專利名稱：鳶尾甙元在制備防治肝臟疾病和肝癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及鳶尾甙元，具體地說，涉及鳶尾甙元作為藥物用于防治肝臟疾病或肝癌。
背景技術：
鳶尾甙元，全稱5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮，又名為鳶尾黃素，英文名為Tectorigenin(以下簡稱為Tec)，其結構式如下，是一類多羥基的異黃酮類化合物，其廣泛分布于鳶尾科植物中，具有抗氧化及雌激素樣生物活性，但未見有鳶尾防治肝臟疾病及抗癌的報道。
鳶尾甙元(Tectorigenin，5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮)發明內容本發明人對鳶尾甙元進行了藥理學研究，發現鳶尾甙元對D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)誘導的小鼠急性肝損傷有防護作用、對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷有防護作用、對復合因素引起的大鼠肝纖維化有治療作用，以及對肝癌等細胞有較強的抑制作用。因此，鳶尾甙元可以用于制備防治肝臟疾病的藥物，即鳶尾甙元可以用于制備防治肝損傷或肝炎的藥物、用于制備防治肝纖維化的藥物或用于制備治療肝癌的藥物。
具體實施例方式
通過以下實施例進一步詳細說明本發明，但應注意本發明的范圍并不受這些實施例的任何限制。
實施例1鳶尾甙元的制備取100克干燥的鳶尾根莖粉末，用90％的乙醇回流提取，提取液減壓濃縮至無醇味(70ml左右)。將濃縮液補水至400ml，向其中加入碳酸氫鈉使碳酸氫鈉的終濃度為5％。于80℃水浴中充分攪拌半小時后過濾得澄清的濾液。在該濾液中加入濃鹽酸使濾液的pH值為2-3，過濾出析出物(干重為8.7g)。用800ml乙酸乙酯于60℃水浴條件下充分溶解析出物，濾去不溶物即得澄清的乙酸乙酯液。先用等體積(800ml)的5％的碳酸氫鈉溶液萃取乙酸乙酯液兩次，棄去碳酸氫鈉溶液，再用等體積(800ml)的2％的碳酸鈉溶液萃取乙酸乙酯液一次得碳酸鈉的萃取液。在碳酸鈉萃取液中加入濃鹽酸使溶液pH值為2-3即有固體析出(干重3.1g)。用600ml 1％的碳酸氫鈉溶液于80℃水浴中充分溶解固體析出物，先用等體積(600ml)的氯仿萃取該碳酸氫鈉溶液兩次，再用等體積(600ml)的乙酸乙酯萃取該碳酸氫鈉溶液一次，收集乙酸乙酯溶液，濃縮即得黃色粉末狀的鳶尾甙元粗品(干重1.2g，鳶尾甙元含量在78％左右)。多次重結晶后得淡黃色針晶，熔點215-216℃；紫外UVλmax(nm)265、322(甲醇中)；1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.06(1H，s，C5-OH)，10.76(1H，s，C7-OH)，9.58(1H，s，C4’-OH)，8.33(1H，s，C2-H)，7.37(2H，d，J＝8.1Hz，C2’-H，C6’-H)，6.82(2H，d，J＝8.1Hz，C3’-H，C5’-H)，6.5(1H，s，C8-H)，3.75(3H，s，C6-OCH3)。
鳶尾甙元粗品用95％的乙醇重結晶，即得高純度的鳶尾甙元(干重1.0g，鳶尾甙元含量在90％以上)。
下面是部分藥理學實驗數據實施例2.鳶尾甙元(Tec)防治肝損傷的作用(一)Tec對D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠分5組，對照組以生理鹽水灌胃(0.3mL·d-1)，連續7d，第7d腹腔注射生理鹽水(0.15mL·10g-1)；D-GalN、Tec(15、30、60mg·kg-1)各組分別以生理鹽水、不同濃度的Tec灌胃(0.3mL·d-1)，連續7d，于第7d腹腔注射D-GalN(800mg·kg-1，0.15mL·10g-1)，16h后取血，測AST及ALT活性，結果見表1。
由表1可知，Tec能以劑量依賴方式有效抑制D-GalN引起的小鼠AST及ALT活性的顯著上升。
表1Tec對D-GalN誘導的急性肝損傷的防護作用

注1)p＜0.01vs對照組，2)p＜0.01vs D-GalN組(二)Tec對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的防護作用小鼠分6組，對照組以生理鹽水灌胃(0.3mL·d-1)，連續5d，第6d腹腔注射植物油每只0.1mL·10g-1；CCl4組及Tec給藥組(15，30，60mg·kg-1)分別以生理鹽水及不同濃度的Tec灌胃(0.3mL·d-1)，連續5d，于第6d腹腔注射0.1％CCl40.1mL·10g-1；聯苯雙酯組(DDB)以200mg·kg-1聯苯雙酯灌胃0.3mL·d-1，于第6d腹腔注射0.1％CCl40.1mL·10g-1。24h后處死動物，取血清測AST及ALT活性，結果見表2。
表2Tec對CCl4誘導的急性肝損傷的防護作用

