專利名稱：：補骨脂提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及補骨脂提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。技術背景肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥"殺手"，常見于中年男性。因其惡性度高、病情進展快，病人早期一般沒有什么不適，但一旦出現癥狀就診，就已經屬于中晚期。故肝癌的治療難度大，一般患者發病后生存時間僅為6個月，人稱"癌中之王"。從植物中尋找高效低毒的抗癌藥物，在國內外均為抗癌藥物研究的重點。有效的抗癌化合物和中草藥有效部位的抗癌復方制劑都具有重要的臨床價值。補骨脂尸sora7esco/yJi'/bJi'alinn.系豆科補骨脂屬一年生直立草本植物，在我國分布廣泛。據《中國植物志》記載，補骨脂以種子入藥，有補腎壯陽、健脾健胃之功能，并可治牛皮癬等皮膚病，越南用其酒精浸出液治療風濕病。對補骨脂的研究，國內外一般集中在治療白癜風、銀屑病等皮膚病，對心血管系統的影響，抗菌作用等。
發明內容本發明的目的是提供補骨脂提取物的一種新用途。本發明所提供的補骨脂提取物的新用途是補骨脂提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用；所述補骨脂提取物用包括如下步驟的方法制備用水和/或有機溶劑作為提取劑，從補骨脂種子中提取得到補骨脂提取物。其中，所述有機溶劑具體可為甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲垸、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯；所述提取劑具體可為體積百分含量為95%的乙醇水溶液。所述提取可為回流提取。在所述提取中，提取溫度可為60-100。C;可提取1次、2次或3次；每次提取的時間可為1-4小時。所述補骨脂提取物的制備方法還包括如下步驟將所得到的補骨脂提取物，用石油醚進行萃取，收集石油醚層，得到補骨脂提取物A部分。用氯仿進行萃取，收集氯仿層，得到補骨脂提取物B部分。所述補骨脂提取物的制備方法還包括如下步驟將所述氯仿萃取得到的水相用乙酸乙酯進行萃取，收集乙酸乙酯層，得到補骨脂提取物C部分。在如上任一所述中，所述腫瘤具體可為肝癌。根據如上應用方法所制備的預防和/或治療腫瘤藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質混合或包裹后導入機體。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。如上制備的預防和/或治療腫瘤藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。上述預防和/或治療腫瘤藥物的用量一般為200-800mg補骨脂提取物/kg體重/天，療程為12至15天。本發明通過實驗證明，補骨脂總提取物能夠有效的抑制人肝癌細胞的生長，并且證明補骨脂總提取物的濃度為25ug/mL時抑制效果最好，抑制率可達96%，補骨脂總提取物在濃度低于25ug/mL時，隨著其濃度的增大，抑制率逐漸增大；補骨脂總提取物在濃度高于25ug/mL時，隨著其濃度的增大，抑制率逐漸降低。萃取得到的各部分補骨脂提取物的肝癌細胞生長抑制率依次是補骨脂A部分〉補骨脂C部分〉補骨脂B部分。因此本發明所提供的補骨脂提取物的新用途，對制備抗腫瘤藥物，尤其是抗肝癌藥物具有重要的意義。具體實施方式實施例1、補骨脂尸《^/^00;/^^11皿.提取物的制備及應用一、補骨脂Aora/eacoo^/o"fllinn.提取物的制備取補骨脂種子(北京同仁堂股份有限公司)200g，將其以l:3(補骨脂種子95%乙醇)的重量份數比與95%乙醇(乙醇水=95:5，體積比)混合，6(TC回流提取3次，每次回流提取時間為3h;將所得的提取液進行真空減壓濃縮、真空干燥(去除乙醇和水)至恒重，得到13.5g補骨脂總提取物。取上述制備的補骨脂總提取物10g，將其溶于200ml水，然后用200ml石油醚進行萃取，萃取三次，將三次收集的石油醚層合并，減壓濃縮、真空干燥(去除石油醚)至恒重，即得到補骨脂A部分，收集剩余的水相，記作水相a;再將水相a用200ml氯仿進行萃取，萃取三次，將三次收集的氯仿層合并，減壓濃縮、真空干燥(去除氯仿)至恒重，即得到補骨脂B部分，同時收集水相，記作水相b;將水相b用200ml乙酸乙酯進行萃取，萃取三次，將三次收集的乙酸乙酯層合并，減壓濃縮、真空干燥(去除乙酸乙酯)至恒重，即得到補骨脂C部分，同時收集水相，記作水相c;將水相c用200ml正丁醇進行萃取，萃取三次，將三次收集的正丁醇層合并，減壓濃縮、真空干燥(去除正丁醇)至恒重,即得到補骨脂D部分，同時收集水相，水相即為補骨脂E部分。二、補骨脂提取物在抑制肝癌細胞生長中的應用將對數生長的肝癌細胞HepG-2用0.25。/。的胰蛋白酶消化，然后用含10%(體積百分含量)胎牛血清的DMEM完全培養液制成細胞懸液，將肝癌細胞稀釋至1.0xl()S個/mL，再將其接種至96孔培養板中，每孔200uL，于37。C，5%C02的培養箱內培養24h;然后傾去各孔培養液。