專利名稱：具有抗腫瘤作用的文蛤蛋白、基因序列及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生化與生物醫藥領域，具體涉及由文蛤(Meretrix meretrix L.)中分離純化的一種抗腫瘤蛋白(MML35)、該蛋白的基因序列以及該蛋白的制備方法和在預防和/或治療腫瘤疾病等領域的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是一種發病率高、嚴重威脅人類健康的疾病，因此，腫瘤的治療方法及新的抗腫瘤藥物研究已成為世界各國醫學科學研究領域的重大課題。目前，臨床上應用的抗腫瘤藥物仍以細胞毒類藥物為主，這類藥物對腫瘤雖然具有一定的療效，但存在選擇性差、毒副作用大等無法克服的缺點，臨床上迫切需要開發新型有效的抗腫瘤藥物。
由于海洋生態環境的特殊性，使得海洋生物具有某些陸上生物所沒有的活性物質，這些活性物質具有結構新穎、高活性、耐藥性低等優點，可以為新藥研究和開發提供大量模式結構和藥物前體。因此，沿海各國越來越重視從海洋中尋找潛在的有價值的藥物，“向海洋要藥”已成為藥物研究的新方向。近年來，從海洋軟體動物中提取的活性物質在治療腫瘤方面顯示出較好的勢頭，已成為國內外現代抗腫瘤藥物研究的熱點。
從上世紀60年代開始，國外學者首先開始從海洋貝類中分離純化具有抗腫瘤活性的多肽/蛋白。Schmeer等從馬克氏屬蛤類中提取到具有抗腫瘤活性的蛤素，其在體外對S180肉瘤和Krebs腹水瘤有較好的抑制作用。80年代，日本學者分別從海兔的卵、體腔液(Coelomic fluid)、蛋白腺(Albumen gland)及噴出液(Purple fluid)等多種組織中分離獲得了9種具有抗腫瘤活性的糖蛋白Aplysianin E、A、P；Julianin E、G、S；Dolabellanin A、C、P。這9種糖蛋白在體外均能裂解K-562等多株腫瘤細胞，但對正常血細胞均不表現裂解活性。近年來，已有多種海洋來源肽類物質及其合成類似物進入臨床研究。Pettit等發現的海兔(Dolabella auricularia)提取物Dolastatin10具有極強的抗腫瘤活性，90年代該產物進入臨床測試，在臨床II期由于神經系統副作用而未通過。由Dolastatin10改造的結構類似物Soblidotin(TZT1027)目前已經進入臨床I期；Dolastatin15是另一個從海兔中提取的具有抗腫瘤活性的多肽，目前已處于臨床前研究階段。
文蛤(Meretrix meretrix L.)為海洋瓣鰓類軟體動物，是我國重要的海洋貝類資源，也是我國傳統的海洋中藥。《神農本草經》記載“文蛤主惡瘡”，具有軟堅散結、扶正去邪之效，可潤五臟、止消渴、開脾胃，用于腫瘤、肺結核、高血壓、腎虛耳鳴的治療。國內已經針對文蛤的抗腫瘤活性進行了一系列的研究，其中，冷波等從文蛤中分離出分子量為3.14kD的具抗腫瘤活性的多肽，其在體外能通過破壞細胞的骨架結構顯著抑制BGC-823瘤細胞的生長；吳杰連等從文蛤中分離出一種具有抗腫瘤活性的小分子糖肽，命名為MGP0501，研究發現它可以選擇性殺傷多種腫瘤細胞，而不影響正常細胞生長。
本發明從文蛤中分離到一種新的具有抗腫瘤活性的蛋白。測定了該蛋白的N-末端序列。實驗證實，該蛋白在體外具有誘導人肝癌腫瘤細胞株BEL-7402凋亡的活性。與現有的化療藥物相比，抗腫瘤蛋白類藥物具有毒副作用小，不易產生耐藥性等優點，有希望發展成為新型的抗腫瘤藥物。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有抗腫瘤作用的文蛤蛋白。
