其編碼產物的表 達。在優選實施方案中，如果測試劑與基線對照相比調節？43、了即、了6?1、06411和31^?1 的表達，則鑒定所述測試劑為ALCATl的抑制劑。
[0120] 在另一個優選的實施方案中，鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl) 表達、功能或活性的調節劑的方法包括使生物樣品與測試劑接觸；測量包括PPARa、 Srebplc、FAS、ACC1、DGATl或CPTlα的指示脂肪肝疾病的核酸標志物或其編碼產物的表 達。在優選實施方案中，如果測試劑與基線對照相比調節PPARa、Srebplc、FAS、ACCl、DGAT1 或CPTlα的表達，則鑒定所述測試劑為ALCATl的抑制劑。
[0121] 脂肪肝疾病的實例包括NAFLD、Alagille綜合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、自身免 疫性肝炎、膽道閉鎖、慢性肝炎、肝癌、肝硬化、肝囊腫、脂肪肝、半乳糖血癥、吉爾伯特綜合 征（Gilbert'ssyndrome)、原發性膽汁肝硬化、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原發性硬化 性膽管炎、瑞氏綜合征（Reye'ssyndrome)、結節病、酪氨酸血癥、I型糖原C積癥、威爾森 氏病（Wilson'sdisease)、血色素沉著癥和新生兒肝炎。
[0122] 在其他優選實施方案中，通過本文具體實施的方法鑒定的脂酰輔酶A溶血心磷脂 酰基轉移酶I(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑。
[0123] 在其他優選實施方案中，藥物組合物包括通過本文具體實施的方法鑒定的脂酰輔 酶A溶血心磷脂酰基轉移酶I(ALCATl)的抑制劑。
[0124] 生物樣品可以獲自患者，例如細胞、流體等。樣品還可以是合成的，例如肽、寡核苷 酸等。樣品還可以是轉化的細胞、經表達所需分子的載體轉導的細胞、等。因此，在多個實 施方案中，生物樣品包括：流體、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、細胞、組織或其組合。
[0125] 許多劑可用于靶向ALCATl和任何相關分子。例如，所述相關分子可以是參與 ALCATl機制的任何分子，并且可以在該途徑的上游或下游。例如，所述劑可以調節基于 cDNA的分子或調節區，使用例如基于DNA的劑，例如反義抑制劑和核酶，可用于靶向靶分子 基因的內含子和外顯子以及RNA水平。
[0126] 可選地，所述劑可以靶向基于氨基酸序列的分子，包括靶分子的三維蛋白結構。基 于蛋白的劑，例如人類抗體、非人類單克隆抗體和人源化抗體可用于特異性靶向ALCATl上 的不同表位。肽或肽模擬物可用作高親和力抑制劑來特異性結合ALCATl的啟動子位點，抑 制例如ALCATl的表達。可以通過許多方式，使用所需結果來鑒定所述劑，以鑒定哪些是適 合的，例如調節MFN2、肥大標志物或PTEN誘導的假定激酶I(PINKl)表達的那些。此外，還 可以通過本領域已知的任何測定法來測定ALCATl表達、功能或活性。隨后的實施例章節還 提供了細節。
[0127] 標記的分子：在另一個優選的實施方案中，ALCATl分子、ALCATl調節劑等可以 被放射性標記。用途包括治療和為診斷和預后目的的成像。標記可以是放射性原子、 酶或發色團部分。例如，Hunter和Greenwood，Nature，144 :945 (1962)以及David等 人.Biochemistry13:1014-1021(1974)已經描述了用于標記抗體的方法。美國專利號 3, 940, 475和3, 645, 090已經描述了用于標記抗體的其他方法。例如，Leary等人.Proc. Natl.Acad.Sci.USA(1983) 80 :4045;Renz和Kurz，Nucl.AcidsRes. (1984) 12 :3435 ; Richardson和Gumport，Nucl.AcidsRes. (1983) 11 :6167;Smith等人.Nucl.AcidsRes. (1985) 13 :2399 ;以及Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem. (1984) 138 :267 已經描述了用于標 記寡核苷酸探針的方法。
[0128] 標記可以是放射性的。有用的放射性標記的一些實例包括32P、125I、mI和3H。放 射性標記的使用描述于U.K. 2, 034, 323、美國專利號4, 358, 535和美國專利號4, 302, 204。
[0129] 非放射性標記的一些實例包括酶、發色團、可通過電子顯微鏡檢測的原子和分子、 以及可通過其磁性檢測的金屬離子。
[0130] 一些有用的酶標記包括導致底物可檢測變化的酶。一些有用的酶及其底物包括例 如辣根過氧化物酶（鄰苯三酚和鄰苯二胺）、β-半乳糖苷酶（熒光素β-D-半乳吡喃糖苷） 和堿性磷酸酶（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮藍四唑）。U.Κ. 2, 019, 404、ΕΡ63, 879和 Rotman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，47,1981-1991 (1961)中已經描述了酶標記的使用。
[0131] 有用的發色團包括例如熒光、化學發光和生物發光分子，以及染料。用于本發明的 一些特定發色團包括例如熒光素、若丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白、傘形酮和魯米諾。
[0132] 可以通過本領域公知方法將標記軛合至抗體或核苷酸探針。標記可以通過探針上 的官能團直接連接。探針含有或可以使其含有這樣的官能團。合適的管官能團的一些實例 包括例如氨基、羧基、硫氫基、馬來酰亞胺、異氰酸根、異硫氰酸根。可選地，可借助偶聯劑將 諸如酶和發色團的標記軛合至抗體或核苷酸，所述偶聯劑例如二醛、碳二亞胺、二馬來酰亞 胺等。
[0133] 可以借助通過上述方法連接至探針的配體和連接至標記的該配體的受體來將標 記軛合至探針。任何已知的配體-受體組合是適合的。一些適合的配體-受體對包括例如 生物素-親和素或-鏈霉親和素、和抗體-抗原。
[0134] 在另一個優選的實施方案中，本發明的嵌合融合分子可用于成像。在成像用途中， 復合物被標記，使得它們可以在體外被檢測。典型的標記是放射性同位素，通常是具有短 半衰期的放射性同位素。可以使用通常的成像放射性同位素，例如 123i、124i、125i、131i、99mTC、 186Re、188Re、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、67Ga、9°Y、111In、18F、3H、14C、35S或 32P。還可以使用核磁共振 (NMR)成像增強劑例如釓-153來標記復合物，以通過NMR檢測。認為用于在多核苷酸或蛋 白部分中進行標記的方法和試劑是本領域已知的。
[0135] 小分子：劑的另一實例是小分子。為了鑒定作為ALCATl調節劑的小分子，小分 子測試化合物最初可以是有機或無機化學文庫的成員。如本文使用的，"小分子"指分 子量低于約3, 000道爾頓的小的有機或無機分子。小分子可以是天然產物或組合化學 文庫的成員。應該使用一組不同的分子來涵蓋許多功能，例如電荷、芳香性、氫鍵合、柔 性、大小、側鏈長度、疏水性和剛性。適合合成小分子的組合技術是本領域已知的，例如 Obrecht和Villalgordo,Solid-SupportedCombinatorialandParallelSynthesis ofSmalI-MoIecuIar-WeightCompoundLibraries,Pergamon-ElsevierScience Limited(1998)所示例的，并且包括諸如以下那些："混合裂分（splitandpool)"或"平 行"合成技術、固相和液相技術、和編碼技術（參見例如Czarnik，Curr.Opin.Chem.Bio.，I: 60(1997)。此外，許多小分子文庫是可商業途徑獲得的。
[0136] 小分子可以包括環碳或雜環結構和/或芳香族或多環芳香族結構，經一個或多個 上述官能團取代。還感興趣的小分子有生物分子中存在的結構，包括肽、糖、脂肪酸、類固 醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組合。可以篩選此類化合物以鑒定感興趣的那些， 其中許多不同的篩選方案是本領域已知的。
[0137] 小分子可以衍生自天然存在的或合成的化合物，其可獲自許多來源，包括合成或 天然化合物的文庫。例如，許多手段可用于隨機和定向合成許多有機化合物和生物分子，包 括制備隨機化寡核苷酸和寡肽。可選地，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物 文庫是可獲得或容易產生的。此外，天然或合成產生的文庫和化合物容易通過常規的化學、 物理和生化手段修飾，并且可以用于產生組合文庫。可以使已知的小分子經歷定向或隨機 化學修飾，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以產生結構類似物。
[0138] 這樣，小分子可以獲自天然存在或合成分子的文庫，包括通過組合手段產生的化 合物文庫，即，化合物多樣性組合文庫。組合文庫以及用于產生和篩選的方法是本領域已知 的。
[0139] 化學文庫：組合化學的發展允許快速經濟地合成數百至數千的分離化合物。這些 化合物通常排列于設計用于有效篩選的小分子的中型文庫中。組合方法可用于產生適于鑒 定新化合物的無偏文庫（unbiasedlibraries)。另外，可以產生從具有之前確定的生物活 性的單一母體化合物衍生的更小、更少多樣性的文庫。在任一情況下，特異性靶向由組合化 學產生的治療相關生物分子（例如重要酶的抑制劑）的有效篩選系統的缺乏阻礙了這些資 源的最佳利用。
[0140] 組合化學文庫是通過化學合成或生物合成，通過組合大量化學"結構單元"例如 試劑產生的多種化合物的集合。例如，直鏈組合化學文庫，例如多肽文庫，是通過將一組化 學結構單元（氨基酸）以大量組合和潛在地以每種可能方式組合為給定化合物長度（即， 多肽化合物中的氨基酸數目）而形成的。通過化學結構單元的這種組合混合，可以合成數 百萬的化合物。
[0141] "文庫"可包括2至50, 000, 000個多樣成員化合物。優選地，文庫包括至少48個 多樣化合物，優選96或更多個多樣化合物，更優選384或更多個多樣化合物，更優選10, 000 或更多個多樣化合物，優選超過1〇〇, 〇〇〇個多樣成員，和最優選超過1，〇〇〇, 〇〇〇個多樣成員 化合物。"多樣"的意思是文庫中超過50%的化合物具有不同于文庫任何其它成員的化學 結構。優選地，文庫中超過75 %的化合物具有不同于集合中任何其它成員的化學結構，更優 選超過90 %和最優選超過約99 %。
