海參糖胺聚糖在制備治療冠脈綜合癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了海參糖胺聚糖在制備治療冠脈綜合癥藥物中的應(yīng)用，動(dòng)物試驗(yàn)證明，重均分子量為90kDa至130kDa海參糖胺聚糖中的一種以上，具有顯著的抗血小板聚集、抗凝、促進(jìn)纖溶、降低血粘度、調(diào)節(jié)血脂、抗病毒等多種生理活性，可以用于制備治療冠脈綜合癥藥物，能安全、有效的用于冠脈綜合癥的預(yù)防和治療。海參糖胺聚糖組合物在一定劑量下靜脈滴注具有顯著抑制血小板聚集作用，并且不具有明顯抗凝血作用，即由于抗凝作用引發(fā)出血的幾率更小，因此基于其抗血小板活性的開(kāi)發(fā)，用于治療冠脈綜合癥更為安全、有效，具有廣闊研究開(kāi)發(fā)前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】海參糖胺聚糖在制備治療冠脈綜合癥藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海參糖胺聚糖的醫(yī)藥用途，具體涉及分子量為90kDa至130kDa的海參糖胺聚糖在預(yù)防和治療冠脈綜合癥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute Coronary Syndrome, ACS)是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂(rupture)或糜爛(erosion),繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征，它是包括不穩(wěn)定心絞痛(UA)，非ST段抬高型心肌梗死和ST段抬高型心肌梗死的一系列臨床病征。血小板的激活在ACS的發(fā)生中起著重要作用。長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，許多患者的臨床癥狀各異，其冠狀動(dòng)脈卻具有非常相似的病理生理改變，即冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定，繼而破裂導(dǎo)致血栓形成。因此急性冠脈綜合征的抗栓治療是非常重要的，尤其在非ST段抬高型ACS中更是如此，抗栓治療可分為抗血小板治療和抗凝血酶治療。
[0003]非ST段抬高急性冠脈綜合征:包括不穩(wěn)定心絞痛和非ST段抬高心梗。2011年3月美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(ACC/AHA)發(fā)布了新版不穩(wěn)定性心絞痛/非ST段抬性心肌梗死(UA/NSTEMI)治療指南，其中關(guān)于抗血小板和抗凝治療的建議如下: [0004]I早期院內(nèi)藥物治療:抗血小板及抗凝是UA/NSTEMI治療的基石。對(duì)抗血小板以及抗凝治療有詳細(xì)的規(guī) 定:
[0005]I)應(yīng)當(dāng)迅速開(kāi)始抗血小板治療。首選阿司匹林(Level of Evidence:A)
[0006]2)阿司匹林過(guò)敏或胃腸道疾患不能耐受的患者，應(yīng)當(dāng)使用氯吡格雷(Level ofEvidence: A)
[0007]3)在不準(zhǔn)備做早期介入治療的住院患者，入院時(shí)除了使用阿司匹林外，還應(yīng)盡可能使用氯吡格雷，用藥時(shí)間為l(Level of Evidence:A) 一 9個(gè)月(Level of Evidence:B)
[0008]4)在準(zhǔn)備做介入的住院患者，應(yīng)當(dāng)使用使用氯吡格雷I個(gè)月以上(Level ofEvidence:A),如果沒(méi)有出血的高危因素,貝U可使用9個(gè)月(Level of Evidence:B)
[0009]5)在準(zhǔn)備做擇期CABG并且正在使用使用氯吡格雷的患者，應(yīng)當(dāng)停藥5 — 7天(Level of Evidence:B)
[0010]6)除了使用阿司匹林或使用氯吡格雷進(jìn)行抗血小板治療外，還應(yīng)當(dāng)使用靜脈普通肝素或皮下 LMWH 抗凝(Level of Evidence: A)
[0011]7)對(duì)于準(zhǔn)備行心導(dǎo)管檢查和PCI的患者，除使用阿司匹林和普通肝素外，還應(yīng)使用 GPIIb/IIIa 受體拮抗劑(Level of Evidence:A)
[0012]2出院后用藥指南:抗血小板藥是長(zhǎng)期用藥(二級(jí)預(yù)防)。
