專利名稱：一種同時制備單環刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，涉及糖胺聚糖和抗菌肽的制備，尤其是涉及一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法。
背景技術：
單環刺縊俗名海腸、海腸子，屬于縊蟲動物門、縊綱、無管縊目、刺縊科。體粗大，長約100-300mm，寬約25_27mm，體表滿布大小不等的粒狀突起，吻圓錐形；腹剛毛I對，粗大； 肛門周圍有一圈9-13條褐色尾剛毛，是我國北方沿海泥沙岸潮間帶下區及潮下帶淺水區底棲生物的常見種。目前對單環刺縊研究集中在形態結構、胚胎發育、生活史、人工育苗技術、營養成分分析及血栓溶解酶等，對于單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的開發應用尚未見報道。糖胺聚糖是海洋生物中含量較豐富的物質，是由重復的二糖單位構成的長鏈多糖，具有明顯的抗凝血、抗腫瘤、抗病毒和提高機體免疫力的作用；抗菌肽是動物免疫防御系統在誘導條件下產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質，廣泛存在于植物和動物體內，分子質量一般在4ku左右，抗菌肽是生物體內的內源性抗生素，是生物體先天性免疫體系的重要組成部分。

發明內容
本發明的目的是提供一種以單環刺縊為原材料，同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法。本發明的技術方案概述如下一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(I)原料處理將原料單環刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，在43°C _47°C水浴條件下酶解4-6h,酶解液煮沸滅酶后,5000r-8000r/min離心10min-15min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過相對分子質量I萬的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對分子質量I萬以下和相對分子質量I萬以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質將所述相對分子質量I萬以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3-1/4，先用HCl水溶液調pH至2. 0，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調pH至7. 0， 離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質量濃度為3% -5%，離心除去蛋白質沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 70% -80%，于 4°C條件下靜置 20-28 小時，5000r_8000r/min 離心 10min_15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌2-4次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質量濃度為1% -3%,加到陰離子交換柱中，先用PH = 5. 0-5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液濃縮至洗脫液體積的1/2-1/4、透析、再濃縮至透析后液體積的 1/3-1/4 ；
④凝膠過濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過濾柱，進一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對分子量I萬以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/2-1/4,上樣于SephadexG-IOO凝膠過濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/2-1/3，濃縮液上樣于S印hadexG-25凝膠過濾柱，0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。最好的是步驟(2)中枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質量的0. 8% -1%。陰離子交換柱的填料優選DEAE-52纖維素或Q-Sepharose Fast Flow。本發明的優點和積極效果是I.本發明的方法反應條件溫和、制備過程綠色環保節能，一種原料同時制備兩種活性物質，產品附加值高；2.本發明的方法采用單環刺縊為原料，制備的糖胺聚糖和抗菌肽純度高；3.本方法在制備糖胺聚糖和抗菌肽的同時還可大量回收蛋白質，有利于單環刺縊的綜合利用，所制備的糖胺聚糖具有明顯的抗凝血(AT、PT和APTT三項指標均顯著高于空白對照組)、清除自由基(對于羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力顯著高于空白對照組)的效果，制備的抗菌肽對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等具有明顯的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽還可為海珍動物養殖業提供優良的免疫增強劑和新型抗菌藥物。


圖I為單環刺縊糖胺聚糖對白兔TT實驗的影響。圖2為單環刺縊糖胺聚糖對白兔PT實驗的影響。圖3為單環刺縊糖胺聚糖對白兔APTT實驗的影響。圖4為抗囷妝抑囷圈測定結果。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。本實施例所采用的提取客體是選自渤海廣泛分布的縊蟲動物-單環刺縊。實施例I一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括以下步驟(I)原料處理將單環刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質量的I %，在45°C水浴條件下酶解5h，酶解液煮沸滅酶后，6000r/min離心IOmin,得上清液； (3)超濾將上清液通過相對分子質量I萬的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對分子質量I萬以下和相對分子質量I萬以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質將相對分子質量I萬以上的組分的液體濃縮至該液體體積的1/3，先用HCl水溶液調pH至2. O，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調pH至7. O，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質量濃度為4%，離心除去蛋白質沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 80%,于4°C條件下靜置24小時，6000r/min離心IOmin,移去上清液,沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌3次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質量濃度為2%，加到填料為DEAE-52纖維素的陰離子交換柱中，先用pH = 5. 3乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用 0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強)濃縮至洗脫液體積的1/3、 透析、再濃縮至透析后液體積的1/3 ；④凝膠過濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過濾柱，進一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/5，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對分子量I萬以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3,上樣于SephadexG-IOO凝膠過濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. O乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/3,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過濾柱,0. 