[0142] 組合化學文庫的制備是本領域技術人員公知的。關于綜述，參見Thompson 等人，Synthesisandapplicationofsmallmoleculelibraries,ChemRev96 ： 555-600,1996；Kenan等人，Exploringmoleculardiversitywithcombinatorial shapelibraries,TrendsBiochemSci19 :57_64,1994 ;Janda，Taggedversus untaggedlibraries!methodsforthegenerationandscreeningofcombinatorial chemicallibraries，ProcNatlAcadSciUSA.91:10779_85,1994;Lebl等人， One-bead-one-structurecombinatoriallibraries,Biopolymers37 :177-98,1995 ; Eichler等人，Peptide，peptidomimetic，andorganicsyntheticcombinatorial libraries，MedResRev. 15 :481-96,1995 ；Chabala,Solid-phasecombinatorial chemistryandnoveltaggingmethodsforidentifyingleads，CurrOpin Biotechnol.6 :632-9,1995 ；Dolle,Discoveryofenzymeinhibitorsthrough combinatorialchemistry,MolDivers. 2 :223-36,1997;Fauchere等人，Peptideand nonpeptideleaddiscoveryusingroboticallysynthesizedsolublelibraries， CanJ.PhysiolPharmacol. 75 :683_9,1997;Eichler等人，Generationandutilization ofsyntheticcombinatoriallibraries,MolMedTodayI: 174-80,1995 ;和Kay等人，Identificationofenzymeinhibitorsfromphage-displayedcombinatorialpeptide libraries,CombChemHighThroughputScreen4:535-43,2001。
[0143] 還可以使用產生化學多樣性文庫的其他化學物質。這樣的化學物質包括但不限于 類肽（PCT公布號W091/19735);編碼的肽（PCT公布W093/20242);隨機生物寡聚體（PCT 公布號冊92/00091);苯并二氮卓類（美國專利號5,288,514);多樣體（(1"618〇11161·)， 例如乙內酰脲類、苯并二氮卓類和二肽類（Hobbs等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,90 : 6909-6913(1993)));插烯化（vinylogous)多膚（Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc. 114 : 6568(1992));具有β-D-葡萄糖支架的非肽的擬肽（Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.， 114 :9217-9218(1992));小化合物文庫的類似有機綜合體（Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.， 116 :2661(1994));寡聚氨基甲酸酯（Cho等人，Science，261 :1303(1993));和 / 或肽基 勝酸酯（Campbell等人，J.Org.Chem. 59 :658(1994));核酸文庫（參見，Ausubel，Berger 和Sambrook，全部同上）；肽核酸文庫（參見例如美國專利號5, 539, 083 ;抗體文庫（參見 例如Vaughn等人，NatureBiotechnology，14(3) :309-314(1996)和PCT/US96/10287); 碳水化合物文庫（參見例如Liang等人，Science，274 :1520-1522(1996)和美國專利號 5, 593, 853);小有機分子文庫（參見例如，苯二氮卓類，BaumC&ENews，1月18日，第33頁 (1993));異戊二烯類（美國專利號5, 569, 588);噻唑烷酮類和間噻嗪酮類（美國專利號 5, 549, 974);吡咯烷（美國專利號5, 525, 735和5, 519, 134);嗎啉化合物（美國專利號 5, 506, 337)和苯并二氮卓類（美國專利號5, 288, 514);等。
[0144] 用于制備組合文庫的裝置可以商業途徑獲得（參見例如，357MPS，390MPS， AdvancedChem.Tech,LouisvilleKy.,Symphony,Rainin,Woburn,Mass. ,433AApplied Biosystems，FosterCity，Calif. ,9050Plus，Millipore，Bedford，Mass·)。此外，許多組 合文庫本身可商業途徑獲得（參見例如，ComGenex,Princeton,N.J.，Asinex,Moscow,Ru,T ripos,Inc. ,St.Louis,Mo. ,ChemStar,Ltd. ,Moscow,RU, 3DPharmaceuticals,Exton,Pa., MartekBiosciences,Columbia,Md.，等）。
[0145] 除了靶向ALCATl和相關分子，還可以使用競爭結合位點或信號傳導位點的劑。
[0146] 在多個實施方案中，劑調節ALCATl啟動子的相互作用。劑的實例包括但不限于： 抗體、適體、RNAi、小分子、干擾轉錄因子-DNA結合組裝并因此抑制復合物形成的特定合成 或天然肽的高親和力結合。在一些方面，所述劑抑制ALCATl表達（例如，通過siRNA)。
[0147] 本發明一個實施方案包括結合例如ALCATl的分離的抗體或這些抗體的片段。如 本領域所示，抗體可以是例如多克隆、寡克隆、單克隆、嵌合、人源化和/或完整人抗體。本 文描述的本發明的實施方案還提供了用于產生這些抗體的細胞。
[0148] 干擾RNA:可以使用本領域技術人員已知的許多技術來獲得詳細的生產方法。例 如，使用本領域已知的方法，例如Tuschl等人的美國公開申請2002/0086356中描述的果蠅 體外系統，可以化學合成或重組產生siRNA，其全部內容在此通過引用并入。
[0149] 可以使用測量細胞中RNA或蛋白水平的標準技術評價含有給定靶序列的RNAi引 起RNAi介導的靶mRNA降解的能力。例如，可以將本發明的RNA遞送至培養的細胞，并且可 以通過Northern印跡或斑點印跡技術或者通過定量RT-PCR測量祀mRNA的水平。還可以使 用動物模型例如小鼠模型來評價含有給定靶序列的siRNA對靶mRNA的RNAi介導的降解。 使用如上所述分離和定量mRNA或蛋白的標準技術，通過測量受試者細胞中祀mRNA或蛋白 的水平，可以檢測靶mRNA的RNAi介導的降解。
[0150] 在一個優選實施方案中，SiRNA分子靶向希望的有義/反義基因座的重疊區，從而 調節有義和反義轉錄子，例如靶向石槲高堿。在另一個優選的實施方案中，組合物包括任一 個或多個SiRNA分子、和/或SiRNA組合、重疊希望靶基因座和/或靶向有義和反義兩者 (重疊或以其他方式）的siRNA。這些分子可以涉及任何疾病或異常的潛在療法所需的任 何靶。理論上，對于待靶向的分子沒有限制。而且，本文教導的技術允許為每個個體定制療 法。
[0151] 在優選實施方案中，可以為個體療法定制寡核苷酸，例如，這些寡核苷酸可以是特 異性針對個體中等位基因變體的序列，靶的上調或抑制可以在不同程度上操控，例如相對 于對照10 %、20 %、40 %、100 %表達。即，在一些患者中，它可以有效增加或減少靶基因表達 10%，而在另一患者中80*%。
[0152] 通過測量內源靶RNA或者通過翻譯靶RNA產生的蛋白，可以定量基因表達的調節 (上調或抑制）。RNA和蛋白的定量技術是本領域普通技術人員所熟知的。在某些優選實施 方案中，基因表達被抑制至少10%、優選至少33%、更優選至少50%、和更優選至少80%。 在本發明的特別優選的實施方案中，基因表達在生物體細胞內被抑制至少90%、更優選至 少95%、或至少99%至100%。在某些優選實施方案中，基因表達被上調至少10%、優選至 少33%、更優選至少50%、和更優選至少80%。在本發明的特別優選的實施方案中，基因表 達在生物體的細胞內被上調至少90%、更優選至少95%或至少99%至100%。
[0153] 通過使用自動比對核酸序列并指示同一性或同源性區域的計算機程序，幫助選擇 適合的RNAi。這類程序用于對比獲得的核酸序列，例如通過搜索數據庫例如GenBank或通 過測序PCR產物。來自一定范圍的物種的核酸序列的對比允許選擇在物種間顯示出適當同 一性程度的核酸序列。對于還未測序的基因，進行Southern印跡以允許測定靶物種與其它 物種的基因之間的同一性程度。如本領域所公知的，通過在不同嚴格程度下進行Southern 印跡，可能獲得同一性的近似測量。這些程序允許選擇表現出與待控制的受試者靶核酸序 列高度互補性以及與其它物種相應核酸序列較低程度互補性的RNAi。本領域技術人員會認 識到，在選擇用于本發明的適當基因區域時有相當大的自由度。
[0154] 在一個優選實施方案中，使用適體或本領域已知的任何其他類型的遞送媒介物 將作為RNA本身或作為DNA的小干擾RNA(SiRNA)遞送至細胞。在某些實施方案中，本公 開的核酸分子可以單獨合成并在合成后結合在一起，例如通過連接（Moore等人，Science 256 :9923,1992;Draper等人，PCT公布號W093/23569;Shabarova等人，NucleicAcids Res. 19 :4247,1991;Bellon等人，Nucleosides&Nucleotides16 :951，1997;Bellon等人， BioconjugateChem. 8 :204,1997)，或通過合成或脫保護后的雜交。
[0155] 在進一步實施方案中，介導干擾的寡核苷酸可以作為由編碼一個或多個SiRNA 并指導其在宿主細胞內表達的多核苷酸載體表達的單一或多個轉錄產物制備。本公開 的siRNA或其類似物可以進一步包括結合適體和siRNA的核苷酸、非核苷酸或混合核苷 酸/非核苷酸連接體。在一個實施方案中，核苷酸連接體可以是超過約2個核苷酸長度 至約50個核苷酸長度的連接體。在另一個實施方案中，核苷酸連接體可以是核酸適體。 本文使用的"適體"或"核酸適體"表示特異性結合靶分子的核酸分子，其中所述核酸分 子具有包括在其天然環境下被靶分子識別的序列的序列。可選地，適體可以是結合靶分 子的核酸分子，其中所述靶分子天然不結合核酸。靶分子可以是任何感興趣的分子。例 如，可以使用適體結合蛋白的配體-結合結構域，從而預防天然存在的配體與蛋白的相互 作用。這是非限制性的實例，并且本領域技術人員將理解，可以使用本領域公知的技術容 易地產生其他實施方案（參見例如，Gold等人，Annu.Rev.Biochem. 64 :763,1995;Brody 和Gold，J.Biotechnol. 74 :5, 2000 ;Sun，Curr.Opin.Mol.Ther. 2 :100,2000 ;Kusser， J.Biotechnol. 74 :27,2000;Hermann和Patel，Science287:820,2000;和Jayasena， ClinicalChem. 45 :1628,1999)。
[0156] 本發明可以針對蛋白編碼基因產物以及非蛋白編碼基因產物使用。非蛋白編碼基 因產物的實例包括編碼以下的基因產物：核糖體RNA、轉運RNA、小核RNA、小細胞質1^、端 粒末端轉移酶RNA、參與DNA復制、染色體重排的RNA分子等。
[0157] 根據本發明，SiRNA寡核苷酸療法包括施用的SiRNA寡核苷酸，其與來自所述基因 的靶向mRNA接觸（相互作用），由此調節該基因的表達。這種表達的調節適當地可以是相對 于對照至少約10%或20%的差異，更優選相對于對照至少約30%、40%、50%、60%、70%、 80%或90%的表達差異。特別優選的是，與SiRNA寡核苷酸的相互作用或接觸導致相對于 對照完全或基本完全的表達調節，例如相對于對照至少約95%、97%、98%、99%或100% 的表達抑制或增加。用于測定這種調節的對照樣品可以是還未與siRNA寡核苷酸接觸的相 當細胞（體外或體內）。
[0158] 在另一個優選的實施方案中，可以修飾siRNA中的核堿基以提供對靶mRNA較高的 特異性和親和力。例如，可以用LNA單體取代核堿基，其可以連續區段或在不同位置。修飾 的siRNA優選具有比互補序列更高的對靶序列的結合常數（Ka)。使用雜交測定并如所附實 施例中描述的，可以在多種嚴格條件下體外測定修飾或非修飾的siRNA對靶序列的結合。