注1)p＜0.01vs對照組，2)p＜0.01vs CCl4組由表2可知，Tec能以劑量依賴方式抑制CCl4引起的小鼠AST及ALT活性的顯著上升。其中60mg·kg-1的Tec基本上能夠抑制CCl4對肝臟的損傷作用。
(三)鳶尾甙元對復合因素引起的大鼠肝纖維化的治療作用1、復合因素引起的大鼠肝纖維化模型的制作選用SD雄性大鼠70只，分為正常對照組(16只)和造模組(54只)。
復合因素造模造模組(54只)在開始造模之前的兩周飼以高脂低蛋白飼料(88％玉米粉+11.5％豬油+0.5％膽固醇)，以10％的乙醇為唯一飲料。造模開始之后飼以不含豬油的飼料(99.5％玉米粉+0.5％膽固醇)，以30％的乙醇為唯一飲料。造模開始的第一天以0.5ml/100g體重皮下注射40％的四氯化碳花生油溶液，以后改為以0.3ml/100g體重注射40％的四氯化碳花生油溶液，每周兩次。整個造模時間持續8周，第9周隨機處死造模組大鼠8只，分別測定其血清ALT、AST的活力及ALB的含量，并且做肝臟的病理切片觀察，結合以上指標判斷大鼠肝纖維化模型是否已經成功。
2、Tec對復合因素引起的大鼠肝纖維化大鼠的治療將肝纖維化的大鼠(45只)隨機分為模型對照組(9只)、Tec低劑量組(9只)、Tec中劑量組(9只)、Tec高劑量組(9只)及陽性藥物秋水仙堿組(秋水仙堿簡稱為COL，9只)。
正常對照組及模型對照組以生理鹽水灌胃(0.5mL·100g-1)，連續42d；Tec給藥組(7.5，15，35mg·kg-1)及陽性藥物秋水仙堿組以不同濃度的Tec及0.1mg·kg-1的秋水仙堿灌胃(0.5mL·100g-1大鼠體重)，連續42d。以上所有組的動物于第43d處死，取血清測AST及ALT活性等生理指標，結果見表3。
表3Tec對復合因素引起的大鼠肝纖維化的治療作用

注1)p＜0.01vs正常對照組，2)p＜0.01vs復合因素致模型對照組由表3可知，Tec能以劑量依賴方式治療或者緩解復合因素引起的大鼠肝纖維化的AST及ALT活性的顯著上升。其中以30mg·kg-1的Tec的效果為最好，其效果比陽性藥物秋水仙堿要好，基本上能夠抑制復合因素引起的大鼠肝纖維化的AST及ALT活性的顯著上升。
實施例3.鳶尾甙元的抗腫瘤作用1、MTT法測試體外抗腫瘤活性細胞孵育取對數生長期的腫瘤細胞，調細胞懸液濃度為1～1.5×105個ml-1。在96孔培養板中每孔加細胞懸液100μl，置37℃、5％CO2培養箱中培養24h。培養24h后，分別按設計加入藥液。
加藥將測試藥液按照最終濃度的濃度梯度分別加入到各個孔中，每個濃度設6個平行孔。實驗分為藥物試驗組(分別加入不同濃度的測試藥)、對照組(只加培養液和細胞，不加測試藥)和空白組(只加培養液，不加細胞和測試藥)。將加藥后的96孔板置于37℃、5％CO2培養箱中培養48h。陽性對照藥物的活性按照測試樣品的方法測定。
存活細胞的測定在培養了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μl(用D-Hanks緩沖液配成4mg/ml)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μlDMSO，振蕩5min，使formazan結晶溶解。最后，利用自動酶標讀數儀在570nm波長處檢測各孔的光密度(OD值)。
抑制率的計算細胞生長的抑制率按照下列公式計算生長抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100％(OD實驗表示測試藥物組的平均光密度，OD對照表示對照組的平均光密度，OD空白表示空白組的平均光密度)半數抑制濃度(IC50)定義為當50％的腫瘤細胞存活時的藥物濃度。根據測定光密度(OD)值，制作細胞生長抑制率的標準曲線，在標準曲線上求得其對應的藥物濃度。IC50值越小，表明其對癌細胞的抑制作用越強，抗癌效果越好。
2、Tec的抗腫瘤作用本發明人按照上述方法，選用Bel7402細胞(肝癌細胞)、Hepg2細胞(肝癌細胞)、Smmc-7721細胞(肝癌細胞)、Kb細胞(口腔上皮癌細胞)、SW1116細胞(結腸癌細胞)、BGC細胞(胃癌細胞)、AGS(胃腺癌細胞)、Hela細胞(宮頸癌細胞)等細胞株，用5-FU(5-氟尿嘧啶)作為陽性藥物，測試了Tec對上述細胞株的IC50，結果見表4。
表4Tec對各癌細胞抑制作用的IC50(μg/mL)(n＝6)

由表4可以看出，Tec對供測用的各種癌細胞均表現出較強的抑制作用，具有明顯的抗癌活性。同時可以看出Tec對肝癌細胞株的抑制效果好于其他的細胞株，具有極強的抗肝癌活性。
權利要求
1.鳶尾甙元在制備防治肝臟疾病的藥物中的應用。
2.鳶尾甙元在制備防治肝損傷或肝炎的藥物中的應用。
3.鳶尾甙元在制備防治肝纖維化的藥物中的應用。
4.鳶尾甙元在制備治療肝癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發明人對鳶尾甙元進行了藥理學研究，發現鳶尾甙元對D－氨基半乳糖胺(D－galactosamine，D－GalN)誘導的小鼠急性肝損傷有防護作用、對CCl
文檔編號A61P35/00GK1879616SQ20061004033
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月16日 優先權日2006年5月16日
發明者譚仁祥, 吳俊華, 徐琛, 陳運喜, 李方, 李洪森, 周添 申請人:南京大學