專利名稱：人工植入體的抗凝血表面修飾方法
技術領域：
本發明屬于抗凝血材料技術領域，涉及一種用硅橡膠涂層作軟支撐共價鍵合多層肝素薄膜修飾人工植入體使其表面具有抗凝血性能的方法。
背景技術：
在小口徑動脈血管重建手術中，對動脈假體的血液相容性要求非常高。為了保證術后的長期通暢性，通常要使用自體隱靜脈作為動脈假體。但是，當患者無法提供自體隱靜脈時，就必須采用人工血管來替代。盡管膨體聚四氟乙烯已成功地應用于較大直徑血管的制造，但對于直徑小于6mm的血管，由于血液凝結或組織堵塞的原因，這些材料無能為力。雖然在經過不斷的改進和修飾后，長期通暢率有一定的提高，但與自體隱靜脈相比仍不能獲得滿意的效果，血液相容性問題還遠未解決，給動脈搭橋手術帶來一系列問題。小口徑動脈假體不僅應具備充分的柔韌性以利于其與動脈血管之間的吻合，還應具備優良的血液相容性，不會引起凝血反應，以保持長期的通暢性。
因為只有人工血管的表面與血液接觸，所以目前的工作主要集中在對現有材料表面修飾與改性上，以達到血管植入的要求。通過將肝素分子固定在人工血管的表面上來提高其抗凝血性能的方法一直是研究的熱點。早期的研究人員使用4價銨離子來鍵合肝素，然后通過長的烷基鏈使離子與聚合物基體絡合。離子鍵合的肝素從表面緩慢溶解下來與抗凝血酶-III(AT-III)在表面附近粘結在一起形成活的抗凝血劑。這種方法適用于短期血液導管，但由于溶解作用，肝素很快耗盡，因此對長期血液導管和人工血管無效。第二種方法是將肝素通過共價鍵直接連接于基體表面。雖然對于固定化肝素的穩定性而言，通過共價鍵結合的遠較離子鍵合的高，但就固定化肝素的抗凝血性能來說，一般卻正好相反。因為硬連接的肝素不僅降低了人工血管的彈性而且不能與抗凝血酶很好的配合。因此，如何提高共價鍵合肝素的抗凝血性，同時又不影響材料的本體性能，一直是生物材料肝素化研究的主要內容。研究表明如果使肝素分子與聚合物表面保持一定距離將提高抗凝血性能。此外，為了使固定肝素具有較高的抗凝血性，除了減少固定化對肝素生物活性的影響外，還應該提高材料表面固定化肝素的濃度。
肝素本身具有強的負電荷、親水性和較多的活性官能團。但是，構成人工血管的聚四氟乙烯等聚合物具有很強的化學惰性和疏水性，不能與肝素分子直接反應。因此，共價結合法的主要步驟是對聚合物材料表面進行化學預處理，使其具有和肝素的反應能力，然后再鍵合肝素分子。目前雖然存在多種對人工血管預處理的方法，但均存在所需儀器設備昂貴、對材料本體結構有影響、操作工藝復雜等問題，難以廣泛使用。
硅橡膠具有優良的彈性、柔軟性、耐高熱性和耐老化性，可高壓蒸氣消毒；與人體組織及血液相容，是涂覆人工血管的理想材料。硅橡膠雖有一定的抗凝作用，但其仍難以滿足臨床要求，必須在硅橡膠涂層的表面上進一步固定肝素分子以提高其抗凝血性能。但是，硅橡膠與構成人工血管的材料一樣，具有很強的化學惰性和疏水性，不能與肝素分子直接反應。
Nafion(全氟磺酸)具有很高的穩定性和生物惰性，因而具有很好的生物相容性。由于Nafion具有與Teflon(特氟龍)相似的疏水氟碳骨干分子結構，使Nafion與硅橡膠之間具有強的疏水作用，有利于在硅橡膠的表面形成Nafion涂層。Nafion吊鏈上的親水的磺酸基可為進一步固定肝素分子提供活性基團。
近十年來靜電吸引層層自組裝技術受到國內外廣泛重視，其基本方法和原理是通過聚陽離子和聚陰離子的靜電引力作用在基底表面交替吸附聚陰離子和聚陽離子的多層聚合物分子膜。該技術不僅可方便地在分子水平上控制膜的組成及結構，而且可以在納米尺度上控制膜的厚度。但該方法的不足之處在于離子鍵合的分子膜在極性溶劑中的穩定性差。