[0159] 嵌合/修飾的siRNA:根據本發明，本領域普通技術人員將理解mRNA不僅包括攜 帶利用三字母遺傳密碼子（包括翻譯起始和終止密碼子）編碼蛋白的信息的編碼區，還包 括形成本領域普通技術人員已知作為5'非翻譯區、3'非翻譯區、5'帽區、內含子區和內含 子/外顯子或剪接點核糖核苷酸的區域的相關核糖核苷酸。因而，可以根據本發明配制完 全或部分靶向這些相關核糖核苷酸以及編碼核糖核苷酸的寡核苷酸。在優選實施方案中， 寡核苷酸靶向mRNA的編碼區翻譯起始位點（AUG密碼子）或序列、5'非翻譯區或3'非翻譯 區。待干擾的信使RNA的功能包括所有重要功能，例如RNA轉位至蛋白翻譯位點、從RNA到 蛋白的實際翻譯、RNA的剪接或成熟、和可能甚至是RNA可參與的獨立催化活性。對RNA功 能的這種干擾的總體效應是引起蛋白表達的干擾。
[0160] 其他劑：這些可以包括任何合成或天然的肽、糖蛋白、酶、信號傳導的調節劑、轉錄 組裝抑制劑或轉錄因子復合物、有機或無機分子等。
[0161] 本發明的其他實施方案包括編碼本文描述的靶向結合劑、抗體或其片段的任何一 個的分尚的核酸分子、具有分尚的核酸分子的載體或用此類核酸分子任何一個轉化的宿主 細胞。應該理解，本發明實施方案還包括編碼本發明抗體或抗體片段的任何核酸分子，包括 為了當轉染進入宿主細胞供抗體生成時增加抗體或其片段產量而優化的核酸序列。
[0162] 微陣列：通過將核酸文庫固定在基底表面使得每個獨特核酸位于確定位置以形成 陣列，可以實現能夠結合ALCATl和相關分子的核酸序列的鑒定。一般而言，使固定的核酸 文庫在有助于生物分子與核酸結合的條件下暴露于生物分子或候選劑。可以根據想要的結 合特異性水平，使用溫和至嚴格的緩沖液條件洗掉非特異性結合的生物分子。然后分析核 酸陣列以確定哪些核酸序列結合至生物分子。優選地，生物分子將攜帶用于檢測結合核酸 定位的熒光標簽。
[0163] 使用固定的核酸序列陣列的測定可用于測定未知核酸的序列；單核苷酸多態性 (SNP)分析；從特定物種基因表達的分析、組織、細胞類型、基因鑒定；等。
[0164] 從編碼想要的基因表達產物的序列設計的寡核苷酸的其他診斷用途可以涉及PCR 的使用。這些寡聚體可以是化學合成的，酶法產生的，或者體外產生的。寡聚體優選含有編 碼表達產物的多核苷酸的片段，或者與該多核苷酸互補的多核苷酸的片段，并且在用于鑒 定特定基因的優化條件下使用。寡聚體還可以在用于檢測或定量密切相關的DNA或RNA序 列的較不嚴格條件下使用。
[0165] 在其他實施方案中，從多核苷酸序列的任何一個衍生的寡核苷酸或更長片段可用 作微陣列中的靶。微陣列可用于同時監測大量基因和基因產物的身份和/或表達水平，以 鑒定與靶基因或其產物相互作用的基因和/或評估候選治療劑在調節介導例如神經系統 疾患的基因的表達產物中的效力。該信息可用于測定基因功能，并且開發和監測治療劑活 性。
[0166] 可以使用本領域已知的方法制備、使用和分析微陣列（參見例如，Brennan等 人，1995,美國專利號 5, 474, 796;Schena等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 : 10614-10619;Baldeschweiler等人，1995,PCT申請W095/251116;Shalon等人，1995， PCT申請W095/35505;Heller等人，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94 :2150-2155 ;和 Heller等人，1997,美國專利號5, 605, 662)。在其他實施方案中，微陣列包括肽或可以被測 定以鑒定候選劑的其他所需分子。
[0167] 藥物篩選的另一種技術提供了對感興趣蛋白具有合適結合親和力的化合物的高 通量篩選（參見例如，Geysen等人，1984，PCT申請W084/03564)。在該方法中，在固體基底 上合成大量不同的小測試化合物。使所述測試化合物與鑒定的基因或其片段反應，并洗滌。 然后通過本領域公知方法檢測結合的分子。可選地，非中和抗體可用于捕獲肽并將其固定 在固體載體上。
[0168] 本發明的篩選方法包括使用篩選測定從多樣分子文庫鑒定一種或多種具有所需 活性的化合物。"篩選測定"是被設計以鑒定、分離和/或測定具有預選活性的集合內的化合 物結構的選擇性測定。"鑒定"的意思是分離具有所需活性的化合物，測定其化學結構（包 括但不限于分別測定核酸和多肽的核苷酸和氨基酸序列），以及附加或可選地，純化具有篩 選活性的化合物）。設計生化和生物測定以測試在范圍從蛋白-蛋白相互作用、酶催化、小 分子-蛋白結合到細胞功能的寬范圍系統中的活性。此類測定包括自動化、半自動化測定 和HTS(高通量篩選）測定。
[0169] 在HTS方法中，許多分離化合物優選通過機器、自動或半自動方法平行測試，以便 根據所需活性同時或接近同時篩選大量測試化合物。使用本發明的集成系統，可能每天測 定和篩選達約6, 000至20, 000和甚至達約100, 000至1，000, 000個不同的化合物。
[0170] 通常在HTS中，靶分子與具有調節受體的分離細胞（包括適當對照）一起施用或 培養。
[0171] 在一個實施方案中，篩選包括使每個細胞培養物與多樣文庫的成員化合物（其中 一些是感興趣的配體）在其中靶和配體之間可以形成復合物的條件下接觸，并鑒定文庫中 哪些成員存在于此類復合物中。在另一個非限制性模式中，篩選包括使靶酶與多樣文庫的 成員化合物（其中一些是靶的抑制劑（或激活劑））在其中被所述酶催化的反應的產物或 反應物產生可檢測信號的條件下接觸。在后一模式中，靶酶的抑制劑減少了來自可檢測產 物的信號或增加了來自可檢測反應物的信號（或者對于激活劑而言是反過來的）。
[0172] 在一個實施方案中，本發明提供使用本文具體實施的任何分子（例如，ALCATl或 ALCATl、MFN2、PTEN等的調節劑）或表達天然存在或重組的這些分子蛋白的任何一個的細 胞或組織的適當測定。在另一個實施方案中，本發明提供了高通量形式的基于固相的體外 測定，其中，例如，ALCATl分子或其片段與固相基底連接。本文所述測定的任何一個可適于 高通量篩選，例如配體結合、細胞增殖、細胞表面標志物通量、放射性標記的GTP結合、第二 信使通量，例如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP，細胞因子生成，等。在可溶或固體狀態的本發明的 高通量測定中，可能在一天篩選達數千種不同的調節劑或配體。
[0173] 本方法可在體外用于ALCATl蛋白，或者用于基于細胞或基于膜的包括ALCATl蛋 白的測定。具體地，微量滴定板的每個孔可用于運行針對選定潛在調節劑的單獨測定，或者 如果要觀察濃度或孵育時間的影響，每5-10個孔可測試單個調節劑。因此，單個標準微量 滴定板可以測定約100 (例如96)種調節劑。如果使用1536孔板，則單個板可容易測定約 100至約1500個不同的化合物。可能每天測定許多板；使用本發明的集成系統測定篩選達 約6, 000、20, 000、50, 000或超過100, 000個不同化合物是可能的。
[0174] 對于固態反應，感興趣的蛋白或其片段，例如細胞外結構域，或者包括感興趣的蛋 白或其片段作為融合蛋白一部分的細胞或膜可以通過例如標簽共價或非共價鍵直接或間 接結合至固態組分。所述標簽可以是許多組分的任何一種。一般而言，結合所述標簽的分 子（標簽結合劑）固定至固體支持體，并且感興趣的標簽分子通過標簽與標簽結合劑的相 互作用連接至固體支持體。
[0175] 基于文獻中充分描述的已知的分子相互作用，可以使用許多標簽和標簽結合劑。 例如，當標簽具有天然結合劑時，例如生物素、蛋白A或蛋白G，其可以與適當的標簽結合 劑（親和素、鏈霉親和素、中和親和素、免疫球蛋白的Fc區等）結合使用。針對具有天然 結合劑的分子（例如生物素）的抗體也是廣泛可獲得且適當的標簽結合劑；參見SIGM Immunochemicals1998catalogueSIGMA,St.LouisMo.)〇
[0176] 類似地，任何半抗原或抗原化合物可以與適當抗體組合使用以形成標簽/標簽結 合劑對。數百種特定抗體是可商業途徑獲得的，并且許多其他抗體描述于文獻中。例如，在 一個常見構型中，標簽是第一抗體，并且標簽結合劑是識別所述第一抗體的第二抗體。除 了抗體-抗原相互作用，受體-配體相互作用作為標簽和標簽-結合劑對也是適當的。例 如，細胞膜受體的激動劑和拮抗劑（例如，細胞受體-配體相互作用，例如運鐵蛋白、c-kit、 病毒性受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白細胞介素受體、免疫球蛋白受體和抗 體、I丐粘素家族、整聯蛋白家族、選擇蛋白家族等；參見例如，Pigott&Power，TheAdhesion MoleculeFactsBook1(1993)。類似地，毒素和毒液、病毒性表位、激素（例如，阿片類、類 固醇等）、細胞內受體（例如，其介導各種小配體的效應，所述小配體包括類固醇、甲狀腺激 素、維甲酸類和維生素D;肽）、藥物、凝集素、糖、核酸（直鏈和環狀聚合物構型）、寡糖、蛋 白、磷脂和抗體都可以與各種細胞受體相互作用。
[0177] 合成的聚合物，例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐 硫、聚硅氧烷、聚酰亞胺和聚乙酸酯還可以形成適當的標簽或標簽結合劑。如對于參考本 公開內容的技術人員而言明顯的，許多其他標簽/標簽結合劑對還用于本文描述的測定系 統。
[0178] 常用的連接體，例如肽、聚醚等也可以用作標簽，并且包括多肽序列，例如約5至 200個氨基酸的聚gly序列。此類柔性連接體是本領域技術人員已知的。例如，聚（乙二 醇）連接體可獲自ShearwaterPolymers,Inc.Huntsville,Ala。這些連接體任選具有醜胺 鍵、硫氫基鍵或雜官能鍵。
[0179] 使用目前可獲得的許多方法的任何一個將標簽結合劑固定至固體基底。通常通 過將基底的全部或一部分暴露于使化學基團固定至與標簽結合劑的一部分反應性的表 面的化學試劑而衍生或官能化固體基底。例如，適合連接至長鏈部分的基團包括胺、羥 基、疏基和竣基。氣基燒基娃燒和輕基燒基娃燒可用于官能化許多表面，例如玻璃表面。 此類固相生物聚合物陣列的構建充分描述于文獻。參見例如，Merrifield，J.Am.Chem. Soc. 85 :2149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成）；Geysen等人，J.Immun.MetL102 : 259-274(1987)(描述 了在針上的固相組分的合成）；Frank&Doring，Tetrahedron44: 60316040(1988)(描述了再纖維素盤上的各種肽序列的合成）；Fodor等人，Science, 251 : 767-777(1991);Sheldon等人，ClinicalChemistry39(4) :718-719(1993);和Kozal等 人，NatureMedicine2(7) :753759(1996)(全部描述固定至固體基底的生物聚合物的陣 列）。將標簽結合劑固定至基底的非化學方法包括其他常見方法，例如加熱、通過UV輻射的 交聯等。
[0180] 給患者施用組合物
[0181] 可以任何適當制劑給包括人類的動物施用通過本文描述的方法鑒定的組合物或 齊IJ。例如，用于調節蛋白降解的組合物可以在藥學可接受的載體或稀釋劑（例如生理鹽水 或緩沖鹽溶液）中配制。適當的載體和稀釋劑可以根據施用的模式和途經以及標準藥學實 踐來選擇。示例性藥學可接受的載體和稀釋劑連同藥物制劑的描述可以參見本領域的標準 課文《雷明頓藥物科學》（Remington，sPharmaceuticalSciences)以及USP/NF。可以向 組合物中添加其他物質，以穩定和/或保存所述組合物。
[0182] 可以通過任何常規技術向動物施用本發明組合物。例如，通過手術遞送至內部或 外部靶部位或者通過導管至血管可及的部位，可以將組合物直接遞送至靶部位。其他遞送 方法，例如脂質體遞送或從充滿組合物的裝置擴散，是本領域已知的。組合物可以單次濃 注、多次注射或通過連續輸注（例如，靜脈內）來施用。對于胃腸外施用，優選以無菌無熱 原形式配制組合物。
[0183] 劑或化合物可以與一種或多種療法一起施用。可以節拍方案施用化療劑。如本文 使用的"節拍"療法指連續低劑量治療劑的施用。