[0013]近年來(lái)抗血小板藥主要包括阿司匹林、噻氯吡啶、雙嘧達(dá)莫、氯吡格雷、拉米非班等，該類(lèi)藥物具有抑制血小板聚集作用，其副作用有所不同，但共同的副作用是出血。抗血小板藥抑制血小板聚集，血小板是初期止血作用所必需的，另一方面它又是動(dòng)脈血栓形成的啟動(dòng)物，因此嚴(yán)格控制用藥劑量，臨床適應(yīng)證和禁忌證十分重要。[0014]因此，尋求一種更為安全的用于預(yù)防和治療冠脈綜合癥的藥物，是人們十分期望的。
[0015]“海參，有人稱(chēng)之為“海人參”，因補(bǔ)益作用類(lèi)似人參而得名，既是宴席上的佳肴，又是滋補(bǔ)人體的珍品，其藥用價(jià)值也較高。《中醫(yī)大辭典》記載海參的功效:“補(bǔ)腎益精，養(yǎng)血潤(rùn)燥。治精血虧損、虛弱勞祛、陽(yáng)痿、夢(mèng)遺、腸燥便艱”。《本草從新》補(bǔ)腎益精，壯陽(yáng)療痿。”《藥性考》:“降火滋腎、通腸潤(rùn)燥。”《綱目拾遺》:“生百脈血，治休息痢。”《本草求新》:“潤(rùn)五臟，滋精利水”。
[0016]目前，已經(jīng)證實(shí)海參中具有藥用活性的成份主要有蛋白質(zhì)、多肽、脂類(lèi)、皂甙及多糖等。海參蛋白具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；海參中已經(jīng)分離出具有抗炎、抗腫瘤、提高免疫力活性的多肽；海參脂類(lèi)中的神經(jīng)節(jié)苷脂具有協(xié)同神經(jīng)生長(zhǎng)因子的作用，此外海參皂甙具有很強(qiáng)的抗真菌作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的目的是提供一種海參糖胺聚糖在制備治療冠脈綜合癥藥物中的應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿(mǎn)足人們的需要。
[0018]本發(fā)明的再 一個(gè)目的是提供一種含有分子量為90kDa至130kDa海參糖胺聚糖的藥物制劑。
[0019]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，海參糖胺聚糖抗血小板聚集及抗凝等方面較巖藻糖具有更強(qiáng)的活性。抗血小板藥物預(yù)防和治療冠脈綜合癥的作用非常明顯。海參糖胺聚糖具有在一定劑量具有顯著抑制血小板聚集作用同時(shí)不具有抗凝血活性，相對(duì)于市售的同類(lèi)藥物具有顯著的安全性?xún)?yōu)勢(shì)。
[0020]動(dòng)物試驗(yàn)證明，重均分子量為90kDa至130kDa海參糖胺聚糖中的一種以上，具有顯著的抗血小板聚集、抗凝、促進(jìn)纖溶、降低血粘度、調(diào)節(jié)血脂、抗病毒等多種生理活性，可以用于制備治療冠脈綜合癥藥物；
[0021]所述冠脈綜合癥包括急性心肌梗死(AMI)、不穩(wěn)定型心絞痛(UA)或動(dòng)脈血栓等。
[0022]優(yōu)選的，所述海參糖胺聚糖的重均分子量為95000Da~125000Da中的一種以上，更優(yōu)選為1000OODa~120000Da中的一種以上；
[0023]所述的“重均分子量為90000Da至130000Da之間的海參糖胺聚糖中的一種以上”指的是，可以是重均分子量為95000Da至125000Da之間的海參糖胺聚糖中的一個(gè)，也可以是重均分子量為1000OODa至1200000Da之間的海參糖胺聚糖各種分子量的組合，為一種組合物。
[0024]本發(fā)明所述的海參糖胺聚糖的制備方法，可采用專(zhuān)利“一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法”文獻(xiàn)提供的方法，優(yōu)選的，包括如下步驟:
[0025]I)從海參中提取海參多糖；
[0026]從海參中提取海參多糖的步驟，包括對(duì)海參進(jìn)行浸泡、絞碎、酶解并沉淀獲得海參多糖粗品，然后對(duì)海參多糖粗品純化、脫色，得到海參多糖；
[0027]所述酶解是用水解蛋白酶和復(fù)合胰酶進(jìn)行酶解；
[0028]所述水解蛋白酶可采用商業(yè)化產(chǎn)品，如Alcalase，諾維信(沈陽(yáng))生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；所述復(fù)合胰酶如無(wú)錫市雪梅酶制劑科技有限公司的產(chǎn)品，雪梅牌[0029]對(duì)海參多糖粗品純化是用DEAE-纖維素柱進(jìn)行純化。
[0030]所述海參選自玉足海參、黑海參、糙海參、梅花參、二色桌片參、白底福肛參，優(yōu)選為玉足海參和糙海參；[0031]2)采用是用凝膠過(guò)柱收集重均分子量介于90kDa至130kDa之間的海參糖胺聚糖；