發明內容
本發明的目的在于針對硬連接的肝素降低人工血管的柔韌性且抗凝血性能不夠好、共價鍵合的單分子層肝素濃度太低、而靜電吸引層層自組裝技術存在離子鍵合的分子膜在極性溶劑中的穩定性差的缺點，提供一種人工植入體的抗凝血表面修飾方法，該方法以硅橡膠涂層作軟支撐組裝重氮樹脂和肝素多層膜，既充分利用了層狀靜電組裝的簡單性這一特點，又結合了重氮基團與硫酸基團在膜內的光化學反應，使膜內的離子鍵轉變成共價鍵，從而使肝素多層膜的穩定性大大提高。本發明是這樣實現的a、將人工植入體浸泡在有機溶劑中，超聲清洗30～120分鐘，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小時；b、將醫用硅橡膠作為常溫固化粘合劑，使其溶解在有機溶劑中，制備硅橡膠溶液；c、在人工植入體的內表面上涂覆醫用硅橡膠作為軟支撐；d、在硅橡膠涂層的表面上涂覆全氟磺酸；e、將帶正電荷的聚陽離子和帶負電荷的聚陰離子通過靜電吸引作用交替沉積到全氟磺酸涂層的表面上；f、利用紫外光照射人工植入體內壁，通過光化學反應使膜內層間的離子鍵轉變成共價鍵，得到抗凝血表面超薄膜。
本發明的方法具有以下優點(1)不需要對人工植入體進行化學預處理，既經濟又可避免由于預處理對材料本體性能造成的損害。
(2)在人工植入體的表面涂覆硅橡膠不僅增加了人工植入體的柔韌性，而且為人工植入體肝素化提供了軟支撐，使肝素分子與人工植入體表面有一定距離，從而提高其抗凝血性能，克服了在傳統肝素化方法中將肝素硬連接到材料的表面使抗凝血性能降低的缺點。
(3)不僅可方便地在分子水平上控制膜的組成及結構，而且可以在納米尺度上控制共價鍵合的膜的厚度。可以根據需要通過增加肝素的層數提高表面固定化肝素的濃度，克服了傳統的單層肝素固化方法中存在肝素濃度過低、由于溶解或生物降解而消耗過快的缺點。
(4)原位光化學反應使得層間的離子鍵轉變為共價鍵，避免了由于肝素分子從人工植入體表面釋放之后留下帶正電荷的表面而引起的血小板的吸附和聚集。
(5)膜內層與層間是共價鍵連接的，克服了用傳統靜電自組裝制備的離子鍵合膜性能不夠穩定等缺點。
(6)本發明工藝簡單，反應條件溫和，易操作，重現性好，環境友好，適用于多種復雜體型的材料表面、生物醫用裝置和多孔組織工程支架材料及其宏觀制品的抗凝血表面修飾，具有良好的應用前景。


圖1為組裝在預先涂覆了硅橡膠和Nafion的石英玻璃片上的多層膜(DR/Hep)n(n＝1，2，3，4，5)的吸收光譜隨DR/Hep雙層數目的變化關系圖，圖2為組裝在預先涂覆了硅橡膠和Nafion的石英玻璃片上的(DR/Hep)5多層膜的吸收光譜隨紫外光照射時間的變化關系圖，圖3為肝素化人工血管的抗凝血活性變化關系圖，圖4為人工血管上光化學交聯后多層肝素薄膜對凝血酶失活的影響隨DR/Hep雙層數目的變化關系圖，圖5為人工血管上光化學交聯后的(DR/Hep)5和(DR/Hep)10多層肝素薄膜對凝血酶失活的影響關系變化圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式是這樣實現的a、將人工植入體浸泡在有機溶劑中，超聲清洗30～120分鐘，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小時；b、將醫用硅橡膠作為常溫固化粘合劑，使其溶解在有機溶劑中，制備硅橡膠溶液；c、在人工植入體的內表面上涂覆醫用硅橡膠作為軟支撐；d、在硅橡膠涂層的表面上涂覆全氟磺酸；e、將帶正電荷的聚陽離子和帶負電荷的聚陰離子通過靜電吸引作用交替沉積到全氟磺酸涂層的表面上；f、利用紫外光照射人工植入體內壁，通過光化學反應使膜內層間的離子鍵轉變成共價鍵，得到抗凝血表面超薄膜。