[0184] 可以通過標準藥學規程在細胞培養物或實驗動物中測定此類化合物的劑量、毒性 和治療效力，例如以測定LD5tl (半數致死劑量）和ED5tl (半數治療有效劑量）。毒性效應與治 療效應的劑量比是治療指數，它可以表示為比率LD5tZED5tl。表現出高治療指數的化合物是 優選的。雖然可以使用表現出毒性副作用的化合物，但是應該小心設計遞送系統，該遞送系 統靶向此類化合物至受累組織部位以最小化對未感染細胞的潛在損失并從而減少副作用。
[0185] 從細胞培養物測定和動物研究獲得的數據可用于配制用于人類的劑量范圍。此類 化合物的劑量優選處于循環濃度范圍內，包括很少或沒有毒性的ED5tl。劑量可以在該范圍 內變化，取決于采用的劑型和使用的施用途徑。對于本發明方法中使用的任何化合物，可以 從細胞培養物測定開始估計治療有效劑量。可以在動物模型中配制劑量以達到循環血漿濃 度范圍，包括如在細胞培養物中測定的IC5tl(即，實現癥狀的半最大抑制的測試化合物的濃 度）。此類信息可用于更準確確定在人類中有用的劑量。例如，可以通過高效液相色譜測量 血漿水平。
[0186] 如本文定義的，治療有效量的化合物（S卩，有效劑量）表示足以產生治療上（例如 臨床上）希望結果的量。可以每天一次或多次到每周一次或多次來施用組合物；包括每兩 天一次。技術人員將理解，某些因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時機，包括但不 限于疾病或疾患嚴重度、之前治療、受試者健康狀況和/或年齡、和存在的其他疾病。而且， 用治療有效量的本發明化合物治療受試者可以包括單次治療或一系列治療。
[0187] 制劑：雖然單獨施用的組合物是可能的，但是優選以藥物制劑來提供組合物。對于 局部施用，活性成分可以占制劑的〇. 001 %至10 %w/w、例如1 %至2 %重量，但是它可以占 制劑的多如10%w/w但優選不超過5%w/w并且更優選0. 1%至1%w/w。本發明的局部制 劑包括活性成分及其一種或多種可接受的載體以及任選任何其他治療成分。在與制劑的其 他成分相容并且對其受體無害的意義上，載體必須是"可接受的"。
[0188] 適合局部施用的制劑包括適合穿過皮膚至需要治療的部位的液體或半固體制品， 例如擦劑、洗劑、乳霜、軟膏或糊劑、以及適合施用至眼、耳或鼻的滴劑。根據本發明的滴劑 可以包括無菌的水性或油性溶液或懸液，并且可以通過將活性成分溶解于殺細菌和/或殺 真菌劑和/或任何其他適當防腐劑的適當水溶液中來制備，并且優選包括表面活性劑。然 后，可以將得到溶液通過過濾澄清并除菌，并通過無菌技術轉移至容器。適合加入滴劑的殺 細菌和殺真菌劑的實例有硝酸或醋酸苯汞（0.002% )、苯扎氯銨（0.01% )和醋酸氯己定 (0. 01% )。適合制備油性溶液的溶劑包括甘油、稀釋的乙醇和丙二醇。
[0189] 根據本發明的洗劑包括適合應用至皮膚或眼的那些。眼洗劑可以包括任選含有殺 菌劑的無菌水溶液，并且可以通過類似于滴劑制備的那些方法來制備。用于應用至皮膚的 洗劑或擦劑還可以包括加速干燥和冷卻皮膚的劑，例如乙醇或丙酮，和/或潤濕劑，例如甘 油或油，例如蓖麻油或花生油。
[0190] 根據本發明的乳霜、軟膏或糊劑是用于外部應用的活性成分的半固體制劑。它們 的制備可以通過單獨混合細分或粉末形式的活性成分，或在適當機器輔助下與油脂或非油 脂基底在水性或非水性流體中的溶液或懸液中混合。所述基底可以包括烴，例如硬、軟或液 體石錯、甘油、蜂錯、金屬阜；粘液；天然來源例如杏仁、玉米、花生、菌麻或欖橄油的油；羊 毛脂或其衍生物，或脂肪酸，例如硬脂酸或油酸連同醇，例如丙二醇或大粒凝膠。制劑可以 加入任何適當的表面活性劑，例如陰離子、陽離子或非離子表面活性劑，例如脫水山梨糖醇 酯或其聚氧乙烯衍生物。還可以包括懸浮劑例如天然橡膠、纖維素衍生物或無機材料（例 如硅質硅石）和其他成分例如羊毛脂。
[0191] 雖然上文已經描述了本發明的不同實施方案，但是應該理解，它們只是作為例子 而非限制來提供。可以根據本文公開的內容在不背離本發明精神或范圍的情況下對公開的 實施方案做出許多變化。因此，本發明的寬度和范圍不應受上述實施方案的任何一個的限 制。
[0192] 本文提到的所有文件在此通過引用并入。本申請引用的所有出版物和專利文件為 所有目的通過引用并入，如同每個單獨出版物或專利文件如此單獨表示的程度。對于各種 參考文獻在本文件中的引用， 申請人:不承認任何特定參考文獻是其發明的"現有技術"。本 發明組合物和方法的實施方案在以下實施例中示例說明。 實施例
[0193] 以下非限制性實施例用于示例說明選定的本發明實施方案。要理解，所示組分的 比例變化和要素選擇對于本領域技術人員是明顯的，并且在本發明實施方案的范圍內。
[0194] 實施例1 :通過ALCATl的心磷脂重塑通過調節MFN2表達而控制線粒體生物發生 和mtDNA保真性
[0195] 本研究尋求推進對ALCATl調節與氧化應激相關的線粒體功能障礙的分子機制的 理解。在該過程中，鑒定了ALCATl調節線粒體融合和mtDNA保真性的預料不到的作用，暗 示了ALCATl在年齡相關疾病中的MFN2缺陷和線粒體片段化中的關鍵作用。
[0196] 材料和方法
[0197] ALCATl敲除小鼠：ALCATl敲除小鼠的產生和耗氧率（OCR)的測量如之前描述的 (LiJ等人.（2010).CellMetab12⑵：154-165)。所有實驗使用了匹配年齡和性別的同窩 對照，并且依照根據NIH指南（NIH出版號86-23,1985)批準的機構動物護理和使用方案。
[0198] 試劑：本研究使用的抗體包括抑制蛋白和I丐聯結蛋白的單克隆抗體，購自Santa CruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。MFN1、MFN2 和OPAl的單克隆抗體來自Abeam。驢 抗兔和驢抗小鼠IgG辣根過氧化物酶軛合抗體購自GEHealthcare(Piscataway，NJ)。驢 抗小鼠和驢抗兔FITC軛合的抗體來自SantaCruzBiotechnology。羰基氰對三氟甲氧基 苯基腙（FCCP)、魚藤酮、抗霉素、寡霉素和二聯苯硫酸碘（DPI)購自Invitrogen。
[0199] 動物護理：4至6周大的雄性和雌性C57BL/6J小鼠購自JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)。所有動物保持在環境受控的設施中，具有每日光循環，并自由獲取水和標準嚙 齒類動物食物（HarlandTeklad2018,Madison，Wisconsin)或來自ResearchDiets的高 脂肪飲食（NewBrunswick，NJ;目錄號D12492)。所有涉及動物的實驗依照根據NIH指南 (NIH出版號86-23,1985)批準的機構動物護理和使用方案進行。
[0200] 免疫熒光共聚焦顯微鏡和圖像分析：對于免疫熒光染色，將細胞在4%低聚甲醛 中固定10分鐘，用PBS洗滌兩次，然后用0.l%TritonX-100通透10分鐘。固定的細胞在含 有5%牛血清白蛋白的PBS中室溫下預孵育30分鐘。用一抗（抗Myc單克隆抗體，I:500稀 釋）在室溫下對細胞染色3h，隨后用與FITC軛合的二抗（I:1000稀釋，SantaCruz)孵育。 對于線粒體染色，將細胞在37°C孵育器中用MitotrackerRed(終濃度IOOnM)染色細胞， 用PBS洗滌三次，每次洗滌5分鐘。然后在配備有雙極溫度控制器的共聚焦顯微鏡（Leica TCSSP2A0BS)下分析細胞。使用AdobePhotoshop7.0 處理圖像，并使用ImageJ(National InstitutesofHealth)進行定量分析。所有實驗進行至少三次，具有相似結果。
[0201] EM分析：在4%低聚甲醛和5 %戊二醛中固定細胞，依次在2%OsO4和1%乙酸雙 氧鈾中染色，通過一系列乙醇洗滌脫水，并包埋于Embed-812樹脂中供切片和分析。使用 JEOL1200EX透射電子顯微鏡分析樣品。
[0202]mtDNA突變測定：對于mtDNA分離，均化MEF和C2C12細胞并分離線粒體級分，如 之前所述（Li等人，（2010).CellMetab12(2) :154-165)。然后在 0.5%SDS和 0.2mg/ml 蛋白酶K存在下在IOmMTris-HCl、0. 15MNaCl和0. 005MEDTA中裂解線粒體。通過苯酚/ 氯仿提取和乙醇沉淀來純化mtDNA。如之前所述進行隨機突變捕獲測定（Chen等人，2010. Cell141(2) :280-289)。簡言之，用TaqI消化mtDNA持續5h，然后在96孔形式中稀釋，并用 側翼具有TaqI限制酶位點的引物探測以檢測含有TaqI限制酶位點突變的mtDNA基因組。 使用對照引物對來檢測被考察的mtDNA基因組的量。使用ABISt印OnePlus?和95°CSYBr GREENPCRMasterMix在20μ1反應中進行PCR。使用以下程序進行定量PCR擴增：第1 步，95°C持續IOmin;第2步，持續15s;第3步，60°C持續Imin;第4步，進入第2步40次； 第5步，從65°C至95°C的熔解曲線。
[0203] 線粒體融合測定：穩定表達ACLATl或載體對照的C2C12細胞以5XIO5每6cm2板 接種，并分別用線粒體祀向的綠色突光蛋白（mtEGFP)或線粒體祀向的dsRED2(mtDsred2) 轉染。30h之后，將分別表達mtEGFP和mtDsRed2的個體細胞池混合并以1 :1比率共同鋪 板在13-mm圓形蓋玻片上。6h之后，通過用50% (wt/vol)PEG1500在PBS(Sigma)中的溶 液處理60秒鐘而誘導融合，隨后在補充了 10%FCS的DMEM中充分洗滌。為了抑制蛋白合 成，在融合之前30min添加環己酰亞胺（20yg/ml)并保持在隨后使用的所有溶液和細胞培 養介質中，直至細胞用冰冷的4%甲醛的PBS溶液固定lOmin。在用PBS洗滌三次之后，將 蓋玻片安裝在載玻片上并保持在暗箱中4°C過夜。
[0204] 小鼠胚胎成纖維細胞（MEF)制品：第12. 5胚胎日的雌性小鼠被安樂死。在具有 HBSS的盤上解剖胚胎。去除頭、四肢和內臟。剩余胚胎用柳葉刀或剃刀刀片切碎，轉移至 含有4ml膠原酶溶液的15ml管，然后用4ml洗滌盤以獲得所有胚胎部分。將管在37°C孵 育箱中旋轉30-60min，直至所有組織塊消失。通過IOOym網過濾消化的溶液至含有冷 DMEM(30ml)的50ml管。以1200rpm離心樣品5min，用25mlDMEM再次洗滌細胞沉淀。然 后用完全培養基接種細胞。
[0205] XF24 生物能量測定：使用SeahorseXF24 分析儀（SeahorseBioscience)測量耗 氧率（0CR)，如之前所述（Li等人，2010CellMetab12(2) :154-165)。平衡之后，將測試 試劑預先加載到02傳感器筒的試劑遞送室內，并在XF呼吸計讀出基礎耗氧率之后注射進 孔中。獲得耗氧率（皮摩爾/分鐘）。基線測量之后，將70μ1在測定介質中準備的測試 劑注射進入每個孔，以達到所需終濃度。這之后，混合2分鐘以加快化合物對細胞蛋白的暴 露，然后進行OCR測量。
[0206] 統計分析：使用雙尾非配對t檢驗進行統計對比以確定兩種C2C12細胞系之間和 ALCAT1+與野生型小鼠之間的差異。數據表示為平均值土SEM。p〈0.05被認為是統計學顯 著的。
[0207] 結果
[0208] ALCATl在C2C12細胞中引起線粒體片段化和mtDNA不穩定。ALCATl是催化病理 性CL重塑的溶血心磷脂酰基轉移酶，導致糖尿病和肥胖中的ROS產生和線粒體功能障礙。 ROS引起線粒體片段化，其已經牽涉于年齡相關的疾病。這里，考察ALCATl過表達在被flag 標簽化ALCATlcDNA(C2C12-Al)或載體對照（C2C12-V)穩定轉染的C2C12細胞系中調節線 粒體和ER形態的作用。C2C12-A1細胞中ALCATl的mRNA表達水平僅三倍于C2C12-V細胞 (圖8)，并且匹配糖尿病和肥胖發作誘導的ALCATl表達水平。如圖1A-1I(圖IlC中定量） 所示，ALCATl過表達引起線粒體片段化，如C2C12-A1細胞中超過95%片段化線粒體所證明 的。此外，ALCATl過表達導致C2C12-A1細胞中縮短的線粒體和線粒體膨脹（圖1E，圖IG 中突出顯示），如通過電子顯微鏡（EM)分析所分析的。而且，與載體對照相比，ALCATl過表 達還引起ER擴大（圖1D，圖IF中用虛線突出顯示），這與之前報道的ALCATl在線粒體相 關膜（MM)的定位一致。