本發明另一目的是提供一種具有抗腫瘤作用的文蛤蛋白的制備方法。
本發明的又一個目的是測定文蛤抗腫瘤蛋白體外誘導人肝癌腫瘤細胞株BEL-7402凋亡的作用。
本發明所述的文蛤蛋白的制備方法，含有以下步驟首先收集文蛤血淋巴，離心去沉淀，上清用硫酸氨沉淀進行分級分離，將活性部分經陽離子交換劑Celloluse-CM52分離，然后經陰離子交換劑Source15Q分離，最后經分子篩Superdex75分離。分離過程中獲得的每個組分均通過對人肝癌腫瘤細胞株BEL-7402的MTT實驗檢測并尋找各次操作的活性峰。制備步驟具體如下1.將新鮮文蛤用刀剖開，收集其血淋巴，經12000rpm離心60分鐘，去掉沉淀。向上清中緩緩加入硫酸氨粉末至40％飽和度，至于4℃靜置過夜，經12000rpm離心60分鐘，去掉沉淀，再次向上清中緩緩加入硫酸氨粉末至60％飽和度，置于4℃靜置過夜，經12000rpm離心60分鐘，棄掉上清，保留沉淀。
2.將硫酸氨沉淀的活性成分用水溶解，對超純水充分透析，然后對緩沖液透析。將透析好的活性成分上陽離子交換柱Celloluse-CM52，用含不同濃度NaCl的緩沖液洗脫，將洗脫峰收集后對水透析，于冷凍干燥機中凍干，儲存。所用緩沖液為0.05M NaAc，pH6.0緩沖液，緩沖液中含NaCl濃度分別為0、0.08、0.3、2M，活性成分位于含0.08M NaCl緩沖液的洗脫峰中。以上分離操作均在4℃層析柜中進行。
3.將凍干的Celloluse-CM52活性峰用緩沖液溶解后，利用蛋白質快速色譜系統(FPLC)的陰離子交換柱Source 15Q進行分離，分別用含不同濃度NaCl的緩沖液洗脫，將洗脫峰收集后對水透析，于冷凍干燥機中凍干，儲存。所用緩沖液是0.02M Tris，pH8.0緩沖液，緩沖液中含NaCl濃度分別為0.06、0.1、0.2、1M，活性成分位于含0.06M NaCl緩沖液的洗脫峰中。以上操作在室溫進行。
4.將凍干的Source 15Q活性成分用緩沖液溶解后，利用蛋白質快速色譜系統(FPLC)的分子篩層析柱Superdex75進行分離，所用緩沖液是0.05M NaAc，pH6.0緩沖液，其中含0.15M NaCl，將洗脫峰收集后對水透析，于冷凍干燥機中凍干，儲存。以上操作在室溫進行。
5.將經過Superdex75(FPLC)的活性峰再次上Superdex75(FPLC)，得到單峰，為單一文蛤蛋白峰，上述操作在室溫下進行。
具體實施例方式
實施例一文蛤血淋巴抗腫瘤蛋白的分離純化1.將新鮮文蛤用刀剖開，收集其血淋巴，經12000rpm離心60分鐘，去掉沉淀。向上清中緩緩加入硫酸氨粉末至40％飽和度，至于4℃靜置過夜，經12000rpm離心60分鐘，去掉沉淀，再次向上清中緩緩加入硫酸氨粉末至60％飽和度，置于4℃靜置過夜，經12000rpm離心60分鐘，棄掉上清，保留沉淀。
2.將硫酸氨沉淀的活性成分用水溶解，對超純水充分透析，然后對緩沖液透析。將透析好的活性成分上陽離子交換柱Celloluse-CM52，用含不同濃度NaCl的緩沖液洗脫，將洗脫峰收集后對水透析，于冷凍干燥機中凍干，儲存。所用緩沖液為0.05M NaAc，pH6.0緩沖液，緩沖液中含NaCl濃度分別為0、0.08、0.3、2M，活性成分位于含0.08M NaCl緩沖液的洗脫峰中。以上分離操作均在4℃層析柜中進行。