[0032]收集的海參糖胺聚糖的多分散度小于2，優(yōu)選小于1.5，更優(yōu)選小于1.4 ；
[0033]所述多分散度指的是本領(lǐng)域常用的衡量聚合物分子量分布的指數(shù)，用于表征聚合物分子量分布的寬度。多分散度在本文或其他文獻(xiàn)中又被稱(chēng)多分散指數(shù)、多分散性或分布寬度指數(shù)，是重均分子量(Mw)與數(shù)均分子量(Mn)之比，即Mw / Mn。這個(gè)比值隨分子量分布寬度而變化。在單分散時(shí)，Mw / Mn等于I，隨著分子量分布變寬，Mw / Mn值逐漸變大；
[0034]其中，步驟2)后還包括冷凍干燥的步驟；
[0035]本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，包括治療有效量的所述的海參糖胺聚糖和藥學(xué)上可接受的載體；
[0036]所述的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的載體，例如:稀釋劑、賦形劑如水等；粘合劑如纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等；填充劑如淀粉等；崩裂劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鈣或硬脂酸鎂等。另外，還可以在組合物中加入其他輔助劑如香味劑和甜味劑，優(yōu)選的為甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮和氯化鈉中的一種或幾種，優(yōu)選甘露醇；
[0037]所述藥物組合物為凍干粉針劑時(shí),所述海參糖胺聚糖的重量含量為0.5-2%,優(yōu)選1% ;靜脈滴注速度為100ml/h ;靜脈滴注給藥劑量為0.01mg/kg~6mg/kg大鼠體重,優(yōu)選
0.5 ~3mg/kg ；
[0038]本發(fā)明的組合物的各種劑型可以采用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行制備，其中活性成分的含量為0.1%~99.5% (重量比)。
[0039]經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究表明，該藥物組合物能安全、有效的用于冠脈綜合癥的預(yù)防和治療。其預(yù)防和治療冠脈綜合癥，是與其抗血小板聚集、抑制血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附相關(guān)。并且近年來(lái)隨著血小板生理、生化功能的逐步闡明，新型的血小板聚集抑制劑將會(huì)不斷出現(xiàn)，海參糖胺聚糖組合物在一定劑量下靜脈滴注具有顯著抑制血小板聚集作用，并且不具有明顯抗凝血作用，既由于抗凝作用引發(fā)出血的幾率更小，因此基于其抗血小板活性的開(kāi)發(fā)，用于治療冠脈綜合癥更為安全、有效，具有廣闊研究開(kāi)發(fā)前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1本發(fā)明的海參糖胺聚糖組合物純度圖。
[0041]圖2本發(fā)明的海參糖胺聚糖組合物的分子量分布圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0042]海參主要含有兩種多糖一種為海參糖胺聚糖，另一種為海參巖藻多糖。海參多糖同海參皂苷一樣也具有多種生理活性，生理活性主要表現(xiàn)為:抑制栓塞、抗凝血、提高免疫力、促進(jìn)纖維蛋白質(zhì)溶解、抗腫瘤作用、降血糖等。本發(fā)明的海參選自玉足海參、糟海參、黑海參、梅花參、二色桌片參、白底輻肛參，優(yōu)選玉足海參。其中，玉足海參產(chǎn)于我國(guó)南海北海等地，分布廣泛、資源豐富、價(jià)格適宜，而且海參糖胺聚糖含量豐富，是理想的原材料。
[0043]在本發(fā)明的制備海參糖胺聚糖一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為了獲得適合于靜脈注射的高純度海參糖胺聚糖組合物，可以依次將干燥的玉足海參體壁絞碎，經(jīng)酶解后離心，上清液用乙醇沉淀，干燥得沉淀物I ;將該沉淀物I加水溶解后，加入氯化鈣，離心，上清液用乙醇醇沉，干燥得沉淀物II ;將沉淀物II加水溶解后，加入醋酸鉀，取上清液，加乙醇沉淀，干燥得海參多糖粗品；將海參多糖粗品過(guò)DEAE-纖維素柱，用乙醇醇沉，加入雙氧水脫色處熱源，可得分子量為90~130kDa的海參多糖。