[0209] 線粒體片段化經常與mtDNA不穩定相關。鑒于異常的線粒體形態，通過RT-PCR分 析考察了ALCATl在調節mtDNA拷貝數和突變率中的作用。顯著地，ALCATl過表達顯著消 耗了C2C12-A1細胞中的mtDNA拷貝數（圖1H)。而且，ALCATl過表達還顯著增加了mtDNA 突變率（圖II)，提供了ALCATl調節線粒體質量和mtDNA穩定性的主要作用的證據。
[0210] ALCATl的消除增加了小鼠中的線粒體質量和mtDNA保真性。使用ALCATl敲除小 鼠，通過EM分析，在分離的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF)和骨骼肌中考察了ALCATl缺陷對線 粒體形態、mtDNA質量和mtDNA突變率的影響。支持C2C12細胞中的發現，ALCATl缺陷顯著 增加了培養的MEF中的線粒體密度（圖2B，圖2D中突出顯示）。ALCATl的消除顯著增加 了脛骨前縱截面中肌肉纖維的厚度，如擴大的暗A帶和亮I帶所證明的，暗A帶和亮I帶分 別代表肌球蛋白絲和肌動蛋白絲（圖2F)。這些結果得到顯示以下數據的支持=ALCATl缺 陷顯著增加ALCATl敲除小鼠中的瘦肉質量。而且，ALCATl的消除顯著增加mtDNA拷貝數 (圖2G)。顯著地，ALCATl缺陷還顯著提高mtDNA保真性，如通過從ALCATl敲除小鼠分離 的MEF中顯著降低的mtDNA突變率所證明的（圖2H)。
[0211] ALCATl調節MFN2表達的關鍵作用：MFN2是線粒體和內質網形態和作為功能橋的 栓系所需的。來自MFN2V_小鼠的MEF展示出片段化線粒體和擴大的ER池，類似于ALCAT1過 表達引起的缺陷。下一個問題是ALCATl過表達和缺陷是否相反地影響MFN2和線粒體融合 過程的其他調節劑的表達。如圖3A所示，與載體對照相比，ALCATl過表達引起C2C12-A1穩 定細胞系中超過70%的MFN2mRNA耗盡和50%的MFNl和OPAlmRNA的減少。相反，ALCATl 缺陷顯著增加MFN2mRNA轉錄，同時從ALCATl敲除小鼠分離的MEF中MFNlmRNA水平顯著 增加（圖3B)。然而，ALCATl缺陷對內線粒體融合所需的OPAl的mRNA表達沒有任何影響。
[0212] 與降低的mRNA水平一致，ALCATl過表達也顯著下調所有三種蛋白的表達。具體 地，與載體對照相比，MFN2顯示顯著減少74. 6%，隨后是MFNl(38.0% )和OPAl(12% )(圖 3C)。相反，MFN2蛋白水平在從ALCATl敲除小鼠分離的MEF中上調超過600% (圖3D，圖 3E中定量）。ALCATl缺陷也顯著增加了最佳線粒體形態和呼吸所需的MFNl和抑制蛋白、線 粒體膜伴侶蛋白的表達。相反，ALCATl缺陷沒有影響OPAl或鈣聯結蛋白、ER駐留蛋白的表 達（圖3E)。
[0213] ALCATl通過MFN2耗盡而損害線粒體融合：ALCATl引起MFN2耗盡和線粒體片段 化的發現促進了對ALCATl調節線粒體融合的作用的考察。線粒體基質靶向EGFP(mtEGFP) 或紅色熒光蛋白（mtRFP)單獨地在C2C12-A1和C2C12-V2細胞中轉染，隨后通過在共聚焦 顯微鏡下測量EGFP和RFP的重疊進行融合分析。如圖4A-4C所示，載體對照C2C12細胞中 的線粒體說明了正常的線粒體融合，如圖4C(圖4D中突出顯示）中合并圖像的黃色所證 明的，其證明了完全融合。相反，C2C12細胞中的ALCATl過表達引起嚴重的融合缺陷（圖 4E-4H)，如通過圖4G(圖4H中突出顯示）中合并圖像的完全分開的綠色和紅色所證明的。 直接支持MFN2缺陷在融合缺陷中的誘發作用，C2C12-A1細胞中MFN2的瞬時表達完全拯救 了融合缺陷，如圖4K(圖4L中突出顯示）中合并圖像的黃色所支持的。MFN2表達還引起 線粒體的超級融合，這得到過表達MFN2的C2C12-A細胞中較厚線粒體管狀網絡的支持（圖 4I-4K)。
[0214] MFN1/2而非OPAl拯救ALCATl引起的線粒體片段化：因為MFN2可以拯救ALCATl 引起的融合缺陷，問題是發動蛋白相關家族的其他成員例如MFNl和OPAl是否也可以通過 恢復C2C12-A1細胞中線粒體網絡而拯救融合缺陷。如上所示，與載體對照（圖5A&5B)相 比，ALCATl過表達引起C2C12-A1細胞中線粒體片段化（圖5C&5D)。相反，C2C12-A1細胞 中MFNl的瞬時表達幾乎完全拯救融合缺陷，如管狀線粒體的恢復所示（圖5E&5F)。再次， MFN2的瞬時表達完全拯救融合缺陷，導致線粒體的超級融合（圖5G&5H)。
[0215]相反，OPAl的瞬時表達未能拯救任何融合缺陷（圖5I&5J)，這與ALCATl缺陷缺乏 對MEF中OPAl表達的任何效應相一致（圖3B&3E)。結果證明，ALCATl介導的融合缺陷限 于其中ALCATl定位的外線粒體膜。
[0216]MFN2拯救ALCATl過表達引起的線粒體呼吸缺陷：接下來考察MFN2表達是否也能 恢復C2C12-A1細胞中的線粒體呼吸功能。ALCATl通過增加線粒體質子漏而引起線粒體功 能障礙。通過分析響應于不同線粒體抑制劑治療的耗氧率（OCR)變化而質問MFN2表達在 C2C12-A1細胞中對質子漏的作用。使用SeahorseExtracellularFlux(XF_24)分析儀，顯 示ALCATl過表達顯著減少線粒體最大容量，如響應于線粒體解偶聯劑FCCP治療而減少的 OCR所指示的（圖6A)。MFN2而非EGFP載體對照的瞬時表達完全恢復線粒體呼吸容量，如 OCR相對于載體對照的恢復所證明的（圖6A)。與復合物I作為ROS生成的主要部位一致， 響應于復合物I(NADHCoQl還原酶）抑制劑魚藤酮的治療，ALCATl過表達顯著增加0CR，提 供了線粒體質子漏的證據。支持MFN2缺陷在氧化應激中的誘發作用，MFN2在C2C12-A1細 胞中的瞬時表達完全正常化OCR(圖6B)。而且，響應于線粒體ATP酶抑制劑寡霉素的治療， ALCATl過表達還顯著增加0CR，進一步指示質子漏。還通過MFN2的瞬時表達完全正常化該 缺陷（圖6D)。相反，響應于復合物III抑制劑抗霉素治療，ALCATl或MFN表達都沒有對來 自復合物III的OCR有任何影響。
[0217]ALCATl關聯氧化應激與線粒體片段化和MFN2缺陷：來自氧化應激的受損線粒體 融合通過開放線粒體通透性轉換孔而引起線粒體膨脹。受損的線粒體通常產生更多R0S，其 進一步惡化線粒體功能障礙，導致惡性循環。因為通過ALCATl的CL重塑引起氧化應激，問 題是ALCATl是否在該惡性循環中起作用，這在從ALCATl敲除和對照小鼠分離的MEF中測 試。如圖7A(圖7C中突出顯示）所示，來自對照小鼠的MEF表現出響應于H2O2治療的嚴重 線粒體膨脹，如通過擴大線粒體和受損嵴所證明的。ALCATl過表達在相對于載體對照表現 出最高的ALCATl表達的C2C12穩定細胞系之一中引起嚴重的線粒體膨脹（圖10)。由于該 極端特征，該C2C12細胞系不用于本研究。相反，ALCATl缺陷完全預防了線粒體膨脹（圖 7B，圖7D中突出顯示）和響應于H2O2治療的分離MEF中的線粒體片段化（圖9A-9D)。
[0218] 支持通過ALCATl的CL重塑作為氧化應激的主因，ALCATl過表達顯著增加 C2C12-A1細胞中的脂質過氧化，其被H202治療劑量依賴性惡化，如脂質過氧化終產物丙二 醛（MDA)升高水平所示（圖7E)。線粒體經歷快速片段化，伴隨ROS生成的增加。接下來 的問題是，ALCATl是否會通過ROS生成引起MFN2缺陷。用如圖7E使用的增加劑量的H2O2 治療C2C12-A1細胞和載體對照，隨后通過western印跡分析來分析MFN2表達。如圖7F所 示，H2O2劑量依賴性地減少載體對照細胞中的MFNl和MFN2表達。所述治療還進一步惡化 ALCATl對MFNl和MFN2消耗的影響，導致C2C12-A1中MFN2表達的完全消失。最后，直接支 持通過ALCATl的氧化應激作為MFN消耗的主因，C2C12-A1細胞與抗氧化劑二亞苯基碘鎗 (DPI)預孵育劑量依賴性地預防響應于與圖7F使用相同的H2O2治療的MFN表達損失（圖 7G)。
[0219] 討論：
[0220] 當線粒體經歷引起參與線粒體區室變得連續的融合事件時形成動態網絡。融合事 件允許每個網絡的組分分享溶質、代謝物和蛋白。因此，此類網絡的分布引起氧化應激和線 粒體片段化，其已經牽涉入衰老和年齡相關疾病的病因學。然而，關于潛在機制知之甚少。 目前的研究考察了ALCATl在調節常與年齡相關疾病有關的氧化應激和線粒體片段化中的 作用。首次證明了ALCATl調節線粒體生物發生和mtDNA保真性的關鍵作用。因此，ALCATl 過表達嚴重損害線粒體融合，導致線粒體片段化和mtDNA消耗。相反，小鼠中ALCATl的靶 向失活顯著增加線粒體質量并預防線粒體ROS誘導的線粒體膨脹和片段化。驚人地，證明 了ALCATl調節mtDNA保真性的作用，這被之前的研究確證，線粒體融合是保證mtDNA保真 性的所需的（ChenH等人·（2010)Cell141(2) :280-289)。
[0221] 支持ALCATl在線粒體融合中的作用，目前研究鑒定MFN2為ALCATl介導的線粒體 功能障礙的下游靶。MFN2是哺乳動物中線粒體融合、與ER栓系、能量代謝和mtDNA保真性 所需的（ChenH等人.（2010)〇611 141(2):280-289,22;(^81^〇0厘&5(3〇1'四11〇1^(2008)· Nature456 :605-610)。ALCATl過表達嚴重減少了C2C12細胞中的MFN2表達，而ALCATl 缺陷顯著增加了從ALCATl敲除小鼠分離的MEF中的MFN2表達。相反，ALCATl缺陷對OPAl 表達沒有任何影響，OPAl表達是內線粒體膜融合所需的。結果提供證據，ALCATl僅影響 ALCATl定位的外線粒體膜的融合（LiJ等人.（2010)CellMetab12(2) :154-165)，這由之 前報道進一步確證，25%CL位于發生活性CL重塑的外膜（GebertN等人.（2009)CurrBiol 19 (24) :2133-2139)。與MFN2作為ALCATl介導的融合缺陷的下游靶一致，小鼠中MFN2的 靶向失活引起多個暗示ALCATl過表達的線粒體缺陷，包括高mtDNA突變率、mtDNA耗竭、片 段化線粒體和線粒體與ER之間栓系的明顯損失。MFN2缺陷還引起骨骼肌萎縮，這與ALCAT1 缺陷顯著增加ALCATl敲除小鼠中骨骼肌質量的發現一致（LiJ等人.（2010)CellMetab 12(2) :154-165,ChenH等人·（2010)Cell141(2) :280-289)。直接支持MFN2 作為ALCATl 的下游祀，ALCATl引起的融合缺陷可以通過MFNl或MFN2而非OPAl的表達來拯救。而且， MFN2表達還恢復了線粒體呼吸容量并預防C2C12細胞中ALCATl過表達引起的質子漏。這些 結果與MFN2缺陷顯著增加質子漏的發現一致（BachD等人·（2003)JBiolChem278(19): 17190-17197)，而MFN2的過表達阻斷高血糖誘導的ROS生成（YuT，Robotham幾，&Yoon Y(2006)ProcNatlAcadSciUSA103(8) :2653-2658)。