3.將凍干的Celloluse-CM52活性峰用緩沖液溶解后，利用蛋白質快速色譜系統(FPLC)的陰離子交換柱Source 15Q進行分離，分別用含不同濃度NaCl的緩沖液洗脫，將洗脫峰收集后對水透析，于冷凍干燥機中凍干，儲存。所用緩沖液是0.02M Tris，pH8.0緩沖液，緩沖液中含NaCl濃度分別為0.06、0.1、0.2、1M，活性成分位于含0.06M NaCl緩沖液的洗脫峰中。以上操作在室溫進行。
4.將凍干的Source 15Q活性成分用緩沖液溶解后，利用蛋白質快速色譜系統(FPLC)的分子篩層析柱Superdex75進行分離，所用緩沖液是0.05M NaAc，pH6.0緩沖液，其中含0.15M NaCl，將洗脫峰收集后對水透析，于冷凍干燥機中凍干，儲存。以上操作在室溫進行。
5.將經過Superdex75(FPLC)的活性峰再次上Superdex75(FPLC)，得到單峰，為單一文蛤蛋白峰，上述操作在室溫下進行。
實施例二文蛤蛋白體外誘導腫瘤細胞凋亡活性將人肝癌細胞株BEL-7402用0.25％胰酶消化分散成單個細胞懸液，分種于96孔板，每孔細胞數為3-4×103個，于37℃培養箱中培養24小時。將凍干文蛤蛋白用適量水溶解后，離心去沉淀，經0.22μm濾膜過濾后，加入細胞培養板中，置于二氧化碳培養箱培養。培養10小時后觀察發現，添加文蛤蛋白的處理組均發生了細胞凋亡現象，并呈現明顯的濃度依賴活性；繼續培養38小時后，進行MTT實驗檢測，發現分離獲得的文蛤蛋白的抗人肝癌細胞株BEL-7402的IC50為40μg/ml。
加入文蛤抗腫瘤蛋白10小時后，提取處理組腫瘤細胞的DNA進行瓊脂糖電泳檢測，發現明顯的梯狀電泳(Ladder)圖譜，表明分離獲得的文蛤蛋白可誘導人肝癌細胞株BEL-7402發生凋亡。
權利要求
1.一種文蛤蛋白MML35，它是由文蛤經多種分離手段得到的組分，分子量為35kDa，N-末端序列為NLWAMCCRAWLRASM，所述蛋白具有體外抗腫瘤活性。
2.該文蛤蛋白MML35的基因序列。
3.一種獲得權利要求1所述的文蛤蛋白的方法，它包括以下步驟取新鮮的文蛤，收集血淋巴，離心獲得上清后采用硫酸銨(40％、60％、80％飽和度)分級沉淀；活性組分(40-60％飽和度沉淀蛋白組分)經透析除鹽后，用緩沖液充分透析，經陽離子交換劑Celloluse-CM52分離；陽離子交換劑Celloluse-CM52分離的活性組分(含0.08M NaCl緩沖液的洗脫峰)經陰離子交換劑Sourcel5Q分離；陰離子交換劑Sourcel5Q分離的活性組分(含0.06M NaCl緩沖液的洗脫峰)經分子篩Superdex75分離。
4.根據權利要求1所述的文蛤蛋白，其特征在于，可以應用于在惡性腫瘤的預防和治療方面。
全文摘要
本發明公布了由文蛤血淋巴提取分離，具有抗腫瘤活性的蛋白，文蛤經硫酸銨分級沉淀，活性組分透析除鹽后分別利用陽離子交換、陰離子交換色譜及凝膠過濾技術分離獲得的一種新型抗腫瘤活性的蛋白MML35。本發明還包括MML35的基因序列，并涉及此蛋白用于治療和/或預防癌癥的用途。具體地說，就是通過多種的分離純化手段從文蛤中分離純化出一種新的蛋白，并通過體外活性實驗確定此種蛋白在惡性腫瘤的預防和治療方面的用途。
文檔編號A61P35/00GK101062945SQ200710014290
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月14日 優先權日2007年4月14日
發明者林秀坤, 寧璇璇, 魏寧, 牛榮麗 申請人:中國科學院海洋研究所