本實施方式中，清洗人工植入體用的有機溶劑為無水乙醇、丙酮或者它們的混合物。
本實施方式中，用于溶解硅橡膠的有機溶劑為烷烴溶劑(正己烷或其它烷烴溶劑)。
本實施方式中，人工植入體可以是包括膨體聚四氟乙烯在內的各種材料制成的各種口徑的人工血管，也可以是各種材料制成的各種口徑的血導管、聚合物膜或多孔支架，以及用玻璃、陶瓷、硅、各種金屬或各種聚合物等材料制成的各種形狀的生物醫學裝置。
本實施方式中，聚陰離子可選用肝素、硫酸肝素、海藻素鈉、聚苯乙烯磺酸鈉、硫酸葡萄糖、硫酸軟骨素、聚丙烯酸鈉、聚甲基丙烯酸中的一種或幾種的混合物。上述陰離子還可選用具有兩性電荷性質的各種蛋白、生長因子和分行誘導因子，這些蛋白、生長因子和分化誘導因子可通過調節pH值來得到不同的帶電性質。
本實施方式中，聚陽離子為二苯胺-4-重氮樹脂或取代二苯胺重氮樹脂，比如3-甲氧基二苯胺-4-重氮樹脂、N-甲基二苯胺-4-重氮樹脂、2-硝基二苯胺-4-重氮樹脂、2-磺酸二苯胺-4-重氮樹脂、N-甲基二苯胺-2-重氮樹脂等中的一種或幾種的混合物。
具體實施方式
二本實施方式是這樣實現的
1)清洗人工血管將膨體聚四氟乙烯人工血管浸泡在有機溶劑中，超聲30～120分鐘，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小時。
2)溶解硅橡膠將醫用硅橡膠作為常溫固化粘合劑，使其溶解在有機溶劑中，制備體積濃度為0.1～100v/v％的硅橡膠溶液。
3)涂覆硅橡膠將人工血管和注射器連接，豎立，然后用注射器將硅橡膠溶液從人工血管的末端注入其腔內，直到管腔填滿為止。接著用注射器從人工血管的末端移去硅橡膠溶液，放在空氣中室溫下干燥2～100小時。
4)浸泡硅橡膠涂層密封人工血管的末端，在其管腔內填滿無水乙醇，靜置0.5～10小時。
5)配制Nafion溶液將從Aldrich公司購買的5wt％Nafion溶液用旋轉蒸發儀除去溶劑，再加入新有機溶劑配制1～20wt％Nafion溶液，所述新有機溶劑為正己烷或其它烷烴溶劑。
6)涂覆Nafion用注射器將Nafion溶液從人工血管的末端注入其腔內直到管腔填滿為止，移去Nafion溶液用氮氣吹干。重復注入、移去、氮氣吹干三步過程2～100次。
7)靜電吸引層層自組裝二苯胺重氮樹脂和包括肝素在內的聚陰離子超薄膜用注射器將濃度為0.001～100mg/ml帶正電荷的二苯胺重氮樹脂溶液從人工血管的末端注入其腔內，直到管腔填滿為止，吸附時間為0.5～30分鐘，待人工血管內壁吸附上一層二苯胺重氮樹脂后，移去溶液并用去離子水洗滌干凈，這時表面帶上正電荷；用同樣的方法將為0.001～100mg/ml帶負電荷的聚陰離子溶液注滿人工血管，吸附時間為0.5～30分鐘，待人工血管內壁吸附上一層聚陰離子后，移去溶液并用去離子水洗滌干凈，這時表面帶上負電荷。重復上述步驟，使二苯胺重氮樹脂和聚陰離子交替組裝在人工血管的內壁上，直至達到所需要的層數為止(厚度一般為1～1000nm)。反應結束后，取出溶液用去離子水洗滌干凈，室溫下真空干燥至恒重。