2mol/L pH = 7. O 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過檢驗，制備的糖胺聚糖純度達94. 6%，得率為是原料重的0. 32%;抗菌肽純度達92. 1%，得率為是原料重的0. 08%。實施例2一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(I)原料處理將原料單環刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質量的0. 8%，在43°C水浴條件下酶解6h，酶解液煮沸滅酶后，8000r/min離心IOmin,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過相對分子質量I萬的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對分子質量I萬以下和相對分子質量I萬以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質將所述相對分子質量I萬以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3，先用HCl水溶液調pH至2. O，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調pH至7. O，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質量濃度為3%，離心除去蛋白質沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 75%，于4°C條件下靜置24小時，7000r/min離心13min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌3次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質量濃度為1%，加到填料為DEAE-52纖維素的陰離子交換柱中，先用pH = 5. O乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強)濃縮至洗脫液體積的1/3、 透析、再濃縮至透析后液體積的1/3 ；④凝膠過濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過濾柱，進一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/4，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；
(5)抗菌肽制備將所述相對分子量I萬以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/2，上樣于S印hadexG-100凝膠過濾柱，用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/2,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過濾柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/5，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過檢驗，制備的糖胺聚糖純度達92. 8%，得率為是原料重的0. 28%;抗菌肽純度達92. 5%，得率為是原料重的0. 07%。實施例3一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(I)原料處理將原料單環刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質量的0. 9%，在45°C水浴條件下酶解5h，酶解液煮沸滅酶后，5000r/min離心15min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過相對分子質量I萬的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對分子質量I萬以下和相對分子質量I萬以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質將所述相對分子質量I萬以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/4，先用HCl水溶液調pH至2. 0，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調pH至7. 0，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質量濃度為4%，離心除去蛋白質沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 80%，于4°C條件下靜置20小時，5000r/min離心15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌2次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質量濃度為2%，加到填料為Q-Sepharose Fast Flow的陰離子交換柱中，先用pH = 5. 3乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強)濃縮至洗脫液體積的1/2、透析、再濃縮至透析后液體積的1/3 ；④凝膠過濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過濾柱，進一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/5，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對分子量I萬以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3,上樣于SephadexG-IOO凝膠過濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/3,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過濾柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過檢驗，制備的糖胺聚糖純度達94. 8%，得率為是原料重的0. 31%;抗菌肽純度達91. 8%，得率為是原料重的0. 059%。實施例4一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟
(1)原料處理將原料單環刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質量的1%，在47°C水浴條件下酶解4h，酶解液煮沸滅酶后，6000r/min離心 13min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過相對分子質量I萬的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對分子質量I萬以下和相對分子質量I萬以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質將所述相對分子質量I萬以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/4，先用HCl水溶液調pH至2. 0，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調pH至7. 