[0222] 線粒體分裂/融合機制控制高血糖相關疾患中ROS的急性和慢性生成（Yu T，RobothamJL，&YoonY(2006)ProcNatlAcadSciUSA103(8) :2653-2658)。線粒 體經歷快速片段化，伴隨響應于氧化應激的增加的ROS生成，這可以通過抑制融合過程 的分裂或刺激而減輕。目前的研究鑒定ALCATl為代謝疾病中線粒體融合缺陷和ROS生 成之間丟失的聯系。首先，通過ALCATl的CL重塑顯著增加CL中的DHA含量，導致質子 漏和氧化應激。線粒體膜中的DHA含量與壽命負相關，并且與哺乳動物中的ROS生成和 脂質過氧化指數正相關。因此，CL中增加的DHA含量增加脂質過氧化指數，已經牽涉入 衰老和年齡相關疾病中的線粒體功能障礙（HanX等人.（2007)Biochemistry46(21): 6417-6428；SparagnaGC&LesnefskyEJ(2009)JCardiovascPharmacol53(4) :290-301 ； LeeH-J, (2006)LipidsHealth&Dis. 5:2;ParadiesG等人，（2010)FreeRadicBiolMed 48(10) :1286-1295;ShiY(2010)JBiomedRes24(1) :6-15)。其次，ALCATl過表達引起 C2C12細胞中嚴重的脂質過氧化，這進一步通過氧化應激加劇。最后，直接支持通過ALCATl 的氧化應激作為融合缺陷的主因，ALCATl過表達顯著減少MFN2表達，這可以通過用抗氧化 劑預治療C2C12細胞來減輕。總之，這些發現支持ALCATl通過年齡相關疾病中MFN2耗竭 而聯系ROS生產與線粒體片段化的關鍵作用，如圖7H所示。
[0223] ALCATl在線粒體融合中的調節作用通過最近對MitoPLD(CL代謝中涉及的一種線 粒體PLD)的研究進一步強調（ChoiSY等人.（2006)NatCellBiol8 (11) :1255-1262)。 Mito-PLD定位于線粒體外膜，它在這里催化CL水解產生磷脂酸，線粒體融合所需的一種融 合脂質。驚人地，MitoPLD缺陷引起暗示ALCAT1過表達的線粒體功能障礙,包括受損的融合 和線粒體片段化。然而，潛在機制存在顯著差異。例如，MitoPLD在MFN2下游發揮作用，并 且MitoPLD表達可以拯救MFN缺陷引起的融合缺陷。此外，與ALCAT1相反，MitoPLD過表達 或缺陷不改變MFNl和MFN2蛋白表達水平。而且，MitoPLD過表達引起超級融合，伴隨溫和 CL缺陷。最后,MitoPLD最近已經證明了調節piRNA穩定性和小鼠雄性不育的作用（Huang H等人.（2011)DevCell20(3) :376-387)。本文發現證明，通過ALCATl的CL重塑調節獨 立于磷脂酸生成的線粒體融合。
[0224] 衰老和年齡相關疾病的發作與氧化應激和增加的mtDNA突變率有關，已經提出氧 化應激和增加的mtDNA突變率為衰老和年齡相關疾病的主因。此外，MFN2缺陷已經牽涉入 年齡相關的代謝疾病。重要的是，目前研究已經鑒定了ALCATl在控制mtDNA保真性和MFN2 表達中的重要作用。本文的發現對闡釋衰老和年齡相關疾病發作的潛在分子機制的未來研 究具有重要意義。支持ALCATl在年齡相關疾病發作中的作用，ALCATl表達被氧化應激和 年齡相關的代謝疾病發作所上調。ALCATl的靶向失活預防肥胖及其相關線粒體功能障礙的 發作。因此，可以想象，ALCATl的化學抑制劑的開發將在未來提供對衰老和年齡相關疾病 的潛在治療。
[0225] 實施例2 :通過ALCATl的心磷脂重塑通過對氧化應激和線粒體自噬的作用而調節 心肌病
[0226] 使用具有甲狀腺機能亢進的小鼠作為氧化應激和線粒體功能障礙的嚙齒類動物 模型，本研究考察了ALCATl在與甲狀腺機能亢進相關的心肌病中的作用。結果首次證明， ALCATl在調節經由氧化應激和線粒體自噬的甲狀腺激素誘導的心臟肥大發作中的關鍵作 用。
[0227] 材料和方法
[0228] 試劑：本研究中使用的抗體包括針對以下的多克隆抗體：磷酸 基-AKT(Thr308)、AKT、磷酸基-S6K1 (Thr389)、S6K1、磷酸基-S6 (Ser240/244)、S6、磷酸 基-4E-BPl(Thr37/46)、4E_BPl，其全部購自CellSignalingTechnology(Danvers，MA)。 抗LC3 抗體購自NovusBiologicals，并且抗p62 抗體購自AmericanResearchProducts Inc(Belmont,MA)。PINKl多克隆抗體（AOl)購自Abnova。猴抗兔IgG辣根過氧化物酶軛合 的抗體購自GEHealthcare(Piscataway，NJ)。L-甲狀腺素（T4)和 3, 3'，5-三碘代-L-甲 狀腺原氨酸鈉鹽（T3)來自Sigma。
[0229] H9c2穩定細胞系的產生：H9C2用FLAG標簽化的ALCATl表達載體或作為對照的 空載體穩定轉染。通過G418(lmg/ml)篩選穩定轉染子并在Dulbecco改良的Eagle培養基 (Gibco)中培養，所述培養基補充了 10%熱失活的胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素，37°C下 維持在95 %空氣和5 %CO2中。
[0230] 動物護理：如之前描述產生靶向清除ALCATl基因的小鼠（LiJ等人.（2010)Cell Metab12(2) :154-165)。為了誘導甲狀腺機能亢進心肌病，將雄性ALCATl敲除小鼠年齡匹 配的WT小鼠（8-9周大）分成兩組。一組用0.OlNNaOH和0. 9%NaCl的媒介物中甲狀腺 激素（左旋甲狀腺素，SigmaCAS51-48-9,每天通過i.p.注射lmg/kg體重）治療2天或 4周。小鼠對照組用相同媒介物注射相同持續時間。所有動物維持在環境受控的設施中， 具有每日光循環，并自由獲取水和標準嚙齒類動物食物（HarlandTeklad2018,Madison， Wisconsin)。所有涉及動物的實驗依照根據NIH指南（NIH出版號86-23,1985)批準的機 構動物護理和使用方案進行。
[0231] 回波心臟描記術：在4周的甲狀腺激素治療之后，腹膜內注射戊巴比妥鈉（75μg/ g體重）來輕度麻醉小鼠。使用具有14-MHz線性轉換器的acusonsequoia模型512回波 心臟描記術系統（Siemens，Malvern，PA)進行經胸腔的回波心臟描記術研究。測量以下參 數：舒張末期心室內間隔壁厚度（IVSD)、左心室舒張末期內徑（LVEDD)、舒張末期后壁厚度 (LVPffD)〇
[0232] 定量PCR分析：如之前描述進行定量PCR分析（LiJ等人.（2010)Cell Metabl2 (2) : 154-165)。使用線粒體編碼的NADH脫氫酶I(NDl)作為mtDNA標志物并 使用親環蛋白-A作為基因組標志物，進行載體和ALCATl過表達H9c2細胞中線粒體 拷貝數的分析。用0.1、0.25、0.5禮的!120 2預治療!19(32細胞211，隨后使用冊1(正向： 5，-TGACCCATAGCCATAATATGATTT-3，（SEQIDN0:1)和反向：5，-TTCTACGTTAAACCCTGAT ACTAA-3'（SEQIDNO:2))和親環蛋白-A(正向：5' -ACACGCCATAATGGCACTCC-3'（SEQ IDN0:3))和反向：5'-CAGTCTTGGCAGTGCAGAT-3'（SEQIDN0:4))的引物 對進行RT-PCR分析。使用β-MHC(正向：5'-AGGGCGACCTCAACGAGAT-3'（SEQ IDNO：5),反向：5'-CAGCAGACTCTGGAGGCTCTT-3'（SEQIDNO:6))、BNP(正向： 5，-GCTGCTTTGGGCACAAGATAG-3，（SEQIDN0:7)，反向：5，-GGAGCTCTTCCTACAAC AACTT-3'（SEQIDN0:8))、ANF(正向：5'-GTGTACAGTGCGGTGTCCAA-3'（SEQID NO：9),反向：5'-ACCTCATCTTCTACCGGATC-3'（SEQIDNO:10))、ACTAl(正向： 5' -GTTCGCGCTCTCTCTCCTCA-3'（SEQIDNO:11)，反向：5' -GCAACCACAGCACGATTGTC-3'（SEQ IDN0:12))、膠原蛋白I(正向：5'-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3'（SEQIDN0:13)， 反向：5'-GTTCGGGCTGATGTACCAGT-3'（SEQIDN0:14))、膠原蛋白III(正向： 5' -ACCAAAAGGTGATGCTGGAC-3'（SEQIDNO:15)，反向：5' -GACCTCGTGCTCCAGTTAGC-3'（SEQ IDNO:16))和GAPDH(正向：5' -AATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'（SEQIDNO:17)，反向：5'-GTGG AGTCATACTGGAACATGTAG-3'（SEQIDN0:18))的引物對進行生物標志物的定量PCR分析。
[0233] 脂質過氧化測定：使用TBARS試劑盒（CaymanChemicalCompany,目錄號 10009055)根據生產商說明書，通過測量硫代巴比土酸反應性物質（TBARS)的水平來定量 心室組織和H9c2細胞中脂質過氧化產物。
[0234] 活性氧類（ROS)測量：通過定量測量過氧化氫（H2O2)，直接檢測從線粒體的細胞內 活性氧類（ROS)生成。
[0235] 線粒體的EM分析：使用電子顯微照片評價小鼠心肌細胞中的線粒體超微結構。 在每組三只小鼠的左心室相同部位取心臟樣品以制備載玻片。將心臟左心室片段在含有 0.05%CaClJAO.IM二甲胂酸鈉緩沖液（pH7. 4)中5%戊二醛和4%低聚甲醛中固定24h。 用0.IM二甲胂酸鈉緩沖液洗滌之后，將組織在1%OsO4和0.IM二甲胂酸鹽緩沖液中后固 定過夜，脫水并包埋于Embed812。切片用2%乙酸雙氧鈾、隨后0.4%朽1檬酸鉛染色,并用 Philips400電子顯微鏡觀察。
[0236] 統計分析：數據表示為平均值土SEM。使用雙尾非配對t檢驗進行統計比較以評 價兩種H9c2細胞系之間和ALCATl敲除小鼠與野生型小鼠之間的差異。為了在更多組中比 較，使用單因素方差分析，并且考慮統計學顯著性為P〈〇. 05。
[0237] 結果
[0238] ALCATl調節心臟脂質過氧化和mtDNA生物發生：心臟中的ALCATl表達被氧化應 激和甲狀腺機能亢進心肌病的發作上調。本文研究顯示，ALCATl的異常表達在心肌病發作 中起誘發作用。首先，考察了H9c2心臟細胞系中ALCATl過表達對細胞形態和線粒體功能 的作用。為此，產生了用flag標簽化ALCATlcDNA(ALCATl)或載體對照穩定轉染的H9c2 心臟細胞系。穩定的H9c2細胞系中ALCATl的mRNA表達水平僅三倍于載體對照，其模擬分 離的心肌細胞中氧化應激誘導的內源性ALCATl的上調水平（LiJ等人.（2010)CellMetab 12 (2) : 154-165)。使用者兩種穩定的H9c2細胞系作為基于細胞的模型，首先分析了ALCATl 對脂質過氧化和mtDNA拷貝數的作用。如圖IlA所示，與載體對照相比，ALCATl過表達顯 著增加了脂質過氧化副產物硫代巴比土酸反應性物質（TBARS)的細胞內水平。響應于H2O2 治療進一步加劇了TBARS的產生，證明ALCATl在心肌病中氧化應激中的誘發作用。
[0239] 為了揭示ALCATl對線粒體ROS釋放的直接作用，在表達ALCATl的H9c2細胞系和 載體對照中分析線粒體ROS生成率。在測定開始后的固定時間點，在從H9c2細胞分離的分 離線粒體中分析H2O2生成率。結果顯示，ALCATl過表達使相對ROS釋放率顯著增加3. 77 倍（P〈0. 01)(圖11B)。氧化應激引起mtDNA不穩定，其已經牽涉入年齡相關的代謝疾病中 的線粒體功能障礙。進一步支持ALCATl作為氧化應激的主要來源，響應于增加劑量的H2O2 治療，ALCATl過表達導致H9c2細胞中mtDNA耗竭（圖11C)。此外，ALCATl過表達還引起 H9c2細胞的肥大生長（圖18A)。而且，ALCATl過表達引起H9c2細胞缺陷性分化為心肌細 胞（圖11E&11F)，如缺少肌細胞生成素的表達所證明的，肌細胞生成素是分化的H9c2細胞 的關鍵指不劑（圖18B)。
[0240] 甲狀腺機能亢進引起氧化應激和脂質過氧化。使用ALCATl敲除小鼠，分析了在 與心肌病發作相關的條件下，ALCATl缺陷對心臟脂質過氧化的影響。與報道的甲狀腺機 能亢進對氧化應激的影響一致，甲狀腺機能亢進顯著增加了心臟中脂質過氧化的水平（圖 11D)。相反，ALCATl的靶向失活完全預防響應于甲狀腺機能亢進心肌病發作的心臟脂質過 氧化，進一步證實了ALCATl在與心肌病相關的氧化應激中的誘發作用。