8)利用紫外光將自組裝膜層間的離子鍵轉變成共價鍵用波長為365nm的紫外光或者可見光照射人工血管內壁，發生光化學反應，使二苯胺重氮樹脂和包括肝素在內的聚陰離子之間的離子鍵轉變成共價鍵。
本實施方式步驟1)中，超聲時間優選為30分鐘，干燥溫度優選為60℃，干燥時間優選為0.5小時。
本實施方式步驟2)中，溶解硅橡膠的濃度優選為50v/v％。
本實施方式步驟3)中，在空氣中和室溫下干燥的時間優選為24小時。
本實施方式步驟4)中，用無水乙醇浸泡硅橡膠涂層的時間優選為2小時。
本實施方式步驟6)中，配制Nafion溶液用有機溶劑為甲醇、無水乙醇或者它們的混合物。Nafion溶液的濃度優選為5wt％，注入、移去Nafion溶液、氮氣吹干等三步過程循環次數優選為20次。
本實施方式步驟7)中，二苯胺重氮樹脂和聚陰離子水溶液濃度優選0.1～10mg/ml，吸附時間優選為1分鐘。
本實施方式在人工血管等生物醫學裝置的表面上涂上硅橡膠作為軟支撐，再在硅橡膠涂層的表面上涂上Nafion為層層靜電組裝提供活性基團。然后將帶正電荷的二苯胺重氮樹脂和帶負電荷的肝素分子通過靜電吸引作用交替沉積到Nafion涂層的表面上。接著，將人工血管置于紫外光下，DR的重氮基帶正電荷，肝素的硫酸基帶負電荷，通過靜電吸引作用，誘導重氮基團與肝素的硫酸基團之間發生光化學反應，二者形成離子復合物，生成硫酸酯，使膜內的離子鍵轉變成共價鍵，便制得了共價鍵合的多層膜，使肝素在膜中的穩定性大大提高。肝素分子經層層自組裝和光化學反應后仍然保持其原有的生物活性，具有明顯的抗凝血作用。本實施方式所制備的肝素薄膜的表面具有活性基團，還可在其表面繼續組裝其它材料的薄膜，如聚電解質、生物功能分子、導電聚合物等。肝素(Hep)和二苯胺重氮樹脂(DR)的光化學反應方程式為具體實施方式
三本實施方式是這樣實現的a、將膨體聚四氟乙烯人工血管浸泡在無水乙醇中，超聲30分鐘，然后在60℃下干燥1小時。
b、將醫用硅橡膠作為常溫固化粘合劑，使其溶解在有機溶劑中，制備50v/v％硅橡膠溶液；c、將人工血管和注射器連接，直立，然后用注射器將50v/v％硅橡膠溶液從人工血管的末端注入其腔內，直到管腔填滿為止。移去硅橡膠溶液，在空氣中室溫下干燥24小時。用夾子夾緊人工血管的末端，在其管腔內填滿無水乙醇，靜置2小時。
d、移去乙醇，用注射器將5wt％Nafion溶液從人工血管的末端注入其腔內，直到管腔填滿為止。移去Nafion溶液，用氮氣吹干后。重復注入、移去、氮氣吹干三步過程20次。
e、用注射器將濃度為1mg/ml帶正電荷的二苯胺重氮樹脂溶液從人工血管的末端注入其腔內，直到管腔填滿為止，吸附時間為15分鐘，待人工血管內壁吸附上一層二苯胺重氮樹脂后，移去溶液并用去離子水洗滌干凈，這時表面帶上正電荷。用同樣的方法將濃度為1mg/ml肝素溶液注滿人工血管，吸附時間為1分鐘，待人工血管內壁吸附上一層肝素后，移去溶液并用去離子水洗滌干凈，這時表面帶上負電荷。重復上述步驟，使二苯胺重氮樹脂和肝素交替組裝在人工血管的內壁上，反應結束后，移去溶液并用去離子水洗滌干凈，在室溫下真空干燥至恒重。除第一層二苯胺重氮樹脂的吸附時間為15分鐘外，其余的二苯胺重氮樹脂層和所有的肝素層的吸附時間均為1分鐘。為了證明DR和Hep可以通過靜電作用形成均勻的多層高分子膜，用石英玻璃片代替人工血管作基底重復上述步驟。