將補骨脂總提取物和補骨脂A、B、C、D和E部分分別溶解于DMSO中，用DMEM完全培養液稀釋成需要濃度，補骨脂總提取物濃度分別為12.5、25、50、100、200ug/mL和補骨脂A、B、C、D和E部分濃度均為50ug/mL，其中，DMSO含量為10%(體積百分含量)；將不同濃度的各提取物依次分別加入上述肝癌細胞的培養孔內，各自接種5個孔，每孔加入200ul;對照組為向上述肝癌細胞的培養孔內加入含10%(體積百分含量)DMSO的DMEM完全培養液至孔內體積200ul，也接種5個孔；空白組為向不含肝癌細胞的空培養孔內加入200ul的DMEM完全培養液；將其置于37"，5%(:02的培養箱內培養2天。2天后每孔加入20ul新鮮配制的5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，37°C，5y。C02繼續培養4h。小心棄上清，每孔加入200uLDMSO，室溫放置15-20min，每5min振蕩一次。在酶標儀上測定波長490nm處的光密度值(OD值)，按公式計算肝癌細胞生長抑制率。抑制率(％)=1-(OD實驗-OD空自)/(OD對照-OD空白)x100%。實驗設三次重復。不同濃度補骨脂總提取物對人肝癌細胞HepG-2的抑制作用的結果見表1。補骨脂A、B、C、D和E部分對人肝癌細胞HepG-2的抑制作用的結果見表2。表1、不同濃度補骨脂總提取物對人肝癌細胞HepG-2的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>補骨脂總提取物的實驗結果表明(表l)，補骨脂總提取物在濃度為25ug/mL時對人肝癌細胞HepG-2有最高的抑制作用，濃度低于25ug/mL或高于25ug/mL時對肝癌細胞HepG-2的抑制率都有所下降，且在濃度高達200ug/mL時，對肝癌細胞HepG-2不但沒有抑制作用還有增加肝癌細胞生長的情況。因此，補骨脂總提取物在濃度低于25ug/mL時，隨著其濃度的增大，抑制率逐漸增大；補骨脂總提取物在濃度高于25ug/mL時，隨著其濃度的增大，抑制率逐漸降低。總結而言，在濃度低于25ug/mL時補骨脂總提取物對肝癌細胞HepG-2的抑制作用與其濃度呈正相關，在濃度高于25ug/mL時補骨脂總提取物對肝癌細胞HepG-2的抑制作用與其濃度呈負相關。實驗得到了補骨脂總提取物對人肝癌細胞HepG-2抑制率達到最高時的濃度值為25ug/mL。補骨脂A、B、C、D和E部分的抑制實驗結果表明(表2)，石油醚萃取段(補骨脂A部分)、氯仿萃取段(補骨脂B部分)和乙酸乙酯萃取段(補骨脂C部分)對人肝癌細胞HepG-2均有顯著的生長抑制作用，而正丁醇萃取段(補骨脂D部分)對人肝癌細胞HepG-2的抑制作用不明顯，水段(補骨脂E部分)對人肝癌細胞HepG-2還有增加其生長作用。MTT實驗結果表明，補骨脂中抑制肝癌細胞的活性成分主要集中在石油醚萃取段(補骨脂A部分)、氯仿萃取段(補骨脂B部分)和乙酸乙酯萃取段(補骨脂C部分)，即非極性部分(石油醚部分)和中等極性部分(氯仿、乙酸乙酯部分)，且非極性部分生物活性最高，而極性部分即正丁醇萃取段(補骨脂D部分)和水段(補骨脂E部分)活性很低甚至沒有生物活性。綜上生物活性實驗表明，補骨脂總提取物、石油醚萃取段(補骨脂A部分)、氯仿萃取段(補骨脂B部分)、乙酸乙酯萃取段(補骨脂C部分)對人的肝癌細胞均具有很好的抑制作用。權利要求1、補骨脂提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用；所述補骨脂提取物用包括如下步驟的方法制備用水和/或有機溶劑作為提取劑，從補骨脂種子中提取得到補骨脂提取物。2、根據權利要求l所述的應用，其特征在于所述有機溶劑為甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯；所述提取劑為體積百分含量為95%的乙醇水溶液。3、根據權利要求l所述的應用，其特征在于所述提取為回流提取。4、根據權利要求l、2或3所述的應用，其特征在于所述提取的溫度為60-IO(TC。5、根據權利要求1、2或3所述的應用，其特征在于所述提取中，提取1次、2次或3次。6、根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述提取中，每次提取的時間為1-4小時。7、根據權利要求l、2或3所述的應用，其特征在于所述補骨脂提取物的制備方法還包括如下步驟將所得到的補骨脂提取物，用石油醚進行萃取，收集石油醚層，得到補骨脂提取物。8、根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述補骨脂提取物的制備方法還包括如下步驟將所述石油醚萃取得到的水相用氯仿進行萃取，收集氯仿層，得到補骨脂提取物。9、根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述補骨脂提取物的制備方法還包括如下步驟將所述氯仿萃取得到的水相用乙酸乙酯進行萃取，收集乙酸乙酯層，得到補骨脂提取物。10、根據權利要求1至9中任一所述的應用，其特征在于所述腫瘤為肝癌。全文摘要本發明公開了補骨脂提取物的一種新用途，特別涉及補骨脂提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述提取物是用包括如下步驟的方法制備的用水和/或有機溶劑作為提取劑，從補骨脂種子中提取得到補骨脂提取物。本發明所提供的補骨脂提取物的新用途，對制備抗腫瘤藥物，尤其是抗肝癌藥物具有重要的意義。文檔編號A61P31/00GK101229223SQ20081005756公開日2008年7月30日申請日期2008年2月3日優先權日2008年2月3日發明者巖劉,唐亞林,瑋戴,莉譚申請人:中國科學院化學研究所