[0241] ALCATl的靶向失活預防甲狀腺機能亢進心肌病的發作：氧化應激和線粒體功能 障礙已經牽涉入心肌病。使用敲除小鼠，接下來考察了ALCATl在甲狀腺機能亢進心肌病發 作中的作用。ALCATl敲除小鼠和WT(WT)小鼠用甲狀腺激素（T4)治療連續2或28天，以 觀察急性和慢性甲狀腺機能亢進對心臟功能、線粒體功能障礙和與心臟肥大相關的信號傳 導途徑的影響。通過在慢性治療末期進行的回波心臟描記術來評估心臟功能。在媒介物組 中，ALCATl敲除小鼠和WT小鼠的心臟形態和回波心臟描記參數沒有顯著區別，所述回波心 臟描記參數包括室間隔缺陷（IVSD)、左室舒張末期內徑（LVEDD)和左室后壁厚度（LVPWD)。 結果證明，ALCATl不是心臟發育或正常心臟功能所需的（圖12A-12E)。然而，WT小鼠在4 周T4治療之后發展了心臟肥大（圖12A)，如心臟重量與體重比率（圖12B)、IVSD(圖12C)、 LVEDD(圖12D)和LVPWD(圖12E)的明顯增加所證明的。相反，ALCATl缺陷預防T4誘導的 心臟肥大及其回波心臟描記參數的相關變化。結果提供證據，上調的ALCATl表達促進甲狀 腺機能亢進誘導的心肌病發作。
[0242] ALCATl的消除減輕心肌細胞的T4誘導的肥大生長：心臟肥大的特征為終末分化 的心臟細胞的尺寸增加，作為對各種生理和病理生理刺激的適應反應。因為ALCATl過表達 引起H9c2細胞的肥大生長，接下來確定ALCATl缺陷是否預防心肌細胞的T4誘導的肥大生 長。如圖13A-13G所示，ALCATl敲除小鼠和WT小鼠在甲狀腺機能正常條件下心肌細胞尺 寸沒有顯著差異。與肥大生長一致，心肌病的發作顯著增加WT小鼠中心肌細胞的尺寸（圖 13B)。相反，與具有甲狀腺機能亢進的WT小鼠相比，ALCATl敲除小鼠中心肌細胞的肥大生 長顯著減弱（圖13D)。這些觀察進一步得到細胞面積（圖13E)、直徑（圖13F)和心肌細 胞尺寸分布（圖13G)的定量分析結果所支持。
[0243] ALCATl缺陷預防T4誘導的心室纖維化：心臟肥大的發展引起心肌的結構重塑，導 致I型和III型膠原蛋白纖維的過度累積。心室纖維化也是心力衰竭和其他心臟并發癥發 展的主要危險因素。為了提供ALCATl作為心肌病調節劑的進一步證據，確定了ALCATl在 調節左心室中I型和III型膠原蛋白沉積的作用。通過來自ALCATl敲除小鼠和WT小鼠的 左心室切片的Masson三色染色來分析心臟纖維化。如圖14B所示，與媒介物對照相比，如 大面積藍色染色所示，用甲狀腺激素治療WT小鼠28天，引起嚴重的心室纖維化，作為心肌 病的后果（圖14A)。相反，ALCATl缺陷顯著減少甲狀腺機能亢進引起的纖維化（圖14D)， 再次暗示ALCATl表達在甲狀腺機能亢進心肌病中心臟功能不全中的作用。與膠原蛋白沉 積的發現一致，甲狀腺機能亢進顯著增加WT小鼠中I型和III型膠原蛋白的mRM表達，但 在ALCATl敲除小鼠中沒有（圖14E&14F)。
[0244] ALCATl消除使與心肌病相關的生物標志物的表達正常化：病理狀態例如甲狀腺 機能亢進引起的持久性肥大最終導致心力衰竭，是工業化國家中主要的死亡原因。升高的 腦利鈉肽（BNP)是指示心力衰竭的特定測試。BNP是響應于心室體積膨脹、壓力過度負荷和 導致的增加的壁張力而特別從心室分泌的心臟神經激素。肥大性心肌病的發作還與胎兒基 因子集的誘導有關，包括心房利鈉因子（ANF)、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC)和骨骼肌α-肌 動蛋白（ACTA1)。為了鑒定ALCATl在心臟肥大進展中的作用，分析了心臟肥大和心力衰竭 的這些標志的RNA表達。持久性甲狀腺機能亢進顯著增加了WT小鼠中所有肥大生物標志 物的RNA表達（圖15A-15D)。盡管甲狀腺機能亢進還增加了ALCATl敲除小鼠中生物標志 物的表達，但是當與對照組比較時減少了該效應。相反，當用媒介物治療時，WT和ALCATl敲 除小鼠的生物標志物表達沒有顯著差異，進一步證實了ALCATl在甲狀腺機能亢進心肌病 病因學中的作用。
[0245] ALCATl的失活通過刺激PINKl表達而預防線粒體膨脹和線粒體自噬：選擇性線粒 體自我吞噬還稱為線粒體自噬，通過消除受損線粒體而有助于保持線粒體質量。線粒體自 噬還通過減少線粒體ROS生成和線粒體DNA突變而在保持線粒體量和質量中發揮重要作 用。因此，自噬的心臟特異性缺陷引起心肌病。使用心室切片的EM分析，確定了ALCATl在 線粒體功能障礙和與甲狀腺機能亢進心肌病相關的自噬中的作用。與甲狀腺機能亢進中嚴 重的氧化應激一致，甲狀腺機能亢進心肌病的發作與WT小鼠中線粒體膨脹、嵴斷裂和線粒 體異常結構相關（圖16A，圖16B中突出顯示）。相反，這些損傷通過ALCATl缺陷而大大減 輕（圖16C，圖16D中突出顯示）。作為對受損線粒體的補償性反應，WT小鼠中自噬體標志 物心臟LC3的表達水平被甲狀腺機能亢進顯著上調（圖16E，圖16F中定量）。而且，與自 噬負相關的P62蛋白的表達在WT小鼠中顯著更低。支持這些觀察，當與ALCATl敲除小鼠 比較時，響應于甲狀腺機能亢進的發作，WT小鼠中自噬線粒體的數目顯著更高（圖20)。
[0246] PTEN誘導的假定激酶I(PINKl)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其通過促進經由線粒 體自噬對受損線粒體的清除而預防細胞應激過程中的線粒體功能障礙。PINKl缺陷引起氧 化應激和線粒體自噬，導致小鼠中的心肌病。進一步支持ALCATl在線粒體功能障礙中的誘 發作用，心臟PINKl表達被ALCATl缺陷顯著上調，這與ALCATl敲除小鼠中氧化應激和線粒 體自噬水平降低一致（圖16E，圖16G中定量）。這些發現提供證據，通過ALCATl的氧化應 激在與甲狀腺機能亢進心肌病相關的線粒體功能障礙和線粒體自噬中起關鍵作用。
[0247] 通過ALCATl的氧化應激調節心肌病中的Akt-mTOR信號轉導途徑：甲狀腺機能亢 進通過刺激心肌細胞中的蛋白合成而導致心肌病。為了鑒定ALCATl在肥大生長中作用的 潛在分子機制，分析ALCATl過表達和缺陷對細胞生長和增殖中涉及的信號轉導途徑的效 應，包括H9c2細胞中和具有甲狀腺機能亢進的小鼠中Akt、Erk、S6K和4E-BP1的磷酸化。增 加的ROS水平導致胰島素抵抗，其在心臟功能不全中發揮誘發作用。如圖17A所示，用胰島 素治療H9c2細胞，劑量依賴地刺激載體對照細胞中Akt和Erk的磷酸化。相反，ALCATl過 表達顯著減少胰島素刺激的Akt磷酸化，同時消除Erk磷酸化，提供了嚴重胰島素抵抗的證 據（圖17A)。而且，通過ALCATl的慢性氧化應激還完全預防H9c2細胞中Akt、S6K和4E-BP 信號傳導通路的T3誘導的激活（圖17B)。與ALCATl過表達引起的H9c2細胞的肥大生長 一致，S6K和4E-BP的基礎磷酸化顯著高于表達ALCATl的H9c2細胞。支持H9c2細胞中的 發現，用甲狀腺激素短期治療小鼠刺激了ALCATl敲除小鼠和WT小鼠中的心臟Akt-mTOR磷 酸化（圖20)。然而，慢性甲狀腺機能亢進引起心肌病發作對Akt-mTOR信號傳導途徑的顯 著下調，如通過顯著更低的Akt和4E-BP的磷酸化所證明的（圖17C)。甲狀腺機能亢進還 下調了Gsk3的磷酸化，Gsk3的缺陷引起心臟病。與缺乏心臟肥大一致，ALCATl缺陷完全預 防了由心臟甲狀腺機能亢進誘導的這些信號傳導蛋白的磷酸化的下調。
[0248] 討論
[0249] CL重塑在調節心臟功能中起重要作用，心臟是具有來自氧化磷酸化的持續高能量 需求的組織。CL的生物功能由其脂肪酰基鏈的結構決定。心臟中，功能性的CL富集亞油 酸，其在支持線粒體酶和蛋白活性中是重要的（ClaypoolSM&KoehlerCM.TrendsBiochem Sci. 2012年1月；37 (I) :32-41)。因此，作為病理性重塑后果的TLCL(心臟的標簽CL)的 缺失已經牽涉入心肌病和心力衰竭的病因學。然而，負責心臟疾病中CL的病理性重塑的酶 還不清楚。ALCATl是催化有害的CL重塑的溶血心磷脂酰基轉移酶，導致心臟病中常見的異 常CL物類的產生（LiJ等人.（2010)CellMetab12(2) :154-165)。在本研究中使用穩定 表達ALCATl的H9c2心臟細胞和具有ALCATl基因的靶向失活的小鼠，研究了ALCATl過表 達和缺陷在甲狀腺機能亢進引起的心肌病發展中的作用。這些結果首次鑒定了ALCATl在 調節肥大性心肌病發作中的關鍵作用。因此，ALCATl的過表達引起H9c2細胞的肥大生長， 而ALCATl的消除預防了T4誘導的心肌病及其相關心臟功能不全的發作，包括心室肥大、心 室纖維化和I型和III型膠原蛋白升高的表達。此外，ALCATl缺陷還正常化肥大生物標志 物的表達，包括ΒΝΡ、β-MHC、ANF和ACTA1，其通常被心肌病的發作上調。支持ALCATl在肥 大性心肌病病因學中潛在的誘發作用，ALCATlmRNA表達被心臟中發作心肌病顯著上調。而 且，通過ALCATl的CL重塑引起TLCL清楚，這已經被鑒定為Barth綜合征中心肌病的主要 原因。
[0250] 甲狀腺機能減退顯著增加已知引起CL過氧化和心力衰竭的氧化應激（Drummond GR等人，（2011)NatRevDrugDiscov10(6) :453-471;LesnefskyEJ等人·（2004)AmJ Physiol-Heart&CirPhysiol287(1) :H258-267)。認為年齡相關疾病中病理性CL重塑通 過CL中DHA含量富集而加劇ROS生成。支持該假設，CL中DHA含量顯著增加脂質過氧化 指數，其已經牽涉入衰老和年齡相關疾病中的線粒體功能障礙。因此，衰老的發作還與心 臟TLCL清除相關，同時伴隨CL中DHA富集。此外，線粒體膜DHA含量與壽命負相關，并且 與ROS生成和脂質過氧化指數正相關。因此，已經鑒定增加的DHA含量和CL過氧化為與 甲狀腺機能亢進、糖尿病、缺血-再灌注損傷和心力衰竭中心臟異常相關的常見缺陷。支持 ALCATl作為T4誘導的心肌病中氧化應激的關鍵調節劑，通過ALCATl的CL重塑增加了CL 中的DHA含量，而ALCATl的靶向清除顯著增加了ALCATl敲除小鼠中TLCL的心臟水平。與 這些發現一致，來自本研究的結果顯示ALCATl的過表達引起H9c2心臟細胞系中嚴重的氧 化應激、脂質過氧化和mtDNA清除，導致受損分化成心臟肌管。直接支持ALCATl作為甲狀 腺機能亢進中氧化應激的主要調節劑，ALCATl表達的消除完全預防甲狀腺機能亢進引起的 心臟脂質過氧化。
[0251] 線粒體自噬靶向防御氧化應激、線粒體功能障礙和衰老。人和嚙齒類動物中，心臟 線粒體自噬被心臟肥大和心力衰竭發作上調。自我吞噬的缺失引起酵母中嚴重的氧化應激 和小鼠心肌病。PINKl是突變時引起帕金森病的線粒體自噬的關鍵調節劑。PINKl還在正 常心臟功能中起重要作用。PINKl通過調節線粒體自噬而促進受損線粒體的清除來防御線 粒體功能障礙和氧化應激。因此，在人心力衰竭末期下調PINKl表達，而小鼠中的PINKl缺 陷引起氧化應激、線粒體自噬和心肌病。進一步支持ALCATl在心肌病發病中的誘發作用， 本研究鑒定了ALCATl作為心臟中線粒體自噬和PINKl表達的關鍵調節劑。證明，心肌病發 作顯著增加了線粒體自噬線粒體數目，這得到自我吞噬生物標志物的變化所支持，包括LC3 和P62蛋白的表達。相反，ALCATl的消除預防線粒體與甲狀腺機能亢進心肌病相關的氧化 應激。ALCATl缺陷也顯著下調LC3的表達，同時伴隨p62蛋白增加的表達。驚人地，ALCATl 缺陷顯著增加了PINKl的表達，這與PINKl抗氧化應激和心肌病的保護作用一致。這些發 現進一步得到小鼠中升高的線粒體自噬水平和心肌病的支持，靶向清除TAZ基因，TAZ基因 的突變引起Barth綜合征中的TLCL缺陷。