從圖1可以看出，最大吸收波長為377nm的吸收峰歸屬于DR上重氮基的π-π*越遷。隨著DR/Hep雙層數目的增加，在最大波長處的吸光度呈線性增加，有力地證明了DR和Hep可以通過靜電吸引作用形成均勻的涂層。這不僅說明了層層靜電自組裝過程的發生，也說明了DR和Hep形成了均勻的高分子涂層。
f、用細長的長波長紫外燈[365nm，直徑0.95cm，長5.4cm]作光源照射DR/Hep多層膜，樣品與光源的距離為3cm(相對強度2mW/cm2)。
從圖2可以看出，光照時間分別為0s、30s、50s、90s、150s，隨著照射時間增加，在377nm處的吸光度顯著降低，吸收峰消失；同時，在290nm處出現了一個新的峰，吸光度隨照射時間增加而增加。這有力地證明了DR的重氮基團與Hep的硫酸基團之間發生了光化學反應生成硫酸酯，從而使膜內的離子鍵轉變成共價鍵。
將肝素化的人工血管切成直徑為18mm小圓片，放入37℃的Hepes緩沖溶液(20mM Hepes+190mM NaCl+0.5mg/ml BSA+0.02％NaN3)中培養，然后加入人類抗凝血酶(antithrombin，AT-III)，培養5分鐘，接著加入凝血酶(thrombin)開始反應。凝血酶和抗凝血酶的最后濃度分別為10nM和20nM。每隔一段時間取出16μL反應液，加入368μL含20mM EDTA的Tris緩沖溶液(50mM Tris+175mM NaCl+0.5mg/ml BSA)以中止反應。加入16μL發色基質S-2238(最終濃度為0.2mM)，在405nm處用UV/vis分光光度計檢測凝血酶。
從圖3可以看出，與不含肝素的參照樣品相比，含肝素的[(PLL/Hep)4和(DR/Hep)4]多層薄膜大大加快了凝血酶失活(PLL是聚-L-賴氨酸)。光交聯之前，離子鍵合的(DR/Hep)4和(PLL/Hep)4相似，由于溶解作用肝素在短時間內很快釋放到溶液中，使凝血酶濃度急劇下降。在37℃的PBS緩沖溶液中培養一周之后，由于肝素的溶解損失，(DR/Hep)4和(PLL/Hep)4對凝血酶失活的影響與參照樣品很接近。反之，由于光交聯使層間離子鍵轉變為共價鍵，培養一周之后(DR/Hep)4對凝血酶失活的影響沒有明顯的變化，說明共價鍵合的肝素薄膜的穩定性大大提高。含肝素的多層薄膜[(PLL/Hep)4和(DR/Hep)4]具有很好的抗凝血活性，以共價鍵結合的多層薄膜(DR/Hep)4具有更好的穩定性。
從圖4可以看出，在四個雙層之內，肝素對凝血酶失活的影響隨著DR/Hep雙層數目增加而增加。大于四個雙層后，進一步增加DR/Hep雙層數目，對凝血酶失活的影響沒有明顯的差別。這表明只有最外層的肝素才對凝血酶失活有直接影響。在四個雙層之內對凝血酶失活的影響之所以隨著雙層數目的增加而增加是因為最外層肝素的濃度尚未達到飽和。
從圖5可以看出，在37℃的緩沖溶液中培養10天后，肝素化表面仍然保持很好的活性，但在5個雙層和10個雙層之間沒有明顯的差別，進一步證明共價鍵合的肝素多層膜具有較高的穩定性，當雙層數目達到4的時候肝素表面濃度已經達到飽和。
圖4和圖5表明只有最外層的肝素才對凝血酶失活有直接影響。
權利要求
1.人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于它是這樣實現的a、將人工植入體浸泡在有機溶劑中，超聲清洗30～120分鐘，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小時；b、將醫用硅橡膠作為常溫固化粘合劑，使其溶解在有機溶劑中，制備硅橡膠溶液；c、在人工植入體的內表面上涂覆醫用硅橡膠作為軟支撐；d、在硅橡膠涂層的表面上涂覆全氟磺酸；e、將帶正電荷的聚陽離子和帶負電荷的聚陰離子通過靜電吸引作用交替沉積到全氟磺酸涂層的表面上；f、利用紫外光照射人工植入體內壁，通過光化學反應使膜內層間的離子鍵轉變成共價鍵，得到抗凝血表面超薄膜。