[0044]本發(fā)明提供一種藥物組合物制劑，其中包括海參糖胺聚糖組合物和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明是含有海參糖氨基糖的藥物制劑為凍干粉針劑，藥學(xué)上可接受的載體甘露醇、、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮和氯化鈉中的一種或幾種。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的含量為0.5~3%，，優(yōu)選1%。
[0045]本發(fā)明提供一種藥物組合物制劑在防治冠脈綜合癥的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選非ST段抬高心梗給藥的劑量一般由醫(yī)師根據(jù)患者的具體情況(如年齡、體重、性別、患病時(shí)間、身體狀況等)確定。一般而言，以海參糖胺聚糖計(jì)，給藥的劑量為0.1~5mg/kg患者體重，優(yōu)選為 0.1 ~lmg/kg,優(yōu)選為 0.1 ~0.6mg/kg。
[0046]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0047]實(shí)施例1
[0048]稱(chēng)取玉足海參藥材2kg，水浸過(guò)夜。將海參體壁淋干水分，絞碎，稱(chēng)重并補(bǔ)水至6Kg，置60°C水浴中，加入氫氧化鈉調(diào)pH至8.0±0.2，加入水解蛋白酶Alcalase40ml (投料量的2%)攪拌，酶解4小時(shí)，85°C以上滅活10分鐘，降溫至50°C ±2°C，加入氫氧化鈉調(diào)pH至8.0±0.2，再加復(fù)合胰酶IOg (投 料量的0.2%)攪拌酶解4小時(shí)，煮沸5分鐘，冷卻。4°C離心，收集上清液，加入鹽酸調(diào)PH至2.5±0.2，4°C冷藏2小時(shí)，離心，收集上清液，調(diào)pH至7.0±0.2，加0.8倍乙醇，4°C靜置過(guò)夜。
[0049]離心，收集沉淀稱(chēng)重，加15倍(v/w)蒸餾水，加熱至85°C ±2°C，待完全溶解后，加入氫氧化鈉PH調(diào)至9.0±0.2，按量加入氯化鈣至溶液最終濃度達(dá)到3%，升溫至90°C以上保持10分鐘，冷卻至室溫，4°C離心，收集上清液，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH至11.0±0.2，離心，收集上清液，用6mol/LHCl溶液調(diào)pH至6.0±0.2，加0.8倍乙醇，4°C冷藏過(guò)夜。
[0050]冷藏液離心，收集沉淀稱(chēng)重，加2倍體積蒸餾水，加熱使其充分溶解，加乙酸鉀使其最終濃度為2mol/L，4°C靜置過(guò)夜。離心，收集沉淀稱(chēng)重，加2倍體積蒸餾水，加熱使其充分溶解，加乙酸鉀使其最終濃度為2mol/L，4°C靜置過(guò)夜。離心，沉淀用冷2mol/L乙酸鉀溶液洗滌三次，然后依次用體積濃度80%乙醇、體積95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌，待乙醇揮發(fā)盡后80°C干燥，稱(chēng)重，得粗品III。
[0051]粗品III 35g加0.05mol/L、pH6.0的HAc-NaAc緩沖液溶解制成重量濃度2%的溶液上柱，溶液通過(guò)纖維素層析柱后，用1.5倍柱體積的0.4mol/LNaCl的HAc-NaAc緩沖液(ρΗ6.0±0.2)洗滌，再用lmol/LNaCl的HAc-NaAc緩沖液(ρΗ6.0±0.2)洗脫，根據(jù)紫外檢測(cè)儀在220nm處數(shù)值的變化速度收集洗脫液，置60°C水浴中，用NaOH調(diào)pH至11 ±0.2，按體積量加入3%雙氧水，保持4小時(shí)，冷卻，離心，收集上清液，用HCl調(diào)pH至7.0±0.2，加I倍量乙醇，4°C靜置過(guò)夜。[0052]離心，收集沉淀，依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇，稱(chēng)重(濕重)，得粗品V。
[0053]粗品V用蒸餾水溶解成5%的溶液，用截留分子量I萬(wàn)的超濾膜濃縮至原體積的1/2，補(bǔ)加水至原體積，再超濾至1/2體積，再加水重復(fù)一次，超濾液冷凍干燥，得海參糖胺聚糖，其分子量都在90kDa~130kDa，D值< 1.5，純度為98%以上。
[0054]該實(shí)例得到的海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測(cè)器(RID-10A，島津)可得到純度為100.0%的純品(見(jiàn)圖1)。
[0055]經(jīng)該實(shí)例得到的海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱(TSK gel G4000PWXL)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量108756，D值為1.40 (見(jiàn)圖2)，其中:圖2A為色譜圖，圖2B為分子量分布圖，圖2C為分子量累積重量分布曲線(xiàn)。
