專利名稱：一種具有抗皰疹病毒活性的木豆提取物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗病毒活性的木豆乙醇提取物。
背景技術：
木豆(Cajanus cajan)原產于印度，目前全世界種植面積約520萬公頃，主要分布在亞洲、非洲和南美洲(趙真忠，2003)。我國栽培木豆主要分布于熱帶、亞熱帶地區，即云南、廣西、四川、重慶、廣東、貴州、海南、福建、湖南、江西、江蘇等省區(谷勇等，2000)。
木豆全身是寶，經濟、生態價值極高，同時還具有多種顯著的藥用和保健功效。木豆的藥用價值是在我國最早開發利用的，早在《陸川本草》中記載木豆葉“平、淡、有小毒”?！吨腥A藥?！分羞M一步指出木豆葉主治小兒水痘，痛腫。近年來，我國研究木豆中提取、分離有關藥用成分的報道較少，主要有中國醫學科學院藥用植物開發研究所(年度)曾研究木豆葉中的抗消炎成分，得出11種結晶成分(李正紅等，2001)，鑒定為牡荊苷、水楊酸、三十一烷、β-谷甾醇、柚皮素-4′，7-二甲醚及β-香樹脂醇等。此外，林勵(年度)等以抑菌試驗指導植物有效成分的提取分離，從海南產木豆葉提取物萃取的乙酸乙酯部分分離和鑒定了6個化合物，牡荊苷，異牡荊苷，芹菜素，木犀草素，柚皮素-4′，7-二甲醚和β-谷甾醇，在這些已知的成分中，具有較高藥理活性的植物黃酮類化合物占絕大多數。
近年來對木豆的藥理活性方面也有一些研究報道，主要是中藥木豆葉對治療股骨頭缺血性壞死有神奇功效。海南省人民醫院根據民間經驗，用木豆治療外傷、燒傷感染和褥瘡等已經取得了較好的療效(劉中秋等，1998)。孫紹美等(1995)研究木豆葉有效成分木豆素的藥理作用表明木豆素制劑具有明顯的抑制毛細血管的通透性、鎮痛、消炎作用，毒性小，在有效劑量范圍內動物無不良反應，且其抗炎作用強于水楊酸。劉中秋(1998)等在證實木豆的抗菌消炎作用的基礎上，以抗炎等藥效學為指標，對生脈成骨片中的主藥——木豆葉的不同提取物進行篩選，分別用醇提取物、水提取物進行小鼠抗炎作用的藥理研究，結果表明，木豆葉水提部分的抗炎作用最強，驗證了民間利用木豆葉水煎劑可解毒消腫的功效。雖然關于木豆有效成分的提取和分離工藝有待進一步研究，但是可以肯定的是植物黃酮類化合物在其發揮藥理藥效活性過程中起了至關重要的作用。
病毒是最小的病原微生物，但病毒的傳播最廣，是目前世界上發病率最高的傳染性疾病之一。在臨床上較多的疾病與病毒感染有關。據國外統計資料報道，近3/4的傳染病是由病毒引起的，不同的病毒感染引起不同的疾患，需要針對該病毒的抗病毒藥物治療。
皰疹是由皰疹病毒引起的感染性皮膚病，表現為疼痛或淺感覺障礙，是臨床常見病多發病之一，好發于春秋季節。帶狀皰疹的臨床癥狀雖不是很嚴重，但有時可引起嚴重的并發癥，且帶狀皰疹患者因有刺樣痛或燒灼痛，而出現緊張、恐懼，心情煩躁、焦慮，常常影響工作和睡眠，因此危害較大。(尚小紅，2005；伍偉禎，2004)皰疹病毒分為單純皰疹、帶狀皰疹、巨細胞病毒和E-B病毒，該類病毒在人體中可形成潛伏感染，引起不同組織疾病，在一定的環境下反復發作。
單純皰疹病毒(HSV)分為HSV-1型和HSV-2，近年來進行的深入研究后又發現HSV-6，7，8型。HSV感染是一種全身性疾病，病毒經呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進入人體，可潛于人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺神經節和多數器官內，幾乎所有的內臟和粘膜表皮內都可分離到HSV。原發感染主要見于免疫功能低下嬰幼兒或嚴重營養不良或有其它感染的兒童。原發感染消退后，病毒可持續潛居體內。正常人中約有半數以上為本病毒的攜帶者，可通過口、鼻分泌物而成為傳染源，由于HSV在人體中不產生永久免疫力，故每當機體抗病能力減退時，如患某種發熱性傳染病，胃腸功能紊亂、月經、妊娠、病灶感染、過度疲勞、情緒環境改變時，體內潛伏的HSV即被激發而發病。因而，尋求新的抗皰疹病毒藥物成為當務之急。