[0252] 心肌病的發作通過激活Akt-mTOR和Erk途徑而刺激心肌細胞的蛋白合成。Akt信 號傳導途徑的激活預防細胞免受氧化應激誘導的細胞凋亡，而mTOR激活是心肌細胞肥大 生長所需的。然而，慢性甲狀腺機能亢進引起心力衰竭晚期ErKAkt和mTOR途徑的顯著 下調。因此，用雷帕霉素治療預防T4誘導的心肌病的發作，而小鼠中mTOR的靶向失活導致 特征為細胞凋亡、線粒體自噬和線粒體膨脹的嚴重擴張性心肌病。支持ALCATl在心肌病中 氧化應激中的作用，在過表達ALCATl的H9c2細胞中和具有甲狀腺機能亢進的小鼠中發現 慢性氧化應激顯著損害了T4誘導的Akt和下游信號傳導組分例如GSK-3β、mTOR和S6激 酶的磷酸化。H9c2細胞中通過ALCATl的氧化應激還引起了嚴重的胰島素抵抗，其在心肌 病中起主要作用。相反，ALCATl的消除預防了心肌病發作并恢復了ALCATl敲除小鼠中的 Akt-mTOR信號傳導途徑。
[0253] 重要的是，本發現對揭示其他形式心血管疾病例如糖尿病性心肌病、缺血性再灌 注和心力衰竭的原因的潛在分子機制的進一步研究具有額外意義，因為氧化應激和病理性 CL重塑已經牽涉入這些病理狀態的病因學。支持該假設，ALCATl通過氧化應激和糖尿病和 肥胖的發作上調。ALCATl的靶向失活預防線粒體功能障礙和肥胖發作，其是2型糖尿病和 心血管疾病的主要誘發因素。ALCATl的抑制劑的開發將提供對發達國家主要的死亡原因心 臟肥大和其他心臟疾病的潛在治療。
[0254] 本公開的摘要允許讀者快速確定本技術公開的性質。要理解，其不是用于解釋或 限制以下權利要求的范圍或含義。
【權利要求】
1. 一種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑 的方法，包括： 使生物樣品與測試劑接觸； 測量所述生物樣品中線粒體融合蛋白分子的表達、功能或活性；從而， 鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)的調節劑。
2. 權利要求1所述的方法，其中如果測試劑與基線對照相比增加所述線粒體融合蛋白 分子的表達、功能或活性，則鑒定所述測試劑為ALCAT1表達、功能或活性的抑制劑。
3. 權利要求1所述的方法，其中ALCAT1表達、功能或活性與正常基線對照相比明顯減 少。
4. 權利要求1所述的方法，其中所述線粒體融合蛋白是MFN2。
5. 權利要求1所述的方法，其中生物樣品包括：流體、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、細 胞、組織或其組合。
6. 權利要求1所述的方法，其中測量MFN2表達、功能或活性的測定包括：免疫測定、 生物測定、生物芯片測定、印跡、雜交測定、基于細胞的測定、高通量篩選測定、色譜、化學測 定、噬菌體展示測定或其組合。
7. -種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑 的方法，包括： 使生物樣品與測試劑接觸； 測量（a)包括ΒΝΡ、β -MHC、ANF或ACTA1的指示心肌病的肥大標志物的表達；(b)PTEN 誘導的假定激酶l(PINKl)的表達、功能或活性；從而， 鑒定ALCAT1調節劑。
8. 權利要求7所述的方法，其中如果所述測試劑與基線對照相比減少指示心肌病的肥 大標志物的表達，則鑒定ALCAT1表達、功能或活性的抑制劑。
9. 權利要求7所述的方法，其中如果所述測試劑與基線對照相比增加 PTEN誘導的假定 激酶1 (PINK1)的表達、功能或活性，則鑒定ALCAT1表達、功能或活性的抑制劑。
10. 權利要求8或9所述的方法，其中ALCAT1表達、功能或活性與正常基線對照相比明 顯減少。
11. 權利要求7所述的方法，其中測量指示心肌病的肥大標志物的表達的測定包括： 免疫測定、生物測定、生物芯片測定、印跡、雜交測定、基于細胞的測定、高通量篩選測定、色 譜、化學測定、噬菌體展示測定或其組合。
12. 權利要求7所述的方法，其中生物樣品包括：流體、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、 細胞、組織或其組合。
13. -種在體外或體內預防或治療線粒體功能障礙的方法，包括：給細胞或患者施用 治療有效量的調節溶血心磷脂酰基轉移酶的表達、功能、活性或其組合的藥劑；從而，在體 外或體內預防或治療線粒體功能障礙。
14. 權利要求13所述的方法，其中所述溶血心磷脂酰基轉移酶是脂酰輔酶A溶血心磷 脂酰基轉移酶1 (ALCAT1)。
15. 權利要求14所述的方法，其中ALCAT1調節：線粒體多核苷酸線粒體多肽、線粒體 蛋白、mtDNA拷貝數；線粒體質量；線粒體形態；線粒體融合和mtDNA突變率。
16. 權利要求15所述的方法，其中所述線粒體蛋白包括：線粒體融合蛋白、線粒體融合 蛋白-1 (MFN1)、線粒體融合蛋白-2(MFN2)、抑制蛋白、肽、片段、變體、突變體或其組合。
17. 權利要求16所述的方法，其中線粒體融合蛋白任選與通過權利要求1或7所述的 方法鑒定的一種或多種ALCAT1抑制劑一起施用。
18. 權利要求17所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑與基線對照相比增加 MFN2的表達、 功能或活性。
19. 權利要求17所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑與正常基線對照相比減少如通過活 性氧類（ROS)測量的氧化應激。
20. 權利要求17所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑調節心磷脂（CL)結構、功能、活性、 表達或其組合。
21. 權利要求17所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑預防或治療與線粒體功能障礙相關 的疾病或疾患。
22. 權利要求21所述的方法，其中與線粒體功能障礙相關的疾病或疾患包括：糖尿病、 肥胖、心臟疾病或疾患、勃起功能障礙、絕經、神經退行性疾病或疾患、代謝疾病或疾患。
23. -種在體外或體內預防或治療線粒體功能障礙的方法，包括：給細胞或患者施用 治療有效量的線粒體融合蛋白分子；從而，在體外或體內預防或治療線粒體功能障礙。
24. 權利要求23所述的方法，其中線粒體融合蛋白分子包括：線粒體融合蛋 白-1 (MFN1)、線粒體融合蛋白-2(MFN2)、片段、變體、突變體或其組合。
25. 權利要求23所述的方法，其中脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)的抑 制劑任選施用給細胞或患者。
26. 權利要求25所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑通過權利要求1或7所述的方法鑒 定。
27. 權利要求26所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑與基線對照相比增加 MFN2的表達、 功能或活性。
28. 權利要求26所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑與正常基線對照相比減少如通過活 性氧類（ROS)測量的氧化應激。
29. 權利要求26所述的方法，其中ALCAT1的抑制劑調節心磷脂（CL)結構、功能、活性、 表達或其組合。
30. -種治療罹患心肌病或處于心肌病風險的患者的方法，包括：給有相應需要的患 者施用治療有效量的脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)的抑制劑；從而， 治療罹患心肌病的患者。
31. 權利要求30所述的方法，其中脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)的抑 制劑通過權利要求1或7所述的方法鑒定。
32. 權利要求30所述的方法，其中PTEN誘導的假定激酶l(PINKl)的調節劑任選施用 給患者。
33. -種通過權利要求1或7所述的方法鑒定的脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶 l(ALCATl)的抑制劑。
34. -種藥物組合物，包括通過權利要求1或7所述的方法鑒定的脂酰輔酶A溶血心磷 脂酰基轉移酶l(ALCATl)的抑制劑。
35. -種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑 的方法，包括： 使生物樣品與測試劑接觸； 測量所述生物樣品中ALCAT1分子的表達、功能或活性；從而， 鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)的調節劑。
36. 權利要求35所述的方法，其中如果測試劑與基線對照相比增加了所述ALCAT1分子 的表達、功能或活性，則鑒定所述測試劑為ALCAT1表達、功能或活性的抑制劑。
37. 權利要求35所述的方法，其中ALCAT1表達、功能或活性與正常基線對照相比明顯 減少。
38. 權利要求37所述的方法，其中ALCAT1分子包括：核酸、寡核苷酸、多核苷酸、基因、 氨基酸、肽、多肽、蛋白、變體、片段、突變體或其組合。
39. 權利要求35所述的方法，其中生物樣品包括：流體、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、 細胞、組織或其組合。
40. 權利要求35所述的方法，其中測量ALCAT1表達、功能或活性的測定包括：免疫測 定、生物測定、生物芯片測定、印跡、雜交測定、基于細胞的測定、高通量篩選測定、色譜、化 學測定、噬菌體展示測定或其組合。
41. 一種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑 的方法，包括： 使生物樣品與測試劑接觸； 測量包括FAS、TNF、TGF-β、DGAT1、CHREBP1或SREBP1的指示糖尿病性腎病的核酸標 志物或其編碼產物的表達；從而， 鑒定ALCAT1調節劑。
42. 權利要求41所述的方法，其中如果所述測試劑與基線對照相比調節FAS、TNF、 TGF-β、DGAT1和SREBP1的表達，則鑒定ALCAT1表達、功能或活性的抑制劑。
43. 權利要求41所述的方法，其中測量指示糖尿病性腎病的標志物表達的測定包括： 免疫測定、生物測定、生物芯片測定、印跡、雜交測定、基于細胞的測定、高通量篩選測定、色 譜、化學測定、噬菌體展示測定或其組合。
44. 權利要求41所述的方法，其中生物樣品包括：流體、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、 細胞、組織或其組合。
45. -種鑒定脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑 的方法，包括： 使生物樣品與測試劑接觸； 測量包括PPARa、Srebplc、FAS、ACCl、DGATl或CPT1 α的指示脂肪肝疾病的核酸標志 物或其編碼產物的表達；從而， 鑒定ALCAT1調節劑。
46. 權利要求45所述的方法，其中如果所述測試劑與基線對照相比調節PPARa、 Srebplc、FAS、ACC1、DGAT1或CPT1 a的表達，則鑒定ALCAT1表達、功能或活性的抑制劑。
47. 權利要求45所述的方法，其中ALCAT1表達、功能或活性與正常基線對照相比明顯 減少。
48. 權利要求45所述的方法，其中測量指示脂肪肝疾病的標志物表達的測定包括：免 疫測定、生物測定、生物芯片測定、印跡、雜交測定、基于細胞的測定、高通量篩選測定、色 譜、化學測定、噬菌體展示測定或其組合。
49. 權利要求45所述的方法，其中生物樣品包括：流體、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、 細胞、組織或其組合。
50. -種通過權利要求41或45所述的方法鑒定的脂酰輔酶A溶血心磷脂酰基轉移酶 l(ALCATl)表達、功能或活性的調節劑。
51. -種藥物組合物，包括通過權利要求41或45所述的方法鑒定的脂酰輔酶A溶血心 磷脂酰基轉移酶l(ALCATl)的抑制劑。
【文檔編號】A61K38/00GK104302304SQ201380009571
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年2月15日 優先權日:2012年2月16日
【發明者】玉光·施 申請人:賓西法利亞州研究基金會