[0056]注射用含有海參糖胺聚糖的藥物組合物的制備，以上IOg海參糖胺聚糖加入注射用水，配成1%的溶液，再加入甘露醇20g溶解，精濾，灌裝，冷凍干燥，得到1000支注射用海參糖胺聚糖的凍干粉針劑。
[0057]實(shí)施例2
[0058]海參糖胺聚糖的藥效學(xué)研究
[0059]I海參糖胺聚糖對(duì)大鼠凝血系統(tǒng)的影響
[0060]1.1試驗(yàn)?zāi)康?br> [0061]觀察舌下靜脈注射海參糖胺聚糖后對(duì)大鼠凝血系統(tǒng)的影響。
[0062]1.2試驗(yàn)材料
[0063]1.2.1供試樣品:
[0064]實(shí)施例1的海參糖胺聚糖；配制:精密稱(chēng)取后以注射用生理鹽水溶解并稀釋至所需濃度。
[0065]1.2.2試驗(yàn)動(dòng)物:
[0066]品系:SD大鼠；來(lái)源:上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；性別:雄性；體重:220-250克；動(dòng)物合格證號(hào):SCXK (滬)2008-0016 ;飼養(yǎng):動(dòng)物飼養(yǎng)于正壓凈化通風(fēng)動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫23 ± I °C，濕度50~70 %，人工照明模擬晝夜變化，自由進(jìn)食與飲水。
[0067]1.2.3試驗(yàn)儀器
[0068]自動(dòng)凝血分析儀Sysmex CA-1500
[0069]1.3試驗(yàn)方法
[0070]將SD大鼠40只，分成4個(gè)不同的給藥組，陰性對(duì)照組(舌下靜脈注射生理鹽水0.5ml/100g) ；GAG低、中、高三個(gè)劑量組(0.3,0.6、lmg/kg)舌下靜脈注射給藥，體積
0.5ml/100g,注射速度 lmin。
[0071]GAG低、中、高三個(gè)劑量組，空白對(duì)照組舌下靜脈注射給藥后30min腹主動(dòng)脈采血測(cè)定PT、APTT、TT數(shù)值。
[0072]各組動(dòng)物在手術(shù)前IOmin用3%速可眠腹腔注射麻醉(0.lml/100g體重)，仰臥固定后腹腔手術(shù)，用一次性3.2%檸檬酸鈉抗凝真空采血管采血。
[0073]1.4試驗(yàn)結(jié)果
[0074]GAG在低、中劑量(0.3mg/kg，(X6mg/kg)對(duì)APTT、TT、PT均無(wú)明顯影響。但是在lmg/kg時(shí)則產(chǎn)生較明顯的改變，但是未超過(guò)150% — 250%的范圍。
[0075]表1GAG大鼠凝血時(shí)間
【權(quán)利要求】
1.海參糖胺聚糖在制備治療冠脈綜合癥藥物中的應(yīng)用，所述海參糖胺聚糖的重均分子量為90kDa至130kDa的海參糖胺聚糖中的一種以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，優(yōu)選的，所述海參糖胺聚糖的重均分子量為95kDa~125kDa中的一種以上，更優(yōu)選為90kDa~120kDa中的一種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述冠脈綜合癥包括急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛或動(dòng)脈血栓。
4.一種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的海參糖胺聚糖和藥學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為凍干粉針劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述海參糖胺聚糖的重量含量為0.5-2%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，靜脈滴注速度為100ml/h;靜脈滴注給藥劑量6mg/kg~0.01mg /kg大鼠體重。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK103536621SQ201210240028
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月11日
【發(fā)明者】王志國(guó), 劉全海, 汪寄宇 申請(qǐng)人:上海開(kāi)潤(rùn)生物醫(yī)藥有限公司, 哈爾濱紅豆杉生物制藥有限公司