抗病毒類藥物是近年來發展起來的一大類藥物，現已成為國內外醫藥市場上令人矚目的活躍藥品之一。從1975年發現阿糖腺苷，特別是1977年阿昔洛韋(ACV，無環鳥苷)問世后，抗病毒藥物才真正起步，盡管如此，目前上市的該類藥物只有20余種，僅為抗感染藥物的十四分之一左右，且大多有一定的毒副作用或抗病毒效果不明顯，難以為病人所認可。
參考文獻趙真忠.一種很有發展潛力的熱帶亞熱帶植物——木豆.福建熱作科技，2003，28(3)31～32谷勇，周榕，鄒恒芳等.木豆栽培技術與綜合利用.西南林學院學報，2000，20(4)213～217李正紅，周朝鴻，谷勇，張建云.中國木豆研究現狀及開發前景.林業科學研究，2001，14(6)647～681劉中秋，周華，林勵，廖慧芳，周莉玲.生脈成骨片中木豆葉提取工藝研究.中成藥.1998，20(3)7～9孫紹美，宋玉梅，劉儉等.木豆素制劑藥理作用研究.中草藥，1995，26(3)147～148劉中秋，周華，林勵，廖慧芳，周莉玲.生脈成骨片中木豆葉提取工藝研究.中成藥.1998，20(3)7～9尚小紅.針灸治療帶狀皰疹概況.2005，25(2)82～84伍偉禎.不同抗病毒藥物治療帶狀皰疹的成本-效果分析.國際醫藥衛生導報，2004，10(16)181～182發明內容本發明以木豆莖葉的乙醇提取物為實驗材料，首次經實驗證實其具有顯著的抗皰疹病毒活性，從而為開發這一新的抗病毒新藥奠定了化學和生物學基礎，并可直接用于開發抗病毒新藥。


圖1為木豆提取物制備的工藝流程圖。LC/MS/MS分析結果表明，該提取物主成分的分子量為200-600，與標準品相對照，確定主要成份為牡荊苷、異牡荊苷、木犀草素、芹菜素、山萘酚、異鼠李素，見附圖2-7。圖2為木豆樣品總離子流圖；圖3為牡荊苷質譜圖(其中431.0為它的分子離子峰)；圖4為異牡荊苷質譜圖(其中431.5為它的分子離子峰)；圖5為木犀草素的質譜圖(其中284.7為它的分子離子峰)；圖6為芹菜素的質譜圖(其中269.2為它的分子離子峰)；圖7為山萘酚的質譜圖(其中286.3為它的分子離子峰)；圖8為異鼠李素的質譜圖(其中315.2為它的分子離子峰)；圖9為木豆提取物體外抗病毒活性效果及模式分析圖。
具體實施例方式
實施例1木豆提取物的制備木豆提取物通過下列步驟得到(見流程圖1)將采收的木豆莖葉陰干，粉碎后加入10倍量的65～80％乙醇，加熱回流2～5h，提取物通過濾紙過濾，上清液經0.22μm濾膜過濾除菌，按實驗要求進行適當稀釋。
實施例2木豆提取物細胞毒分析1.細胞培養RC-37(非洲綠猴腎細胞)在含有5％胎牛血清和均為100mg/ml青霉素與鏈霉素的DMEM單層培養基中生長。細胞融合時傳代。細胞置24孔和6孔板上分別進行細胞毒和抗病毒分析。
2.病毒
HSV-1病毒株由德國海德堡大學藥學與分子技術學院(IPMB)提供。當RC-37細胞長成單層后接種病毒，將病毒按滴度稀釋后加入培養瓶中，放入CO2培養箱中培養，當細胞病變達到90％以上時，放入-20度冰箱內。反復凍融3次后合并。
3.細胞毒分析(1)將細胞置24孔板上，密度為每孔5*104，37℃培養24h。
(2)移去培養基，加入新鮮的含有適當稀釋度的木豆乙醇提取物，每濃度10個重復。含1％乙醇而無藥物的1ml培養基作為對照。