0，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質量濃度為5%，離心除去蛋白質沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 70%，于4°C條件下靜置28小時，8000r/min離心lOmin，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌4次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質量濃度為3%，加到填料為Q-Sepharose Fast Flow的陰離子交換柱中，先用pH = 5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強)濃縮至洗脫液體積的1/4、透析、再濃縮至透析后液體積的1/4 ；④凝膠過濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S印hadexG-100凝膠過濾柱，進一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/6，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對分子量I萬以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/4,上樣于SephadexG-IOO凝膠過濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/3,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過濾柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/6，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過檢驗，制備的糖胺聚糖純度達94. 3%，得率為是原料重的0. 29%;抗菌肽純度達93. 4%，得率為是原料重的0. 071 %。實施例5單環刺縊糖胺聚糖抗凝血I材料與方法I. I實驗材料實驗動物選用新西蘭白兔，糖胺聚糖(GAG)來自單環刺縊(實施例I制備)。實驗儀器=LG-PABER型凝血因子分析儀。I. 2實驗方法采用體外實驗法。(I)凝血酶原時間(PT)和凝血酶時間(TT)的測定新西蘭白兔，戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，3. 8%枸櫞酸鈉抗凝(I 9)，混勻后以 3000r/min,離心15min,取上清,分離出貧血小板血衆(PPP),取PPP 100 U I,加入糖胺聚糖 10 u I,預溫5min后加入預溫15min的PT和TT試劑,用血小板聚集凝血因子分析儀測定凝固時間。(2)活化的部分凝血活酶時間(APTT)的測定
上面的方法分離出貧血小板血漿(PPP)，取PPP lOOiU，加入IOiU糖胺聚糖和 IOOu I APTT試劑，預溫5min后加入預溫15min的CaC12100 yl，用血小板聚集凝血因子分析儀測定凝固時間。2結果與分析實驗設生理鹽水為空白對照，0. 005mg/ml和0. 01mg/ml的肝素鈉做陽性對照， 糖胺聚糖設置以肝素的最大濃度為起始濃度，0. 01mg/ml、0. 2mg/ml、0. 4mg/ml、0. 6mg/ml、
0.8mg /ml五個濃度組,進行體外抗凝血試驗,結果見圖1、2、3，從三個圖看出，單環刺婦糖胺聚糖能明顯延長PT和APTT，作用稍弱于肝素，對于TT也有一定的的延長作用。實施例6單環刺縊抗菌肽的抗菌活性I實驗方法采用牛津杯法。副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌的濃度為2. 3 X 106CfU/ml，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的濃度為I. 2X106cfu/ml,向每個牛津杯中加入200 U I抗菌肽(實施例 I制備)，以青霉素做陽性對照，滅菌水做陰性對照，4°C靜置24h后轉入恒溫培養箱，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌37°C培養24h，副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌30°C培養24h，培養后用游標卡尺測定抑菌圈直徑，并根據其直徑大小判斷抑菌活性的強弱。2實驗結果結果見圖4，從圖4看出，抗菌肽對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌活性，其中對副溶血弧菌抑菌活性最強，對嗜水氣單胞菌次之，對金黃色葡萄球菌抑菌活性最弱。
權利要求
1.一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征是包括如下步驟(1)原料處理將原料單環刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，在43°C_47°C水浴條件下酶解 4_6h,酶解液煮沸滅酶后,5000r-8000r/min離心10min-15min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過相對分子質量I萬的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對分子質量I萬以下和相對分子質量I萬以上的兩種組分的液體； (4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質將所述相對分子質量I萬以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3-1/4，先用HCl水溶液調pH至2. O，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調pH至7. 0， 離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質量濃度為3% -5%，離心除去蛋白質沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 70% -80%，于 4°C條件下靜置 20-28 小時，5000r-8000r/min 離心 10min_15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌2-4次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質量濃度為1%_3%，力口到陰離子交換柱中，先用pH = 5. 0-5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液濃縮至洗脫液體積的1/2-1/4、透析、再濃縮至透析后液體積的 1/3-1/4 ；④凝膠過濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于SephadexG-IOO凝膠過濾柱,進一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對分子量I萬以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/2-1/4,上樣于SephadexG-IOO凝膠過濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/2-1/3，濃縮液上樣于S印hadexG-25凝膠過濾柱，0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。
2.根據權利要求I所述的一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述步驟(2)中枯草桿菌中性蛋白酶的添加量為所述勻漿液質量的0.8%-1%。
3.根據權利要求I所述的一種同時制備單環刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述陰離子交換柱的填料為DEAE-52纖維素或Q-Sepharose Fast Flow。
全文摘要
本發明公開了一種同時制備單環刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(1)原料處理將原料單環刺螠制成勻漿液；(2)酶解；(3)超濾；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質；②醇沉、洗滌；③陰離子交換柱層析；④凝膠過濾層析得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備。本發明的方法反應條件溫和、制備過程綠色環保節能，產品附加值高；制備的糖胺聚糖和抗菌肽純度高；可大量回收蛋白質，有利于單環刺螠的綜合利用，所制備的糖胺聚糖具有明顯的抗凝血、清除自由基的效果，制備的抗菌肽對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等具有明顯的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽還可為海珍動物養殖業提供優良的免疫增強劑和新型抗菌藥物。
文檔編號C07K1/16GK102618614SQ20121010962
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者劉萍, 崔青曼, 袁春營, 韓旭 申請人:天津高蜚生物科技發展有限公司