2.根據權利要求1所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述清洗人工植入體所用有機溶劑為無水乙醇、丙酮或者它們的混合物。
3.根據權利要求1或2所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述人工植入體為人工血管、血導管、聚合物膜或多孔支架，或者是用玻璃、陶瓷、硅、各種金屬或各種聚合物材料制成的各種形狀的生物醫學裝置。
4.根據權利要求1所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述溶解硅橡膠的有機溶劑為烷烴溶劑。
5.根據權利要求4所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述烷烴溶劑為正己烷。
6.根據權利要求1所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述硅橡膠溶液體積濃度為0.1～100v/v％。
7.根據權利要求1所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述聚陰離子為肝素、硫酸肝素、海藻素鈉、聚苯乙烯磺酸鈉、硫酸葡萄糖、硫酸軟骨素、聚丙烯酸鈉、聚甲基丙烯酸中的一種或幾種的混合物。
8.根據權利要求1所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述聚陽離子為二苯胺-4-重氮樹脂或取代二苯胺重氮樹脂。
9.根據權利要求8所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述取代二苯胺重氮樹脂為3-甲氧基二苯胺-4-重氮樹脂、N-甲基二苯胺-4-重氮樹脂、2-硝基二苯胺-4-重氮樹脂、2-磺酸二苯胺-4-重氮樹脂、N-甲基二苯胺-2-重氮樹脂中的一種或幾種的混合物。
10.根據權利要求1所述的人工植入體的抗凝血表面修飾方法，其特征在于所述抗凝血表面超薄膜的厚度為1～1000nm。
全文摘要
人工植入體的抗凝血表面修飾方法，它屬于抗凝血材料技術領域。針對硬連接的肝素降低人工血管的柔韌性且抗凝血性能不夠好、共價鍵合的單分子層肝素濃度太低、而離子鍵合的多層肝素分子膜在極性溶劑中的穩定性差的缺點，本發明是這樣實現的a.清洗人工植入體；b.制備硅橡膠溶液；c.在人工植入體的內表面上涂覆醫用硅橡膠作為軟支撐；d.在硅橡膠涂層的表面上涂覆全氟磺酸；e.將聚陽離子和聚陰離子通過靜電吸引作用交替沉積到全氟磺酸涂層的表面上；f.利用紫外光照射人工植入體內壁，通過光化學反應使膜內層間的離子鍵轉變成共價鍵。本發明工藝簡單，反應條件溫和，易操作，重現性好，環境友好，具有良好的應用前景。
文檔編號A61L33/00GK1748804SQ20051001023
公開日2006年3月22日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者戴志飛, 岳秀麗 申請人:哈爾濱工業大學