(3)4d培養后，移去培養基，中性紅方法分析。培養基用含40mg/ml的中性紅的DMEM代替，37℃培養3h。
(4)移去培養基，用含有0.5％甲醛的1％CaCl2中洗1min。
(5)之后細胞在含有1％乙酸的50％乙醇中溶解，在混合器中培養5min，這樣與細胞結合的中性紅洗提出。
(6)540nm處測OD，測定吸收的中性紅；對照組為100％。
實驗結果表明，木豆乙醇提取物的最大無毒濃度為48μg/ml。
實施例3木豆提取物體外抗病毒活性效果1.直接蝕斑分析(1)2*103PFU與不同濃度的木豆醇提物在室溫下培養1h。
(2)經處理的系列稀釋的病毒的37℃下吸附細胞1h。
(3)棄去殘余接種體，感染細胞用含有0.5％甲基纖維素的培養基覆蓋，6個重復，37℃培養4d。
(4)單層細胞用10％福爾馬林固定。
(5)移走固定液，用1％結晶紫染色，幾分鐘后，移走結晶紫，水洗一次。查蝕斑數，未處理的細胞為對照。
2.抗病毒模式為了確定抗病毒的模式，分為以下四組(1)預處理病毒用木豆提取物預處理病毒，二者室溫下孵育1h，加入到6孔板上，37℃培養1h后，加入覆蓋培養基，在培養箱中培養4d。
(2)吸附病毒在感染前木豆提取物與病毒共同孵育，并立即加入到6孔板上，37℃培養1h后，加入覆蓋培養基，在培養箱中培養4d。
(3)病毒復制將病毒直接加到6孔板上，37℃培養1h后，同時加入覆蓋培養基和提取物，在培養箱中培養4d。
(4)預處理細胞在病毒感染前用木豆提取物預處理細胞，37℃培養1h后，加入病毒，37℃培養1h后，加入覆蓋培養基，在培養箱中培養4d。
實驗結果表明，用木豆提取物預處理HSV-1病毒，抑制率可達100％，高于文獻報導；對于吸附階段、復制階段和用藥物預處理細胞的抑制率分別為43％、9％和8％。所以，木豆提取物對HSV-1病毒有明顯的抑制作用，有望成為一種治療帶狀皰疹的新藥。
本發明的組合物可與藥學上可接受的載體或溶劑給藥，可通過口服、全身或局部給藥。組合物的形式可為液體制劑、固體制劑形式給藥；對于局部給藥來說，該組合物可以在固體支持物如紗布或海綿上給藥，也可以制備成軟膏、栓劑或噴劑來局部使用。該組合物還可以以飲料、食品或添加劑的形式服用。
權利要求
1.一種具有抗病毒活性的木豆乙醇提取物。該提取物由65％～80％乙醇加熱回流2～5h制得。
2.權利要求1所述的乙醇提取物，其主要成分為分子量200-600之間的牡荊苷、異牡荊苷、木犀草素、芹菜素、山萘酚、異鼠李素。
3.權利要求2所述的乙醇提取物作為活性劑可與藥學上可接受的載體形成組合物。
4.權利要求3所述的藥物學上可接受的載體，包括本領域常規使用的溶劑、各種賦形劑、解崩劑等。
5.權利要求3所述的組合物為膠囊、片劑、丸劑、注射液、口服液、沖劑、糖漿、粉劑、顆粒劑、栓劑、軟膏、噴劑、飲料、食品或添加劑等形式。
6.施用抑制病毒有效劑量的權利要求3的組合物可以治療由皰疹病毒引起的病毒感染。
全文摘要
本發明提供了一種具有抗皰疹病毒活性的木豆乙醇提取物，主要成分為具有較高藥理活性的黃酮類化合物，LC/MS/MS測得該提取物主成分的分子量為200－600。該提取物抗皰疹病毒效果明顯，是一種開發前景廣闊的病毒抑制劑。
文檔編號A61P31/22GK1739597SQ20051001017
公開日2006年3月1日 申請日期2005年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者祖元剛, 付玉杰, 王微, 李慶勇, 候春蓮, 張琳, 張瑩, 陳麗艷, 劉威 申請人:東北林業大學, 祖元剛